Name: high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

De auteurs bedanken Thomas C. Mettenleiter en Verena te kamp voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door het Federal Excellence Initiative van Mecklenburg-Voor-Pommeren en het Europees Sociaal Fonds (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) en een studiebeurs voor intramurale samenwerking op lyssavirussen in de Friedrich-Loeffler-Instituut (RI-0372).

RABV-geïnfecteerde, PFA-vaste gearchiveerde hersen materiaal werd gebruikt. De respectieve dierexperimentele studies werden geëvalueerd door de verantwoordelijke dierenzorg, het gebruik en de ethische commissie van het staatsbureau voor landbouw, voedselveiligheid en visserij in Mecklenburg-Voor-Pommeren (LALFF M-V) en hebben goedkeuring gekregen met machtigingen 7221.3-2.1-002/11 (muizen) en 7221.3-1-068/16 (fretten). De algemene zorg en methoden die bij de dierproeven worden gebruikt, zijn volgens de goedgekeurde ric...

<ol>
	<li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction.">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+types.">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consultation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , (2018).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).</li><li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens.">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry.">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li><li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters.">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li></ol>

De heropleving en verdere ontwikkeling van weefsel clearing technieken in de afgelopen jaren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , <sup class="xre...

Conventionele histologie technieken vertrouwen meestal op dunne delen van orgaan weefsels, die inherent alleen 2D-inzichten kunnen bieden in een complexe 3D-omgeving. Hoewel het in principe haalbaar is, vereist 3D-reconstructie van seriële dunne secties veeleisende technische pijpleidingen voor zowel snijden als daaropvolgende in silico-uitlijning van de verkregen beelden1. Bovendien is een naadloze reconstructie van z-volumes na microtoom-snijden cruciaal omdat zowel mechanische als computationele artefacten kunnen blijven vanwege suboptimale beeldregistratie veroorzaakt door niet-overlappende afbeeldings vlakken, kleurings variaties en fysieke vernietiging van weefsel door bijvoorbeeld het mes van de microtoom. Zuiver optisch snijden van intacte dikke weefselmonsters zorgt daarentegen voor de verwerving van overlappende beeld vlakken (oversampling) en vergemakkelijkt daarmee de 3D-reconstructie. Dit, op zijn beurt, is zeer gunstig voor de analyse van infectie processen in complexe celpopulaties (bijvoorbeeld neuronale netwerken in de context van de omringende gliacellen en immune cellen). Echter, inherente obstakels van dikke weefsel secties omvatten lichtverstrooiing en beperkte antilichaam penetratie in het weefsel. In de afgelopen jaren is een verscheidenheid aan technieken ontwikkeld en geoptimaliseerd om deze problemen te overwinnen2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. in wezen worden doelweefsels optisch transparant gedraaid door middel van een behandeling met ofwel waterige2,3,4,5,6,7 ,8,9 of op organische oplosmiddelgebaseerde 10,11,12,13 oplossingen. De introductie van 3disco (3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)11,12 en zijn opvolger udisco (Ultimate 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)13 voorzag in een relatief snelle, eenvoudige en goedkope tool met uitstekende clearing mogelijkheden. De belangrijkste bestanddelen van het clearing protocol zijn de organische oplosmiddelen tert-butanol (TBA), benzylalcohol (BA), Benzylbenzoaat (BB) en difenyl ether (DPE). De ontwikkeling en toevoeging van iDISCO (immunolabeling-enabled 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)14, een compatibel immunokleurings protocol, vormde een ander voordeel ten opzichte van bestaande methoden en stelde de diepe weefsel etikettering van antigenen van belang, evenals de lange termijn opslag van immuunbevlekte monsters. Zo zorgt de combinatie van iDISCO14 en udisco13 voor de beeldvorming met hoge resolutie van antilichaam-gelabelde eiwitten in grote weefsel secties (tot 1 mm) met conventionele CLSM.
Het behoud van de complexe structuur van een orgel in alle drie de dimensies is vooral belangrijk voor hersenweefsel. Neuronen bestaan uit een zeer heterogene cellulaire subpopulatie met zeer uiteenlopende 3D-morfologieën op basis van hun neuriet projecties (beoordeeld door Masland15). Bovendien bestaat de hersenen uit een aantal compartimenten en subcompartimenten, elk samengesteld uit verschillende cellulaire subpopulaties en ratio's daarvan, met inbegrip van gliacellen en neuronen (beoordeeld door von Bartheld et al.16). Als een trope virus, het rabiësvirus (rabv, beoordeeld door Fooks et al.17) infecteert voornamelijk neuronen, met behulp van hun transportmachines te reizen in retrograde richting langs axonen van de primaire site van infectie naar het centrale zenuwstelsel (CNS). Het hier beschreven Protocol (Figuur 1A) maakt de detectie en visualisatie van rabv en rabv geïnfecteerde cellen mogelijk in grote, samenhangende beeld stapels verkregen uit geïnfecteerd hersenweefsel. Dit maakt een onbevooroordeelde, 3D hoge-resolutie beoordeling van de infectie omgeving. Het is van toepassing op hersenweefsel van een verscheidenheid van soorten, kan onmiddellijk worden uitgevoerd na fixatie of na de lange termijn opslag van monsters in Paraformaldehyde (PFA), en laat de opslag en reimaging van bevlekte en gewiste monsters voor maanden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">41218</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">BB6630-500ML</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4720.2</td>
			<td style="width:297px;">Various buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Diphenyl ether</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">240834-100G</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">DL-&#945;-Tocopherol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">A17039</td>
			<td style="width:297px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:160px;">C06SBZ</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycine</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3908.2</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Goat serum</td>
