Name: high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

يشكر المؤلفون توماس [ك.]. [متّنليتر] و [فيرينا] [ت] [كمب] ل [أنفيوو] يقرأ المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مبادرة التميز الاتحادية لمكلنبورغ بوميرانيا الغربية والصندوق الاجتماعي الأوروبي (ESF) منحة KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ومنحة بحثية تعاونية داخل الجدارية على Lyssaviruses في [فريدريش-لوفلر-ينستيت] ([ري-0372]).

تم استخدام مواد الدماغ المحفوظة الثابتة بـ PFV. تم تقييم الدراسات التجريبية الحيوانية ذات الصلة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المسؤولة، واستخدام، والأخلاقيات التابعة لمكتب الدولة للزراعة والسلامة الغذائية وصيد الأسماك في مكلنبورغ بوميرانيا الغربية (LALFF M-V) وحصلت على الموافقة بإذن 7221.3-2.1-00...

<ol>
	<li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction.">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+types.">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consultation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , (2018).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).</li><li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens.">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry.">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li><li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters.">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li></ol>

عودة ومواصلة تطوير تقنيات إزالة الأنسجة في السنوات الأخيرة2و3و4 و5 و6و7و8، 9 , 10 سنوات , 11 , 1...

تعتمد تقنيات علم الأنسجة التقليدية في الغالب على أجزاء رقيقة من أنسجة الأعضاء، والتي يمكن أن توفر بطبيعتها رؤى 2D فقط في بيئة 3D معقدة. على الرغم من أن من الممكن من حيث المبدأ، إعادة الإعمار 3D من أقسام رقيقة المسلسل يتطلب خطوط أنابيب التقنية الصعبة لكل من تشريح واللاحقة في محاذاة silico من الصور المكتسبة1. وعلاوة على ذلك، إعادة الإعمار السلس من z-volumes بعد تشريح microtome أمر بالغ الأهمية كما يمكن أن تبقى على حد سواء القطع الأثرية الميكانيكية والحسابية بسبب تسجيل صورة دون المستوى الأمثل الناجمة عن طائرات الصورة غير المتداخلة، والاختلافات تلطيخ، والمادية تدمير الأنسجة من قبل، على سبيل المثال، شفرة microtome. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقطيع البصري النقي لعينات الأنسجة السميكة السليمة يسمح باقتناء طائرات صور متداخلة (الإفراط في أخذ العينات)، وبالتالي يسهل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. وهذا بدوره مفيد للغاية لتحليل عمليات العدوى في مجموعات الخلايا المعقدة (مثل الشبكات العصبية في سياق الخلايا الدبقية والمناعية المحيطة). ومع ذلك، تشمل العقبات الكامنة في أقسام الأنسجة السميكة التشتت الخفيف واختراق الأجسام المضادة محدودة في الأنسجة. في السنوات الأخيرة، تم تطوير مجموعة متنوعة منالتقنيات وتحسينها للتغلب على هذه القضايا 2،3،4،5،6،7،8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12 , 13.أساسا، يتم تحويل الأنسجة المستهدفة شفافةبصريا عن طريق العلاج مع إما مائي 2،3،4،5،6،7 ،8،9 أو العضوية المذيبات القائمةعلى 10،11،12،13 الحلول. إدخال 3DISCO (التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)11،12 وuDISCO خليفتها (في نهاية المطاف التصوير 3D من الأجهزة المذيبات تطهيرها)13 وفرت أداة سريعة نسبيا، بسيطة، وغير مكلفة مع قدرات ممتازة المقاصة. والمكونات الرئيسية لبروتوكول المقاصة هي المذيبات العضوية tert-butanol (TBA)، والكحول البنزيل (BA)، وبنزوات البنزيل (BB)، والإيثر الثنائي الفينيل (DPE). تطوير وإضافة iDISCO (التصوير 3D تمكين وضع العلامات المناعية من الأجهزة المذيبات تطهيرها)14،بروتوكول متوافق للبقع المناعية، شكلت ميزة أخرى على الأساليب القائمة وتمكين وضع العلامات الأنسجة العميقة من المستضدات من الفائدة، فضلا عن التخزين على المدى الطويل من العينات الملطخة بالمناعة. وهكذا، فإن الجمع بين iDISCO14 و uDISCO13 يسمح للتصوير عالية الدقة من البروتينات التي تحمل اسم الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة الكبيرة (تصل إلى 1 ملم) باستخدام CLSM التقليدية.
الحفاظ على بنية الجهاز المعقدة في جميع الأبعاد الثلاثة مهم بشكل خاص لأنسجة الدماغ. الخلايا العصبية تشكل شبه السكان الخلوية غير متجانسة جدا مع مورفولوجيات 3D متنوعة للغاية على أساس التوقعات النيورايت (استعرض من قبل ماسلاند15). وعلاوة على ذلك، يتكون الدماغ من عدد من المقصورات والمقصورات الفرعية، يتكون كل منها من مجموعات فرعية خلوية مختلفة ونسب منها، بما في ذلك الخلايا الغليفية والخلايا العصبية (التي استعرضها فون بارتالد وآخرون16). كفيروس عصبي، فإن فيروس داء الكلب (RABV، الذي استعرضه Fooks et al.17)يصيب الخلايا العصبية في المقام الأول، وذلك باستخدام آلات النقل الخاصة بهم للسفر في اتجاه رجعي على طول المحاور من الموقع الرئيسي للعدوى إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). يسمح البروتوكول الموضح هنا (الشكل1A)بالكشف بمساعدة المناعة والتصور للخلايا المصابة بـ RABV وRABV في أكوام صور كبيرة ومتماسكة تم الحصول عليها من أنسجة الدماغ المصابة. وهذا يمكّن من إجراء تقييم غير متحيز وثلاثي الدقة لبيئة العدوى. وهو ينطبق على أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من الأنواع، ويمكن القيام به مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين الطويل الأجل للعينات في البارافورمالهايد (PFA)، ويسمح بتخزين وإعادة تصوير العينات الملونة وتطهيرها لعدة أشهر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">41218</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">BB6630-500ML</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4720.2</td>
