Name: opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) bizim laboratuvar deneyleri OPKA kurulmasında çok değerli onun yardım için teşekkür. Bu eser FYA için Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1R01AI123383-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Kültür, farklılaşma ve HL-60 hücre doğrulama

<ol><li>HL-60 hücre kültür medya 500 mL RPMI L-glutamin ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum ile oluşan hazırlayın. Bu HL-60 hücrelere farklılaşma etkileyebilir gibi antibiyotikler eklemeyin.</li>
	<li>HL-60 hücrelerinin yayılma/bakım için kültür 5 x 106 hücre HL-60 hücre kültür medya 75 cm2 ' deki 10 ml şişe 37 ° C ve % 5 CO2Bacalı. Geçiş hücreleri 3−4 günde optimum hücre konsantrasyonla...

<ol>
	<li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells.">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li><li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus.">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li><li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin.">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li><li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense.">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li><li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection.">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).</li><li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice.">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li><li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection.">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li><li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine.">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li><li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens.">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li><li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies.">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li><li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds.">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li><li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model.">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li><li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonophagocytic+assay.">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20.">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li><li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost,+high-throughput,+automated+counting+of+bacterial+colonies.">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li><li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation.">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).</li><li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents.">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+annexin+V/propidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death.">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).</li><li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells:+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry.">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li><li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352.">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li></ol>

OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yolla...

Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri4 ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla5. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar6,7,8tarafından,9 .
Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite11ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri10için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit12deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.
Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş13 olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için14 multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka15oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:636px;" width="637">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Annexin V (APC conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">640919</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD35, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">333405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">anti-CD71, human (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">334105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:204px;">bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td>
			<td style="width:147px;">Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm)&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">blood agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostic</td>
			<td>A10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fetal Clone serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30080.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HL-60 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">IgG Isotype Control (PE conjugated)</td>
			<td style="width:147px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">N,N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>UN2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">propidium iodide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">RPMI media with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsonophagocytic killing assay to assess immunological responses against bacterial pathogens

Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.

Doğrulama HL-60 farklılaşma OPKA başlamadan önce gerçekleştirilmelidir. Bu hücre dışı ifade CD11b, CD35, CD71 ve annexin V (şekil 1) belirlemek için Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Propidium iyodür bir canlılık marker olarak da kullanılabilir. DMF ile 3 gün sonra tedavi altına, CD35 ifade artırılmalıdır (tüm hücreleri ≥55%) ve CD71 ifade düşmüştür (tüm hücreleri ≤20%). Annexin V + ve propidium iyodür (PI +) hücreleri birlikte yü...

Watch this Scientific Journal Video about Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens at JoVE.com

