Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
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Agradecemos su inestimable colaboración en el establecimiento de ensayos OPKA en nuestro laboratorio Dr. Moon Nahm (Universidad de Alabama Birmingham). Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1R01AI123383-01A1 a FYA.

1. la cultura, la diferenciación y la validación de las células HL-60

<ol><li>Preparar medios de cultivo de células HL-60 compuesto por 500 mL RPMI con L-glutamina y 50 mL inactivadas por calor suero bovino fetal. No agregue antibióticos ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.</li>
	<li>Para la propagación y mantenimiento de las células HL-60, cultura 5 x 106 células en 10 mL de medio de cultivo celular HL-60 75 cm2 ventilación frascos a 37 º C y 5% CO...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas ...

Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, células inmunes y experimental tratamientos. Estudios anteriores han demostrado que OPKAs pueden ser modificados y utilizados para una variedad de bacterias y serotipos, incluyendo Streptococcus pneumoniae1,2de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa3. Además, estos ensayos optimizados pueden utilizarse para evaluar distintos tratamientos experimentales, incluyendo la capacidad de una enzima para que la bacteria sea más accesible a los tratamientos4 y anticuerpo complemento-mediada de las células inmunes para mejorar opsonización5. Clásico, ensayo OPKA se ha utilizado con éxito en investigación básica y clínica ajustes como un indicador de gran alcance para la protección inducida por anticuerpos patógenos específicos6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células inmunes pueden usarse para evaluación de opsonofagocítico matar. Una población fagocítica comúnmente utilizada es la línea de células leucémicas humanas HL-60. Esta línea celular se puede mantener como promyelocytes inactivada en la cultura; sin embargo, puede ser distinguidos en varios Estados activados a través de diferentes drogas tratamientos10,11. Tratamiento de HL60 con N, N-dimetilformamida distingue la línea celular en neutrófilos activados con fuerte actividad fagocítica11. Mientras que las células HL-60 se han optimizado y se utilizan con frecuencia para estos ensayos de fagocitosis10, pueden utilizarse otros leucocitos polimorfonucleares primarios como el brazo inmune del experimento12.
Además, estos ensayos pueden ser simplificado13 o multiplexado14 mirar varias cepas resistentes a los antibióticos de la bacteria a probar. El método de multiplexado se ha hecho más factible a través del desarrollo de software que puede contar eficientemente Colonia bacteriana formando unidades (UFC) por spot en una placa de agar15. Aquí, describimos un método racionalizado usando una cepa bacteriana, las células HL-60, complemento de conejo bebé y placas de agar sangre. Con este método, varios tratamientos pueden ser evaluados rápidamente para hacer frente a preguntas de investigación específicas sobre cómo se pueden modular la respuesta inmune innata a la infección bacteriana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.

Validación de la diferenciación de la HL-60 se debe realizar antes de comenzar la OPKA. Esto puede lograrse mediante citometría de flujo para determinar la expresión extracelular de CD11b, CD35, CD71 y anexina V (figura 1). Yoduro de propidio también puede utilizarse como un marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante 3 días, se debe aumentar la expresión de CD35 (≥55% de todas las células) y disminución de expresión de CD71 (≤20% de todas las células). El ...