			<td style="width:297px;">Various buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Diphenyl ether</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">240834-100G</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">DL-&#945;-Tocopherol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">A17039</td>
			<td style="width:297px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:160px;">C06SBZ</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycine</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3908.2</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Goat serum</td>
			<td style="width:119px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">S26-100ML</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">7692.1</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrogen peroxide solution (30 %)</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">8070.2</td>
			<td style="width:297px;">Sample bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Methanol</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4627.4</td>
			<td style="width:297px;">Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">0335.3</td>
			<td style="width:297px;">Crystalline powder to make fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">K305.1</td>
			<td style="width:297px;">Prevention of microbial growth in stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">tert-Butanol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">33278</td>
			<td style="width:297px;">Sample dehydration for tissue clearing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:160px;">T3605</td>
			<td style="width:297px;">Nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3051.2</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">AppliChem</td>
			<td style="width:160px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:119px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:160px;">0030119401</td>
			<td style="width:297px;">Sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 22 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111620</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 30 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111700</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hypodermic needle (27 G x &#190;&#8221; [0.40 mm x 20 mm])</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:160px;">4657705</td>
			<td style="width:297px;">Filling of the imaging chamber with clearing solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">RTV-1 silicone rubber</td>
			<td style="width:119px;">Wacker</td>
			<td style="width:160px;">Elastosil E43</td>
			<td style="width:297px;">Adhesive for the assembly of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Ultimaker CPE 2.85 mm transparent</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">8718836374869</td>
			<td style="width:297px;">Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Technical equipment and software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">3D printer</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">Ultimaker 2+</td>
			<td style="width:297px;">Printing of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Automated water immersion system</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15640019</td>
			<td style="width:297px;">Software-controlled water pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">Elmi</td>
			<td style="width:160px;">DOS-20M</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker, heated</td>
			<td style="width:119px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:160px;">G24 Environmental Shaker</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at 37 &#176;C (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">DMI 6000 TCS SP5</td>
			<td style="width:297px;">Inverted confocal microscope for sample imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Fiji</td>
			<td style="width:119px;">NIH (ImageJ)</td>
			<td style="width:160px;">open source software (v1.52h)</td>
			<td style="width:297px;">Image processing package based on ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Long working distance water immersion objective</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15506360</td>
			<td style="width:297px;">HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vibratome</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">VT1200S</td>
			<td style="width:297px;">Sample slicing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Workstation</td>
			<td style="width:119px;">Dell</td>
			<td style="width:160px;">Precision 7920</td>
			<td style="width:297px;">CPU: Intel Xeon Gold 5118 
			GPU: Nvidia Quadro P5000 
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 
			SSD: 2 TB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:251px;">Goat anti-RABV N</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-GFAP</td>
			<td style="width:119px;">Dako</td>
			<td style="width:160px;">Z0334</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-MAP2</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:160px;">ab32454</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) 
			Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:251px;">Rabbit anti-RABV P 160-5</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) 
			Dilution: 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue

