Name: high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

המחברים מודים לתומס סי מטנלייטר ולוורנה טה קמפ על שקראו באורח קשה את כתב היד. עבודה זו היתה נתמכת על ידי יוזמת מצוינות פדרלית של קלנבורג מערב פומרניה והקרן החברתית האירופית (esf) מענק ko kt (esf/14-BM-A55-0002/16) ו מענק מחקר משותף בקיר על lyssaviruses ב פרידריך-לופלר-מכון (Ri-0372).

שימוש בחומר המוח המאוחסן בארכיון באמצעות RABV. מחקרים ניסיוניים בעלי חיים בהתאמה הוערכו על ידי טיפול בעלי חיים אחראי, השימוש, וועדת האתיקה של משרד המדינה לחקלאות, בטיחות מזון, ודיג ב קלנבורג-מערב פומרניה (LALFF M-V) וקיבל אישור עם הרשאות 7221.3-2.1-002/11 (עכברים) ו-7221.3-1-068/16 (חמוסים). טיפול כללי ושיטות המש?...

<ol>
	<li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction.">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+types.">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consultation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , (2018).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).</li><li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens.">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry.">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li><li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters.">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li></ol>

התחייה ופיתוח נוסף של טכניקות ניקוי רקמות בשנים האחרונות2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 ,</sup...