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Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Este ensayo vincula la modulación de la estructura bacteriana y la función a la actividad antibacteriana basada en células inmunitarias. Como tal, se puede evaluar una inmunoterapéutica clave de un tratamiento potencial para determinar la probabilidad de un aclaramiento bacteriano mejorado. El ensayo de matanza opsonofofática tradicionalmente sirve como el estándar de oro para evaluar las funciones efectivas de los anticuerpos levantados contra la bacteria como obsonantes.Este protocolo ofrece simplicidad y versatilidad sobre los ensayos estandarizados de alto rendimiento existentes. En este protocolo, investigamos los efectos de un tratamiento farmacológico sobre la neumonía por estreptococos y cómo estos efectos se traducen en una mejor fagocitosis de la bacteria. Aquí, aplicamos el OPKA a las células de la neumonía por estreptococos.Sin embargo, este protocolo se puede adoptar para evaluar la matanza fagocítica de otros patógenos por las células inmunitarias. Dedique tiempo a optimizar las existencias bacterianas y asegúrese de que las UFC finales a contar estén dentro del rango óptimo. Recomendamos encarecidamente el uso de citometría de flujo para garantizar que las células HL60 sean viables y activas y que intenten diferentes condiciones de cultivo para garantizar células funcionalmente activas.La demostración visual dará una mejor comprensión de cómo se debe planchar la muestra y cómo lograr muestras contables. Para empezar, preparar medios de cultivo celular HL60 compuestos por 500 mililitros RPMI complementados con L-glutamina y 15 mililitros calor inactivado suero bovino fetal. Para la propagación y mantenimiento de células HL60, cultivo de cinco millones de células en 10 mililitros de medios de cultivo celular HL60 en matraces ventilados de 75 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.Para generar reservas de trabajo de células HL60, añadir aproximadamente un millón de células por mililitro en medios de cultivo HL60 complementados con 10%dimetil sulfóxido en tubos criogénicos de un mililitro. Para diferenciar las células HL60, el cultivo 1,5 veces 10 a las siete células en 15 mililitros de medios de cultivo celular HL60 complementado con 0,6% DMF en un filtro estéril con un filtro estéril de 75 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono durante tres días antes de OPKA. Para preparar las muestras de stock bacteriano, haga crecer la cepa bacteriana WU2 en un caldo apropiado durante aproximadamente dos a cuatro horas a 37 grados centígrados.A continuación, pelecifa las bacterias por centrifugación a seis mil veces G durante dos minutos y resuspendir las células en 10 a 30 mililitros de 15% de glicerol en el caldo apropiado. Aliquot el cultivo de bacterias en tubos estériles de centrífuga de 1,5 mililitros y almacenar a 80 grados centígrados. A continuación, descongelar un vial de stock bacteriano en un baño de agua de 37 grados centígrados.Pelecilar las células bacterianas y resuspender en 500 microlitros de OBB en condiciones estériles. Diluciones de placas del stock bacteriano no tratado en placas de agar de sangre y cultivar las placas durante la noche a 30 grados centígrados. Después del paso de incubación, cuente las colonias para cada dilución de la población bacteriana no tratada co-cultivada con células HL60.Registro de qué dilución de bacterias produce el número óptimo de colonias contabibles para futuros OPKAs con este stock bacteriano. Descongelar un tubo de stock bacteriano. Bacterias del pellet a seis mil veces G durante dos minutos y resuspend el pellet celular en OBB en la dilución óptima obtenida en el paso anterior.Pipetear 10 microlitros de la dilución bacteriana resuspendida por pozo en una placa redonda de cultivo celular de 96 pozos. A continuación, agregue 20 microlitros de un anticuerpo adecuado o un tratamiento farmacológico a cada pozo experimental por duplicado. Para pozos de control, utilice 1XPBS u OBB dependiendo del tampón utilizado para los pozos de tratamiento.Agitar la placa de muestra a aproximadamente 90 rpm a temperatura ambiente durante una hora. Para cosechar las células diferenciadas HL60 que se tratan con DMF tres días antes, pele las células a 500 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con al menos 10 mililitros de 1XPBS.Pele el pelado de las células lavadas a 500 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en OBB. Agregue suero estéril de conejo bebé sin diluir a un volumen final de uno a cinco.Después de un cultivo bacteriano de una hora, divida cada muestra en pozos duplicados para dos grupos. A continuación, añadir 50 microlitros de la mezcla de complemento HL60 a cada conjunto experimental de pozos y 50 microlitros de OBB a los pozos de bacterias solamente. Agitar la placa de 96 pozos a 37 grados centígrados durante una hora.Para las muestras de placas, diluir cada pozo con OBB a un volumen final de uno a cinco para que cada muestra tenga un volumen de al menos 50 microlitros. A continuación, pipetear 50 microlitros de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, asegurando un espacio adecuado entre las muestras. Cubra y deje que las muestras se sequen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.Invertir las placas y el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados. Alternativamente, placas de cultivo en frascos anaeróbicos para probar si las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o para controlar la morfología. Después del cultivo nocturno, cuente las colonias en cada área de muestra designada y proceda al análisis de datos comparando el número de celdas vivas en cada conjunto con los controles correspondientes.Los aspectos más difíciles de establecer esta técnica por primera vez probablemente serán la optimización de las UFC iniciales de la población bacteriana, así como asegurar que las células HL60 se diferencien efectivamente. Antes de iniciar el OPKA, la diferenciación de HL60 se validó utilizando citometría de flujo con yoduro propidio como marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante tres días, la expresión de CD35 se incrementó y la expresión de CD71 disminuyó.Los porcentajes medios de UFC bacterianas en los grupos tratados con HL60 en comparación con los grupos tratados no HL60 correspondientes se utilizaron para comparar la supervivencia celular bacteriana de diferentes tratamientos. Los resultados mostraron que con un tratamiento eficaz, el número de colonias era diferente entre el co-cultivo hl0 y ninguna célula HL60, indicativo de la fagocitosis más eficiente. Los resultados mostraron que cuando la dilución bacteriana no se optimizó o el crecimiento de la colonia no se observó cuidadosamente después del chapado, el crecimiento excesivo de las colonias podría evitar el recuento preciso de colonias.Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es controlar cuidadosamente la incubación bacteriana para evitar el crecimiento excesivo de las UFC. Los ensayos in vivo se pueden utilizar para obtener un aclaramiento bacteriano efectivo dentro de un huésped. Estos ensayos se pueden utilizar para confirmar que la eficacia inmune observada con el OPKA es traducible a modelos humanos o animales.El ensayo de matanza opsonophagotic se ha utilizado con gran efecto en estudios de investigación significativos anteriores para vincular terapias antibacterianas con las respuestas inmunitarias fagosticas. Trabajar con patógenos bacterianos puede ser peligroso. Por favor, use equipo personal de protección en todo momento durante este ensayo.

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'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...