التصور لعمليات العدوى في الأنسجة والأعضاء عن طريق وضع العلامات المناعية هو وسيلة رئيسية في علم الأحياء العدوى الحديثة. القدرة على مراقبة ودراسة توزيع، التروبيسم، ووفرة مسببات الأمراض داخل أنسجة الأعضاء يوفر بيانات محورية عن تطور المرض والتقدم. باستخدام أساليب الفحص المجهري التقليدية، يقتصر وضع العلامات المناعية في الغالب على المقاطع الرقيقة التي يتم الحصول عليها من عينات جزءا لا يتجزأ من البارافين أو المجمدة. ومع ذلك، فإن مستوى الصورة ثنائي الأبعاد المحدود لهذه الأقسام الرقيقة قد يؤدي إلى فقدان معلومات حاسمة عن البنية المعقدة للجهاز المصاب والسياق الخلوي للعدوى. توفر تقنيات إزالة الأنسجة الحديثة متعددة الألوان والمتوافقة مع تلطيخ المناعة الآن طريقة سريعة وغير مكلفة نسبياً لدراسة أكوام الصور ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الكبير من أنسجة الأعضاء المصابة بالفيروس. من خلال تعريض الأنسجة للمذيبات العضوية، فإنه يصبح شفافا بصريا. وهذا يطابق مؤشرات الانكسار للعينة ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض كبير في تشتت الضوء. وهكذا، جنبا إلى جنب مع أهداف مسافة العمل الحرة لمسافات طويلة، يمكن تصوير أقسام الأنسجة الكبيرة تصل إلى 1 ملم في الحجم بواسطة الفحص المجهري الضوئي بالليزر البؤري التقليدي (CLSM) بدقة عالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتطبيق التصوير الأنسجة العميقة بعد تطهير الأنسجة لتصور توزيع فيروس داء الكلب في العقول المصابة من أجل دراسة مواضيع مثل مسببات الأمراض الفيروس، وانتشار، التروبيسم، والغزو العصبي.

مزيج من iDISCO14 و uDISCO13 جنبا إلى جنب مع CLSM عالية الدقة يوفر رؤى عميقة في القرار spatiotime واللدونة من العدوى RABV من أنسجة الدماغ والسياق الخلوي المحيطة بها.
باستخدام التلطيخ المناعي للبروتين الفوسفاتي RABV (P)، يمكن تصور الطبقات المعقدة منالخل...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

تسمح تقنيات إزالة الأنسجة الجديدة المتوافقة مع التلطيخ المناعي مثل التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي للأعضاء التي يتم تطهيرها بالمذيبات بالتصور ثلاثي الأبعاد للعدوى الدماغية بفيروس داء الكلب وبيئته الخلوية المعقدة. يتم جعل شرائح أنسجة الدماغ السميكة التي تحمل اسم الأجسام المضادة شفافة بصرياً لزيادة عمق التصوير وتمكين التحليل ثلاثي الأبعاد عن طريق الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر.

