Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Vi tackar Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) för hans ovärderliga stöd i upprättandet av OPKA analyser i vårt laboratorium. Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa Grant 1R01AI123383-01A1 att FYA.

1. kultur, differentiering och validering av HL-60 celler

<ol><li>Förbereda HL-60 cell kulturmassmedia består av 500 mL RPMI med L-glutamin och 50 mL Värmeinaktiverade fetalt bovint serum. Lägg inte antibiotika eftersom detta kan påverka differentiering av HL-60 cellerna.</li>
	<li>För förökning/underhåll av HL-60 celler ventilerade kultur 5 x 106 celler i 10 mL av HL-60 cell kultur media i 75 cm2 kolvar på 37 ° C och 5% CO2. Passagen celler var 3,4 dagar för att upp...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs tjäna viktiga roller vid bedömningen av antikropp medierad immunsvar induceras av vaccinationer6,8. Den huvudsakliga betydelsen av denna förenklade OPKA är anpassningsförmåga i de villkor som ska testas (dvs, antikroppar, enzym behandlingar, etc.). I denna mening, medan denna analys kan användas för att testa bidrag opsonins (dvs antikroppar) i fagocytos, kan det också användas för att bedöma olika sätt att övervinna virulensfaktorer (dvs kaps...

Den lägre döda assay (OPKA) är ett kritiskt verktyg för att länka förändringar i bakteriell struktur eller funktion till efterföljande förändringar i immunförsvaret och funktion. Som sådan, används det ofta som en kompletterande analys för att bestämma immun-baserade effekten av antikropp behandlingar, vaccinkandidater, enzym optimering, etc. Medan Invivo analyser är nödvändigt att fastställa effektiva clearance eller skydd i en bakteriell infektion modell, OPKA kan användas för att bedöma immun bidrag till bakteriell celldöd på den mest grundläggande komponenter: bakterier, immunceller, och experimentella behandlingar. Tidigare studier har visat att OPKAs kan ändras och används för en mängd bakterier och serotyper, inklusive Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Dessutom kan dessa optimerade analyser användas för att bedöma olika experimentella behandlingar, inklusive möjligheten av ett enzym att göra bakterien mer tillgänglig för komplement-medierad immunceller4 och antikropp behandlingar för att förbättra Opsonization5. Klassiskt, OPKA assay har använts framgångsrikt i basal och klinisk forskning inställningar som en kraftfull indikator för skydd induceras av patogen-specifika antikroppar6,7,8,9 .
Olika typer av immunceller kan användas för bedömning av lägre dödande. En vanligt förekommande fagocytos befolkning är HL-60 mänsklig leukemic cell linjen. Denna cellinje kan hållas som inaktiverade promyelocyter i kultur; de kan dock skiljas in olika aktiverade staterna via olika läkemedel behandlingar10,11. Behandling av HL60 med N, N-dimetylformamid gör åtskillnad mellan den cellen fodrar in aktiverade neutrofiler med stark fagocytisk aktivitet11. HL-60 celler har optimerats och används ofta för dessa fagocytos analyser10, kan andra primära polymorfonukleära leukocyter användas som experiment12immun arm.
Dessutom dessa analyser kan vara förenklade13 eller multiplexed14 att titta på flera antibiotikaresistenta stammar av bakterier som ska testas. Metoden multiplexade har gjorts mer genomförbart genom utveckling av programvara som effektivt kan räkna bakteriell kolonibildande enheter (CFUs) per plats på en agar tallrik15. Här beskriver vi en strömlinjeformad metod där en bakteriestam, HL-60 celler, baby kanin komplement och blod agarplattor. Med den här metoden kan flera behandlingar bedömas snabbt för att lösa specifika forskningsfrågor på hur medfödda immunsvaret mot bakterieinfektion kan anpassas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

En viktig aspekt av immunsvaret mot bakteriell kolonisering av värden är fagocytos. Ett lägre dödande test (OPKA) är en experimentell förfarande där Fagocytos celler är samtidig odlade med bakteriell enheter. Immuncellerna kommer phagocytose och döda bakteriekulturerna i en Komplementberoende sätt. Effektiviteten i immunmedierade cell dödandet är beroende av ett antal faktorer och kan användas för att avgöra hur olika bakteriella kulturer jämföra när det gäller motstånd mot celldöd. På detta sätt kan effekten av potentiella immun-baserade therapeutics bedömas mot specifika bakteriestammar och/eller serotyper. I detta protokoll beskriver vi en förenklad OPKA som använder grundläggande odlingsbetingelser och cell inventering för att bestämma bakteriell cellernas viabilitet efter samtidig kultur med behandling villkor och HL-60 immunceller. Denna metod har använts framgångsrikt med ett antal olika pneumokock serotyper, kapsulära och acapsular stammar och andra bakteriearter. Fördelarna med detta OPKA protokoll är dess enkelhet, mångsidighet (som denna analys inte är begränsat till antikropp behandlingar som opsonins), och minimering av tid och reagenser till bedöma grundläggande experimentella grupper.