			<td style="width:119px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">S26-100ML</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">7692.1</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrogen peroxide solution (30 %)</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">8070.2</td>
			<td style="width:297px;">Sample bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Methanol</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4627.4</td>
			<td style="width:297px;">Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">0335.3</td>
			<td style="width:297px;">Crystalline powder to make fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">K305.1</td>
			<td style="width:297px;">Prevention of microbial growth in stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">tert-Butanol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">33278</td>
			<td style="width:297px;">Sample dehydration for tissue clearing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:160px;">T3605</td>
			<td style="width:297px;">Nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3051.2</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">AppliChem</td>
			<td style="width:160px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:119px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:160px;">0030119401</td>
			<td style="width:297px;">Sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 22 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111620</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 30 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111700</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hypodermic needle (27 G x &#190;&#8221; [0.40 mm x 20 mm])</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:160px;">4657705</td>
			<td style="width:297px;">Filling of the imaging chamber with clearing solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">RTV-1 silicone rubber</td>
			<td style="width:119px;">Wacker</td>
			<td style="width:160px;">Elastosil E43</td>
			<td style="width:297px;">Adhesive for the assembly of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Ultimaker CPE 2.85 mm transparent</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">8718836374869</td>
			<td style="width:297px;">Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Technical equipment and software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">3D printer</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">Ultimaker 2+</td>
			<td style="width:297px;">Printing of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Automated water immersion system</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15640019</td>
			<td style="width:297px;">Software-controlled water pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">Elmi</td>
			<td style="width:160px;">DOS-20M</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker, heated</td>
			<td style="width:119px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:160px;">G24 Environmental Shaker</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at 37 &#176;C (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">DMI 6000 TCS SP5</td>
			<td style="width:297px;">Inverted confocal microscope for sample imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Fiji</td>
			<td style="width:119px;">NIH (ImageJ)</td>
			<td style="width:160px;">open source software (v1.52h)</td>
			<td style="width:297px;">Image processing package based on ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Long working distance water immersion objective</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15506360</td>
			<td style="width:297px;">HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vibratome</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">VT1200S</td>
			<td style="width:297px;">Sample slicing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Workstation</td>
			<td style="width:119px;">Dell</td>
			<td style="width:160px;">Precision 7920</td>
			<td style="width:297px;">CPU: Intel Xeon Gold 5118 
			GPU: Nvidia Quadro P5000 
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 
			SSD: 2 TB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:251px;">Goat anti-RABV N</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-GFAP</td>
			<td style="width:119px;">Dako</td>
			<td style="width:160px;">Z0334</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-MAP2</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:160px;">ab32454</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) 
			Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:251px;">Rabbit anti-RABV P 160-5</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) 
			Dilution: 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue

De visualisatie van infectie processen in weefsels en organen door immunolabeling is een belangrijke methode in de moderne infectie biologie. De mogelijkheid om de verdeling, het tropisme en de overvloed van pathogenen in orgaan weefsels te observeren en bestuderen, verschaft cruciale gegevens over ziekte ontwikkeling en progressie. Met conventionele microscopie methoden is immunolabeling meestal beperkt tot dunne secties die zijn verkregen uit met paraffine ingesloten of bevroren monsters. Het beperkte 2D-beeldvlak van deze dunne secties kan echter leiden tot het verlies van cruciale informatie over de complexe structuur van een geïnfecteerd orgaan en de cellulaire context van de infectie. Moderne Multicolor, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken bieden nu een relatief snelle en goedkope manier om high-volume 3D-beeld stapels van virus-geïnfecteerde orgaanweefsel te bestuderen. Door het weefsel bloot te stellen aan organische oplosmiddelen, wordt het optisch transparant. Dit komt overeen met de brekingsindices van het monster en leidt uiteindelijk tot een significante reductie van lichtverstrooiing. Dus, in combinatie met lange vrije-afstands doelstellingen, kunnen grote weefsel delen tot 1 mm in grootte worden afgebeeld door conventionele confocale laser scanning microscopie (CLSM) bij hoge resolutie. Hier beschrijven we een protocol om Deep-tissue-beeldvorming toe te passen na weefsel clearing om rabiësvirus distributie in geïnfecteerde hersenen te visualiseren om onderwerpen als virus pathogenese, verspreiding, tropisme en neuro invasies te bestuderen.