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

هذا البروتوكول يتيح التصور من عدوى الفيروس ويوفر رؤى عميقة في القرار ازن الزمني من بيئة العدوى والسياق الخلوي المحيط بها. تطبيق المناعة على التصوير الأنسجة العميقة لا يسمح فقط الكشف عن الفيروسات، ولكن في الواقع أيضا تمكن من التفريق بين مختلف الاكتظاظ الخلوي باستخدام علامات الخلية الخاصة بهم. لإصلاح الأنسجة للمناعة مكان عينات الدماغ في نسبة واحد إلى 10 من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لعينة من حجم الأنسجة لمدة 48 ساعة على الأقل في أربع درجات مئوية.في نهاية فترة التثبيت غسل عينات الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل غسل قبل نقل العينات إلى 02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية. ثم استخدم مجموعة اهتزازية إلى 0.3 إلى 0.5 ملليمتر في الثانية معدل تغذية شفرة لقسم الأنسجة إلى أقسام سميكة ملليمتر واحد. تخزين الأقسام في أزيد صوديوم 02٪ الطازجة في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية.للمعالجة المسبقة الميثانول تزج العينات في سلسلة الميثانول التصاعدي كما هو مبين لمدة ساعة واحدة لكل حضانة في درجة حرارة الغرفة مع تذبذب لطيف. بعد الحضانة الأخيرة تبرد العينات إلى أربع درجات مئوية. استبدل الميثانول بنسبة 100٪، بأربعة ملليلترات من محلول التبييض المبردة مسبقاً لاحتضان لمدة ليلة واحدة عند أربع درجات مئوية.في صباح اليوم التالي استبدال حل التبييض مع أربعة ملليلتر من الميثانول 80٪ الطازجة لمدة ساعة واحدة حضانة في درجة حرارة الغرفة. ثم تزج العينات في سلسلة تنازلية من الميثانول في عكس ما ثبت للتو، وغسل العينات مرة واحدة لمدة ساعة واحدة في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بعد غمر الميثانول 20٪. للمناعة من أقسام أنسجة المخ غسل العينات مرتين لمدة ساعة واحدة في أربع ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، تليها permeabilization لمدة يومين في 37 درجة مئوية في أربع ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 20٪ ثنائي الفينيل سولفوكسيد، و 0.3 المولار الجليسين في PBS.كتلة أي ربط غير محدد مع أربعة ملليلتر من 0.2٪ تريتون X-100، 10٪ ثنائي الفينيل السلف، و 6٪ مصل طبيعي في برنامج تلفزيوني لمدة يومين في 37 درجة مئوية. في نهاية التسمية حجب الحضانة العينات مع مليلترين من محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية، منعش حل الأجسام المضادة بعد يومين و 1/2. بعد ذلك، قم بغسل العينات ليوم واحد في أربعة ملليلترات من 0.2٪ توين 20 و10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في PBS تبادل عازلة غسل ما لا يقل عن أربع إلى خمس مرات خلال اليوم وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها.في اليوم التالي، احتضان العينات في مليلترين من محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية. ثم غسل العينات في أربعة ملليلتر من 0.2٪ Tween الطازجة 20 و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح. لتلطيخ نوويّة من العينات ينقب العينات في أربعة ملليلتر من الحمّل نوويّة وصمة عار TO-PRO-3 لخمسة ساعات حميت من ضوء.في نهاية الحضانة غسل العينات في 0.2٪ توين 20 و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الهيبارين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، تليها الجفاف في سلسلة الصعود من البيروتانول العليا لمدة ساعتين لكل غمر. بعد 90٪ نقل الغمر العينات إلى 96٪ حل ثلثي بوتانول بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، يجفف العينات في 100٪ من البوتانول لمدة ساعتين قبل إزالة أقسام الأنسجة في BABB-D15 المعدة حديثًا لمدة ساعتين إلى ست ساعات حتى تكون شفافة بصريًا.ويمكن بعد ذلك تخزين العينات في BABB-D15 محمية من الضوء حتى تركيبها والتصوير. بالنسبة للعينة التركيبة استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة حجرة وغطاء تصوير. جبل 30 ملليمتر قطرها أغطية على غرفة التصوير مع درجة حرارة غرفة مكون واحد vulcanizing مطاط السيليكون.