Validering av HL-60 differentiering bör utföras innan OPKA. Detta kan åstadkommas med flödescytometri för att avgöra det extracellulära uttrycket för CD11b, CD35, CD71 och annexin V (figur 1). Propidium jodid kan också användas som livskraft markör. Efter behandlas med DMF för 3 dagar, uttryck av CD35 bör ökas (≥55% av alla celler) och uttryck för CD71 minskas (≤20% av alla celler). Procentandelen av annexin V + och propidium jodid (PI +) celler grupp bör vara < 35% att s...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Denna lägre dödande analys används för att jämföra förmågan hos fagocytos immunceller för att svara på och döda bakterier baserat på olika behandlingar och/eller villkor. Klassiskt, serverar denna analys som den gyllene standarden för att bedöma effektor funktioner av antikroppar mot en bakterie som opsonin.

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Denna analys länkar modulering av bakteriell struktur och funktion till immuncell baserad antibakteriell aktivitet. Som sådan kan en viktig immunterapeutisk av en potentiell behandling bedömas vid fastställandet av sannolikheten för förbättrad bakteriell clearance. Opsonophagocytic dödande assay traditionellt fungerar som guldmyntfoten för att bedöma effektiva funktioner av antikroppar upp mot bakterien som obsonant.Detta protokoll erbjuder enkelhet och mångsidighet över befintliga höga genomströmning standardiserade analyser. I detta protokoll undersöker vi effekterna av en läkemedelsbehandling på streptokocker lunginflammation och hur dessa effekter översätta till förbättrad fagocytos av bakterien. Här tillämpar vi OPKA på streptokocker lunginflammation celler.Men detta protokoll kan antas för att bedöma fagocytic dödande av andra patogener av immunceller. Ägna tid för att optimera de bakteriella bestånden och säkerställa den slutliga CFUs som skall räknas faller inom optimalt intervall. Vi rekommenderar starkt att använda flödescytometri för att säkerställa HL60 celler är livskraftiga och aktiva och försöker olika odlingsförhållanden för att säkerställa funktionellt aktiva celler.Visuell demonstration kommer att ge en bättre förståelse för hur provet ska pläterades och hur man uppnår uppräkningsbara prover. Till att börja med förbereda HL60 cell kultur media består av 500 milliliter RPMI kompletteras med L-glutamin och 15 milliliter värme inaktiverade fetala nötkreatur serum. För förökning och underhåll av HL60 celler, odla fem miljoner celler i 10 milliliter av HL60 cellodling media i 75 kvadratcentimeter ventilerade kolvar vid 37 grader celsius och fem procent koldioxid.För att generera fungerande lager av HL60 celler, tillsätt cirka en miljon celler per milliliter i HL60 kultur media kompletteras med 10%dimetylsulfoxid i en milliliter kryogena rör. För att differentiera HL60 celler, kultur 1,5 gånger 10 till de sju cellerna i 15 milliliter av HL60 cell odling media kompletteras med 0,6%DMF i sterilt filter som utjämnas 75 kvadratiska centimeter kolvar vid 37 grader celsius och 5%koldioxid under tre dagar före OPKA. För att förbereda bakteriestamproverna, odla WU2 bakteriestammen i en lämplig buljong i cirka två till fyra timmar vid 37 grader celsius.Därefter pelleta bakterierna genom centrifugeringen vid sex tusen gånger G i två minuter och återanvänd cellerna i 10 till 30 milliliter av 15%glycerol i lämplig buljong. Aliquot bakterierkulturen i sterila 1,5 milliliter centrifugrör och förvara på 80 grader celsius. Nästa, tina upp en flaska bakteriell lager i en 37 graders celsius vattenbad.Pellet bakteriecellerna och resuspend i 500 mikroliter av OBB under sterila förhållanden. Plåtutspädningar av den obehandlade bakteriestam på blodagarplattor och kultur plattorna över natten vid 30 grader celsius. Efter inkuberingssteget, räkna kolonierna för varje spädning av obehandlad bakteriestam co-odlade med HL60 celler.Registrera vilken utspädning av bakterier som ger det optimala antalet upprjänbara kolonier för framtida OPKA med detta bakterielager. Tina ett rör av bakteriestam. Pelletbakterier vid sextusen gånger G i två minuter och resuspend cellpelletsen i OBB vid den optimala spädning som erhållits i föregående steg.Pipett 10 mikroliter av den återanvända bakterieutspädningen per brunn i en rund botten 96 väl cellodlingsplatta. Tillsätt sedan 20 mikroliter av en lämplig antikropp eller en läkemedelsbehandling till varje experimentell brunn i två exemplar. För kontroll brunnar, använd 1XPBS eller OBB beroende på buffert som används för behandlingsvälnarna.Skaka provplattan i ungefär 90 varv/min i rumstemperatur i en timme. För att skörda de HL60 differentierade celler som behandlas med DMF tre dagar före, pellet cellerna på 500 gånger G i tre minuter. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med minst 10 milliliter 1XPBS.Pellet de tvättade cellerna vid 500 gånger G i tre minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i OBB. Tillsätt sterilt outspädd baby kanin serum på en en till fem slutlig volym.Efter en en timmes bakteriekultur, dela upp varje prov i dubbla brunnar för två grupper. Därefter lägger du till 50 mikroliter av HL60-komplementblandningen till varje experimentell uppsättning brunnar och 50 mikroliter av OBB till endast bakteriernas brunnar. Skaka 96 brunnsplattan vid 37 grader varmt i en timme.För att platta prover, späd varje brunn med OBB vid en en till fem slutlig volym så att varje prov har en volym på minst 50 mikroliter. Därefter pipettera 50 mikroliter av varje prov direkt på ett anvisat område av en bakteriekulturplatta, vilket garanterar adekvat avstånd mellan proverna. Täck över och låt proverna torka i cirka 15 minuter i rumstemperatur.Invertera plattorna och kulturen över natten vid 30 grader celsius. Alternativt odlingsplattor i anaeroba burkar för att testa om anoxiska förhållanden påverkar bakterietillväxten eller för att kontrollera för morfologi. Efter övernattningskulturen, räkna kolonierna i varje anvisat provområde och fortsätt till att analysera data genom att jämföra antalet levande celler i varje uppsättning med motsvarande kontroller.De svåraste aspekterna av att fastställa denna teknik för första gången kommer sannolikt att optimera start CFUs av bakteriestam, samt se till att HL60 cellerna är effektivt differentierade. Innan du startar OPKA, validerades HL60-differentiering med hjälp av flödescytometri med propidium-iodid som en viabilitetsmarkör. Efter att ha behandlats med DMF i tre dagar, var uttryck för CD35 ökade och uttryck för CD71 minskades.De genomsnittliga procentsatserna för bakteriell CFUs i de HL60 behandlade grupperna jämfört med motsvarande icke-HL60-behandlade grupper användes för att jämföra de bakteriella cellernas överlevnad för olika behandlingar. Resultaten visade att med en effektiv behandling var antalet kolonier olika mellan HL60 samkultur och inga HL60-celler, vilket tyder på effektivare fagocytos. Resultaten visade att när bakterieutspädningen inte optimerades eller kolonins tillväxt inte observerades noggrant efter plätering, kunde överväxt av kolonierna förhindra noggrann räkning av kolonier.Det viktigaste att komma ihåg när man försöker detta förfarande är att övervaka bakteriell inkubation noggrant så att undvika överväxt av CFUs. In vivo analyser kan användas för att asses effektiv bakteriell clearance inom en värd. Dessa analyser kan användas för att bekräfta den immuneffekt som observerats med OPKA är översättningsbara till modeller av människor eller djur.Den opsonophagocytic dödande assay har använts med stor effekt i tidigare betydande forskningsstudier att koppla antibakteriella terapier till fagostic immunsvar. Att arbeta med bakteriella patogener kan vara farligt. Vänligen använd skyddande personlig utrustning hela tiden under denna analys.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigenspecifikt In Vivo Killing analysen med CFSE Märkta målceller

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passiv Administrering av monoklonala antikroppar mot H. capsulatum M.fl. svamppatogener

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; Reporter Phage för detektion av kategori A mängden sjukdomsalstrande bakterier

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infektion av zebrafiskembryon med intracellulära mängden sjukdomsalstrande bakterier

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Uppfödning och Injektion av<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larver att bedöma bakteriell Virulens

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Identifiering av sällsynta mängden sjukdomsalstrande bakterier från 16S rRNA Gene sekvensering och MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...