De combinatie van iDISCO14 en udisco13 in combinatie met CLSM met hoge resolutie biedt diepgaande inzichten in de spatiotemporele resolutie en plasticiteit van rabv infectie van hersenweefsel en de omringende cellulaire context.
Met behulp van immunokleuring van RABV fosfoproteïne (P) kunnen complexe lagen van geïnfecteerde neuronale cellen worden gevisualiseerd in dikke delen van muizenhersenen (Figuur 3). Vervolg...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Dit protocol maakt de visualisatie van virusinfectie mogelijk en biedt diepgaande inzichten in spatiotemporale resolutie van de infectieomgeving en de omringende cellulaire context. De toepasbaarheid van immunostaining op diepe weefselbeeldvorming maakt niet alleen de detectie van virussen mogelijk, maar maakt in feite ook de differentiatie van verschillende cellulaire subpopulaties mogelijk met behulp van hun respectieve celmarkers. Om het weefsel vast te stellen voor immunostaining plaats de hersenmonsters in een verhouding van 1 tot 10 van 4% paraformaldehyde in PBS om weefselvolume gedurende ten minste 48 uur bij vier graden Celsius te bemonsteren.Aan het einde van de fixatieperiode wassen de weefselmonsters drie maal in PBS gedurende ten minste 30 minuten per wasbeurt alvorens de monsters over te brengen naar 02% natriumaveide in PBS bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een vibratome ingesteld op een 0,3 tot 0,5 millimeter per seconde blade feed rate om de weefsels sectie in een millimeter dikke secties. Bewaar de secties in verse 02% natriumaed in PBS op vier graden Celsius.Voor methanol voorbehandeling dompel de monsters onder in een opgaande methanolserie zoals aangegeven voor een uur per incubatie bij kamertemperatuur met zachte oscillatie. Na de laatste incubatie koelen de monsters tot vier graden Celsius. Vervang de 100% methanol door vier milliliter voorgekoelde bleekoplossing voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.De volgende ochtend vervangen de bleekoplossing met vier milliliter verse 80% methanol voor een uur incubatie bij kamertemperatuur. Dan onderdompelen de monsters in een dalende reeks van methanol in omgekeerde van wat net werd aangetoond, het wassen van de monsters een keer voor een uur in vier milliliter PBS na de 20% methanol onderdompeling. Voor immunosmetting van de hersenweefselsecties was je de monsters twee keer gedurende een uur in vier milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS, gevolgd door permeabilisatie gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius in vier milliliter van 0,2%Triton X-100, 20%dimethylsulfoxide en 0,3 molar glycine in PBS.Blokkeer elke niet-specifieke binding met vier milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%dimethylsulfoxide en 6% normaal serum in PBS gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius. Aan het einde van het blokkecatielabel worden de monsters gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius met twee milliliter primaire antilichaamoplossing vernieuwd, waarbij de antilichaamoplossing na twee en 1/2 dagen wordt vernieuwd. Vervolgens was de monsters voor een dag in vier milliliter van 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS het uitwisselen van de wasbuffer ten minste vier tot vijf keer in de loop van de dag en het verlaten van de laatste wassen op 's nachts.De volgende dag, incubeer de monsters in twee milliliter secundaire antilichaam oplossing gedurende vijf dagen bij 37 graden Celsius. Dan was de monsters in vier milliliter verse 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS zoals aangetoond. Voor het ontsteken van de monsters worden de monsters gedurende vijf uur in vier milliliter van de nucleïnezuurvlek TO-PRO-3 tegen licht beschermd.Aan het einde van de incubatie was de monsters in 0,2%Tween 20 en 10 microgram per milliliter heparine in PBS, gevolgd door uitdroging in een opgaande tert-butanol serie gedurende twee uur per onderdompeling. Na de 90% onderdompeling brengen de monsters 's nachts over naar een 96%tert-butanoloplossing. De volgende ochtend, dehydrateren de monsters verder in 100% tert-butanol gedurende twee uur voor het opruimen van de weefselsecties in vers bereide BABB-D15 gedurende twee tot zes uur totdat ze