وبالمثل، جبل 22 ملليمتر يغطي على الغطاء. استخدام مسحة القطن الماء اتم لإزالة المطاط السيليكون الزائد على كلا الحلقتين قبل السماح للمطاط لعلاج بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، ضع عينة في غرفة التصوير وأضف حجمًا صغيرًا من BABB-D15 إلى الغرفة قبل إدخال الغطاء.باستخدام إبرة تحت الجلد ملء الغرفة مع BABB-D15 من خلال مدخل وتوصيل مدخل قبل ختم غرفة التصوير مع المطاط السيليكون. لإعداد الحصول على الصورة حدد خطوط الليزر المناسبة للفلوروفوريس المستخدمة، وضبط نطاقات الكشف عن كل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات. ثم قم بتعيين معلمات الاكتساب للعثور على الحد العلوي والسفلى من المكدس Z والحصول على رصة الصورة.لإنشاء إسقاطات 3D من كومة الصور فتح ملفات الصور في فيجي وحدد صورة لون قنوات أداة المزيد وقنوات الانقسام لتقسيم الصور المدمجة في قنوات فردية. لتصحيح التبييض للصور، حدد لكل قناة تصحيح ضبط التبييض للصور وحدد نسبة بسيطة. استخدم أشرطة التمرير لضبط السطوع والتباين لكل قناة، وحدد ألوان الصور وقنوات الدمج.حدد الخيار إنشاء مركب. قم بتحويل الصورة إلى تنسيق RGB وحدد مكدسات الصور ومشروع ثلاثي الأبعاد لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد. حدد ألمع نقطة كأسلوب الإسقاط وقم بتعيين تباعد الشرائح ليتناسب مع حجم الخطوة Z من مكدس الصور المكتسبة.للحصول على أقصى جودة تعيين زيادة زاوية دوران إلى واحد وتمكين الاستيفاء. تعديل إجمالي استدارة وعتبات الشفافية والعتامة حسب الحاجة. ثم احفظ العرض ثلاثي الأبعاد بتنسيقي ملفات tiff و AVI.يمكن تصور استخدام المناعة من فيروس داء الكلب الفوسفوبروتين طبقات معقدة من الخلايا العصبية المصابة في أجزاء سميكة من عينات أنسجة الدماغ الماوس. في وقت لاحق، يمكن إعادة بناء الإسقاطات ثلاثية الأبعاد السلسة لمكدسات الصور المكتسبة. وبسبب الدقة العالية التي يتم بها الحصول على أكوام الصور، يمكن تقييم العدوى حتى مستوى خلية واحدة، مما يسمح بتأكيدات حول، على سبيل المثال، وفرة وتوزيع المستضد داخل خلية ذات فائدة.بالإضافة إلى أنسجة الدماغ الماوس، يمكن تطبيق البروتوكول على عينات أنسجة الدماغ من الأنواع الحيوانية الأخرى. على سبيل المثال، تكشف الأقسام التي تم الحصول عليها من أجزاء مختلفة من الدماغ النمسي المصاب عن درجة متفاوتة من عدوى فيروس داء الكلب. يمكن تمييز الخلايا الفلكية عن طريق التعبير عن بروتين حمض الهرفان الدبقية في حين يمكن أن تكون ملطخة على وجه التحديد للنيوريات البروتين المرتبطة ميكروتيبول II.Simultaneous، يمكن أن تكون البروتينات الفيروسية الملطخة لتقييم العلاقة بين الخلايا المصابة وتسليط الضوء على السكان الفرعية الخلوية.للمناعة اختيار الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات من الفائدة أمر بالغ الأهمية. في حين أن تركيزات المناعة المعيارية القياسية غالبًا ما تكون نقطة انطلاق جيدة ، فقد تحتاج بعض الأجسام المضادة إلى تعديل إضافي. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول لها خصائص ضارة.إجراء التجربة ذات الصلة في غطاء الدخان ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي للطرق الدماغ المتوسط ​​الإنسان

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

تحليل Metabolomic من دماغ الفئران بواسطة عالية الدقة النووية الرنين المغناطيسي الطيفي مقتطفات من الأنسجة

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

عالية الدقة<em&gt; في فيفو</em&gt; دليل بروتوكول تجزئة للالإنسان الحصين الحقول الفرعية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

عالية الدقة الهيكلي التصوير بالرنين المغناطيسي من تحت القشرة الإنسان<I&gt; في فيفو</I&gt; وتشريح الجثث

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...