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Bu test, bakteriyel yapı ve fonksiyonun modülasyonunu bağışıklık hücresi bazlı antibakteriyel aktiviteye bağlar. Bu nedenle, potansiyel bir tedavinin önemli bir immünoterapötik geliştirilmiş bakteriyel açıklık olasılığını belirlemede değerlendirilebilir. Opsonofagositik öldürme sadratiği geleneksel olarak bakteriye karşı yükseltilen antikorların obsonant olarak etkili işlevlerini değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.Bu protokol, mevcut yüksek iş artışı standart testlerinde basitlik ve çok yönlülük sunar. Bu protokolde, bir ilaç tedavisinin streptokok pnömonisi üzerindeki etkilerini ve bu etkilerin bakterinin geliştirilmiş fagositozuna nasıl dönüştüğünü araştırıyoruz. Burada, OPKA'yı streptokok pnömoni hücrelerine uyguluyoruz.Ancak bu protokol, diğer patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından fagositik olarak öldürülmesini değerlendirmek için kabul edilebilir. Bakteri stoklarını optimize etmek ve son CPU'ların sayılması için zaman ayırın optimum aralıkta yer alın. HL60 hücrelerinin canlı ve aktif olmasını sağlamak ve işlevsel olarak aktif hücreleri sağlamak için farklı kültür koşulları denemek için akış sitometrisini kullanmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.Görsel gösteri, numunenin nasıl kaplanacak ve sayılabilir örneklerin nasıl elde edilebildiğini daha iyi anlama sağlayacaktır. Başlamak için, L-glutamin ve 15 mililitre ısı inaktive fetal sığır serumu ile desteklenen 500 mililitre RPMI oluşan HL60 hücre kültürü medya hazırlamak. HL60 hücrelerinin yayılması ve bakımı için, 75 santimetre kare lik hl60 hücre kültürü medyasının 10 mililitresinde beş milyon hücre, 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit leğenli şişeleri boşaltTı.HL60 hücrelerinin çalışma stokları oluşturmak için, HL60 kültür medya% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenen bir mililitre kriyojenik tüpler içine mililitre başına yaklaşık bir milyon hücre ekleyin. HL60 hücrelerini ayırt etmek için, kültür 1.5 kat 10 HL60 hücre kültürü medya 15 mililitre yedi hücreye steril filtre% 0.6 DMF ile desteklenmiş 75 santimetre kare şişeleri 37 santigrat derece ve 5% karbondioksit üç gün önce OPKA için. Bakteriyel stok örnekleri hazırlamak için, 37 santigrat derece yaklaşık 2-4 saat boyunca uygun bir et suyu WU2 bakteri suş büyümek.Daha sonra, iki dakika için altı bin kez G santrifüj ile bakteri pelet ve uygun suyu% 15 gliserol 10 ila 30 mililitre hücreleri askıya. Aliquot steril içine bakteri kültürü 1.5 mililitre santrifüj tüpler ve saklamak 80 santigrat derece. Sonra, 37 derece santigrat su banyosunda bir şişe bakteri stoku eritin.Pellet bakteri hücreleri ve steril koşullar altında OBB 500 mikrolitre resuspend. Kan agar plakaları üzerinde tedavi edilmemiş bakteri stokunun plaka seyreltmeleri ve kültür tabakları bir gecede 30 santigrat derece. Kuluçka adımından sonra, hl60 hücreleri ile birlikte kültüre işlenmemiş bakteriyel stok her seyreltme için koloniler saymak.Bu bakteri stoğu ile gelecekteki OPK'lar için en uygun sayıda bakteri nin seyreltilmesinin en uygun sayıda kisiye verim verdiğini kaydedin. Bir tüp bakteri stokunu erit. Pelet bakterileri iki dakika boyunca altı bin kez G'de bulunur ve obb'deki hücre peletini bir önceki adımda elde edilen optimum seyreltmede yeniden askıya alın.Pipet yuvarlak bir alt 96 iyi hücre kültürü plaka iyi başına resuspended bakteriyel seyreltme 10 mikrolitre. Daha sonra, her deneysel kuyuya uygun bir antikor veya ilaç tedavisinin 20 mikrolitresini ekleyin. Kontrol kuyuları için, tedavi kuyuları için kullanılan tamponbağlı olarak 1XPBS veya OBB kullanın.Bir saat boyunca oda sıcaklığında yaklaşık 90 rpm örnek plaka sallayın. Üç gün önce DMF ile tedavi edilen HL60 farklılaştırılmış hücreleri hasat etmek için hücreleri 500 kez G'de üç dakika peletleyin. Supernatant atın ve 1XPBS en az 10 mililitre ile pelet yıkayın.Yıkanmış hücreleri 3 dakika boyunca 500 kez G'de peletleyin. Supernatant atın ve OBB hücreleri yeniden askıya. Steril seyreltilmemiş bebek tavşan serumu bir ila beş son cilt ekleyin.Bir saat bakteri kültürü sonra, iki grup için yinelenen kuyular halinde her örnek bölün. Daha sonra, her bir deney seti kuyulara 50 mikrolitre HL60 kompleman karışımı ve sadece bakteri kuyularına 50 mikrolitre OBB ekleyin. Bir saat boyunca 37 santigrat derece 96 kuyu plaka sıkış.Plaka örnekleri için, her numunenin en az 50 mikrolitre lik bir hacme sahip olması için OBB ile her kuyuya 1-5 son hacimde seyreltin. Daha sonra, pipet 50 mikrolitre her numune doğrudan bir bakteri kültürü plaka belirli bir alana, numuneler arasında yeterli boşluk sağlanması. Kapak ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurulamak için örnekler sağlar.Tabakları ve kültürü bir gecede 30 derecede tersine çevirin. Alternatif olarak, anoksik koşulların bakteri büyümesini etkileyip etkilemediğini veya morfolojiyi kontrol edip etmediğini test etmek için anaerobik kavanozlarda kültür plakaları. Bir gecelik kültürden sonra, belirlenen her örnek alandaki kolonileri sayın ve her kümedeki canlı hücre sayısını ilgili denetimlerle karşılaştırarak verileri çözümlemeye geçin.Bu tekniği ilk kez oluşturmanın en zor yönleri büyük olasılıkla bakteri stokunun başlangıç CPU'larını optimize etmek ve HL60 hücrelerinin etkin bir şekilde farklılaşmasını sağlamak olacaktır. OPKA'ya başlamadan önce HL60 farklılaşması proidium iyodürlü akış sitometrisi kullanılarak uygulanabilirlik belirteci olarak doğrulandı. Üç gün DMF ile tedavi edildikten sonra CD35 ekspresyonu artırıldı ve CD71 ekspresyonu azaltıldı.HL60 tedavi edilen gruplardaki bakteriyel CPU'ların ortalama yüzdeleri, farklı tedavilerin bakteri hücre sağkalımını karşılaştırmak için hl60'a ait olmayan tedavi gruplarına göre kullanılmıştır. Sonuçlar, etkili bir tedavi ile koloni lerin sayısının HL60 ortak kültürü ile HL60 hücreleri arasında farklı olduğunu ve daha verimli fagositon olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, bakteriyel seyreltme optimize edilmediğinde veya koloni büyümesinin kaplamadan sonra dikkatle gözlemlenmediğini, kolonilerin aşırı büyümesinin kolonilerin doğru sayımını önleyebileceğini göstermiştir.Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, CUV'ların aşırı büyümesini önlemek için bakteri kuluçkasını dikkatle izlemektir. In vivo tahliller bir konak içinde etkili bakteriyel açıklık asses için kullanılabilir. Bu tahliller OPKA ile gözlenen bağışıklık etkinliğini doğrulamak için kullanılabilir insan veya hayvan modelleri ne dönüştürülebilir.Opsonofazor öldürücü köz, antibakteriyel tedavileri fagostik immün yanıtlara bağlamak için önceki önemli araştırma çalışmalarında büyük etki yaratmıştır. Bakteriyel patojenlerle çalışmak tehlikeli olabilir. Lütfen bu test sırasında her zaman koruyucu kişisel ekipman giyin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antijen Özgül In Vivo</emKAKE Etiketli Hedef Hücreler> Killing Testi

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...