optisch transparant zijn.De monsters kunnen vervolgens worden opgeslagen in BABB-D15 beschermd tegen licht tot hun montage en beeldvorming. Voor monstermontage gebruikt u een 3D-printer om een beeldkamer en deksel af te drukken. Monteer een 30-millimeter diameter coverslip op de beeldkamer met een-component kamertemperatuur vulkaniseren siliconen rubber.Ook monteren een 22-millimeter coverslip op het deksel. Gebruik een water-bevochtigde wattenstaafje om het overtollige siliconen rubber op beide ringen te verwijderen alvorens het rubber om 's nachts te genezen. De volgende dag, plaats een monster in de beeldkamer en voeg een klein volume van BABB-D15 aan de kamer voor het invoegen van het deksel.Vul de kamer met behulp van een injectienaald met BABB-D15 door de inlaat en sluit de inlaat aan voordat de beeldkamer wordt afgesloten met siliconenrubber. Als u de beeldverwerving wilt instellen, selecteert u de juiste laserlijnen voor de gebruikte fluorofooren en past u de detectiebereiken van elke detector aan om overlap tussen kanalen te voorkomen. Stel vervolgens de acquisitieparameters in om de boven- en onderrand van de Z-stack te vinden en de afbeeldingsstack te verwerven.Als u 3D-projecties van de afbeeldingsstack wilt genereren, opent u de afbeeldingsbestanden in Fiji en selecteert u Hulpmiddel Afbeeldingskleurkanalen Meer en Gesplitste kanalen om de samengevoegde afbeeldingen op te splitsen in afzonderlijke kanalen. Selecteer voor bleekmiddelcorrectie van de afbeeldingen voor elk kanaal Afbeeldingscorrectie aanpassen en selecteer Eenvoudige verhouding. Gebruik de schuifregelaars om de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan te passen en selecteer Afbeeldingskleur en Samenvoegkanalen.Vink de optie Composiet maken aan. Converteer de afbeelding naar RGB-indeling en selecteer Afbeeldingsstapels en 3D-project om een 3D-projectie te genereren. Selecteer Helderste punt als projectiemethode en stel de segmentafstand in op de grootte van de Z-stap van de overgenomen afbeeldingsstapel.Stel voor een maximale kwaliteit de verhoging van de rotatiehoek in op één en schakel interpolatie in. Wijzig de totale rotatie, transparantiedrempels en Dekking indien nodig. Sla vervolgens de 3D-projectie op als zowel tiff- als AVI-bestandsindelingen.Met behulp van immunostaining van rabiës virus fosfoprotein complexe lagen van geïnfecteerde neuronale cellen kunnen worden gevisualiseerd in dikke delen van de muis hersenweefsel monsters. Vervolgens kunnen naadloze 3D-projecties van de verworven beeldstapels worden gereconstrueerd. Vanwege de hoge resolutie waarmee de beeldstapels worden verworven, kan de infectie worden beoordeeld tot een enkelcellig niveau, waardoor beweringen over bijvoorbeeld de overvloed en distributie van antigeen binnen een cel van belang.Naast muis hersenweefsel, kan het protocol worden toegepast op hersenweefsel monsters van andere diersoorten. Bijvoorbeeld, secties verkregen uit verschillende compartimenten van een geïnfecteerde fret hersenen onthullen een verschillende mate van rabiës virusinfectie. Astrocyten kunnen worden onderscheiden via de expressie van gliafibrillair zuur eiwit, terwijl neurites specifiek kunnen worden gekleurd voor microtubuli-geassocieerde eiwit II.Tegelijkertijd kunnen virale eiwitten worden mede-gekleurd om de relatie tussen de geïnfecteerde cellen en de gemarkeerde cellulaire subpopulatie te beoordelen.Voor immunostaining is de keuze van antilichamen om de proteïnen van belang te detecteren van cruciaal belang. Hoewel standaard immunohistochemieconcentraties vaak een goed uitgangspunt zijn, kunnen sommige antilichamen extra moeten worden aangepast. Veel van de chemische stoffen die in dit protocol worden gebruikt, hebben schadelijke eigenschappen.Voer het desbetreffende experiment uit in een rookkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een labjas en handschoenen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hoge resolutie<em&gt; In Vivo</em&gt; Manual Segmentatie Protocol voor menselijk hippocampus met behulp van 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Hoge-resolutie structurele Magnetic Resonance Imaging van de Human subcortex<I&gt; In Vivo</I&gt; En Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...