טכניקות היסטולוגיה קונבנציונאלי להסתמך בעיקר על חלקים דקים של רקמות איברים, אשר יכול באופן מטבעו לספק רק התובנות 2D לתוך סביבת 3D מורכבת. למרות שניתן לעשות זאת בעיקרון, שחזור תלת-ממדי ממקטעים דקים סדרתיים מחייב קווים טכניים מסוימים לפריסה ולאחר מכן ביישור סיליקו של התמונות הנרכשים1. יתר על כן, שחזור חלק של כרכים z לאחר חיתוך מיקרוטום הוא קריטי כמו גם ממצאים מכניים וחישוביים יכולים להישאר בגלל רישום התמונה האופטימלי הנגרמת על ידי מטוסי התמונה לא חופפים, וריאציות מכתים, ופיזית , הרס רקמות על ידי. למשל, להב המיקרו-טומה לעומת זאת, חיתוך אופטי טהור של דגימות רקמה עבה שלמים מאפשר רכישה של מטוסי תמונה חופפים (דגימה מראש), ובכך, מקלה על שחזור תלת-ממד. זה, בתורו, מועיל מאוד לניתוח של תהליכים זיהום באוכלוסיות תאים מורכבות (למשל, רשתות נוירואליות בהקשר של התאים גליה המקיפים והחיסונית). עם זאת, מכשולים הטבועה של מקטעי רקמה עבים כוללים פיזור אור חדירה נוגדן מוגבלת לתוך הרקמה. בשנים האחרונות, מגוון של טכניקות פותחה ממוטבת להתגבר על בעיות אלה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. ביסודו של דבר, רקמות היעד הפכו שקופים באופן שקוף על ידי טיפול עם מימית2,3,4,5,6,7 ,8,9 או אורגני מבוסס הממס10,11,12,13 פתרונות. המבוא של 3disco (3disco הדמיה של איברים הממס נקי)11,12 ו udisco העוקבת שלה (3disco האולטימטיבי הדמיה של האיברים הממס נוקה)13 סיפק מהיר יחסית, פשוט, ו זול הכלי עם יכולות סליקה מצוינות. המרכיבים העיקריים של פרוטוקול סליקה הם ממיסים אורגניים טרט-butanol (יפורסם), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB), ו diphenyl אתר (dpe). הפיתוח והתוספת של iDISCO (immunolabeling מאופשר 3D הדמיה של איברים הממס נוקה)14, פרוטוקול חיסוני תואם, היוו יתרון נוסף על שיטות קיימות ואיפשר את התיוג העמוק ברקמה של אנטיגנים של עניין, כמו גם אחסון לטווח ארוך של דגימות מוכתם חיסוני. כך, השילוב של iDISCO14 ו udisco13 מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים המסומנים נוגדנים בסעיפים רקמות גדולות (עד 1 מ"מ) באמצעות clsm קונבנציונאלי.
שימור מבנה מורכב של איבר בכל שלושת הממדים חשוב במיוחד לרקמת המוח. נוירונים מהווים תת הטרוגנית התאית מאוד עם מורפולוגיות 3D מגוונים מאוד מבוסס על התחזיות הneurite שלהם (נבדק על ידי Masland15). יתרה מזאת, המוח מורכב ממספר תאים ותאי משנה, כל אחד מהם מורכב מאוכלוסיות שונות של תת-משנה ומיחס אליו, כולל תאים גליאל ונוירונים (שנבדקו על ידי פון ברטלד ואח '16). כווירוס נוירוטרופי, וירוס הכלבת (rabv, נבדק על ידי fooks ואח '17) מדביק בעיקר נוירונים, באמצעות מכונות ההובלה שלהם לנסוע בכיוון נסיגה לאורך אקסונים מהאתר העיקרי של זיהום למערכת העצבים המרכזית (cn). הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1א) מאפשר זיהוי חיסוני בסיוע ויזואליזציה של התאים הנגועים RABV ו-rabv ב גדול, בערימות תמונה קוהרנטית שהתקבלו מרקמת המוח נגוע. הדבר מאפשר הערכה ברזולוציה גבוהה משוחדת, תלת-ממדית של סביבת הזיהום. זה חל על רקמת המוח ממגוון של מינים, ניתן לבצע מיד לאחר קיבעון או אחרי אחסון לטווח ארוך של דגימות של פאראפורמלדהיד (בתחתית), ומאפשר אחסון והדמיה מחדש של דגימות מוכתם ומנוקה במשך חודשים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">41218</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">BB6630-500ML</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4720.2</td>
			<td style="width:297px;">Various buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Diphenyl ether</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">240834-100G</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">DL-&#945;-Tocopherol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">A17039</td>
			<td style="width:297px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:160px;">C06SBZ</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycine</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3908.2</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Goat serum</td>
			<td style="width:119px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">S26-100ML</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">7692.1</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrogen peroxide solution (30 %)</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">8070.2</td>
			<td style="width:297px;">Sample bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Methanol</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4627.4</td>
			<td style="width:297px;">Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">0335.3</td>
			<td style="width:297px;">Crystalline powder to make fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">K305.1</td>
			<td style="width:297px;">Prevention of microbial growth in stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">tert-Butanol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">33278</td>
			<td style="width:297px;">Sample dehydration for tissue clearing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:160px;">T3605</td>
			<td style="width:297px;">Nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3051.2</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">AppliChem</td>
			<td style="width:160px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:119px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:160px;">0030119401</td>
			<td style="width:297px;">Sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 22 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111620</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 30 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111700</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hypodermic needle (27 G x &#190;&#8221; [0.40 mm x 20 mm])</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:160px;">4657705</td>
			<td style="width:297px;">Filling of the imaging chamber with clearing solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">RTV-1 silicone rubber</td>
			<td style="width:119px;">Wacker</td>
			<td style="width:160px;">Elastosil E43</td>
			<td style="width:297px;">Adhesive for the assembly of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Ultimaker CPE 2.85 mm transparent</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">8718836374869</td>
			<td style="width:297px;">Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Technical equipment and software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">3D printer</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">Ultimaker 2+</td>
			<td style="width:297px;">Printing of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Automated water immersion system</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15640019</td>
			<td style="width:297px;">Software-controlled water pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">Elmi</td>
			<td style="width:160px;">DOS-20M</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker, heated</td>
			<td style="width:119px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:160px;">G24 Environmental Shaker</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at 37 &#176;C (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">DMI 6000 TCS SP5</td>
			<td style="width:297px;">Inverted confocal microscope for sample imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Fiji</td>
			<td style="width:119px;">NIH (ImageJ)</td>
			<td style="width:160px;">open source software (v1.52h)</td>
			<td style="width:297px;">Image processing package based on ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Long working distance water immersion objective</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15506360</td>
			<td style="width:297px;">HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vibratome</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">VT1200S</td>
			<td style="width:297px;">Sample slicing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Workstation</td>
			<td style="width:119px;">Dell</td>
			<td style="width:160px;">Precision 7920</td>
			<td style="width:297px;">CPU: Intel Xeon Gold 5118 
			GPU: Nvidia Quadro P5000 
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 
			SSD: 2 TB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:251px;">Goat anti-RABV N</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-GFAP</td>
			<td style="width:119px;">Dako</td>
			<td style="width:160px;">Z0334</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-MAP2</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:160px;">ab32454</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) 
			Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:251px;">Rabbit anti-RABV P 160-5</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) 
			Dilution: 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue

ההדמיה של תהליכי זיהום ברקמות ובאיברים על ידי immunolabeling היא שיטה מרכזית בביולוגיה זיהום מודרני. היכולת להתבונן וללמוד את ההפצה, tropism, שפע של פתוגנים בתוך רקמות האיברים מספק נתונים מרכזי על פיתוח המחלה והתקדמות. באמצעות שיטות מיקרוסקופ קונבנציונאלי, אימונויניום מוגבל בעיקר לחלקים דקים המתקבלים פרפין-מוטבע או מדגמים קפואים. עם זאת, מישור התמונה 2D מוגבל של סעיפים דקים אלה עשוי להוביל לאובדן מידע חיוני על המבנה המורכב של איבר נגוע ההקשר הסלולר של הזיהום. המודרנית multicolor, חיסוני מכתים לניקוי רקמות הרקמה כעת לספק דרך מהירה יחסית וזולה ללמוד בנפח גדול 3D התמונה ערימות של רקמת איבר נגוע וירוס. על-ידי חשיפת הרקמה לממיסים אורגניים, היא הופכת לשקופה בצורה אופטית. זה תואם את מדדי השבירה של המדגם ובסופו של דבר מוביל לירידה משמעותית של פיזור אור. כך, בשילוב עם מטרות ארוכות בטווח העבודה הפנוי, מקטעי רקמות גדולים עד גודל של 1 מ"מ ניתן לתמונה על ידי מיקרוסקופ מיקרוסקופית לייזר קונפוקלית וקד מקובל (clsm) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחיל הדמיה עמוקה רקמות לאחר ניקוי רקמות כדי להמחיש התפלגות וירוס כלבת במוח נגוע על מנת ללמוד נושאים כמו פתוגנזה וירוס, התפשטות, tropism, והפלישה neuroinvasion

השילוב של iDISCO14 ו udisco13 בשילוב עם clsm ברזולוציה גבוהה מספק תובנות עמוקות לתוך הרזולוציה הטמפורלית ואת הפלסטיות של זיהום rabv של רקמת המוח והקשר הסלולר המקיף.
שימוש חיסוני של ראפופרוטאין (P), שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים יכול להיות דמיינו בחלקים ע?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הידבקות בנגיף ומספק תובנות עמוקות על הרזולוציה המרחבית של סביבת הזיהום וההקשר התאי הסובב אותה. ההיישום של כשל חיסוני להדמיית רקמות עמוקות לא רק מאפשר זיהוי של וירוסים, אלא למעשה גם מאפשר התביור של תת-כפילויות תאיות שונות באמצעות סמני התאים המתאימים להן. כדי לתקן את הרקמה עבור immunostaining למקם את דגימות המוח ביחס של 1 עד 10 של 4% paraformaldehyde ב PBS כדי לדגום נפח רקמות לפחות 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף תקופת התקבעון לשטוף את דגימות הרקמה שלוש פעמים PBS לפחות 30 דקות לשטוף לפני העברת הדגימות 02% נתרן אזיד ב PBS בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש ברטט שנקבע לקצב הזנת להב של 0.3 עד 0.5 מילימטרים לשנייה כדי לחלק את הרקמות לחלקים בעובי של מילימטר אחד. אחסנו את החלקים ב-02% נתרן אזיד טרי ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס.עבור טיפול מקדים מתנול לטבול את הדגימות בסדרה מתנול עולה כפי שצוין במשך שעה אחת לכל דגירה בטמפרטורת החדר עם תנודות עדינות. לאחר הדגירה האחרונה לקרר את הדגימות לארבע מעלות צלזיוס. החליפו את ה-100% מתנול בארבעה מיליליטר של תותב הלבנה מקורר מראש עבור דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר תחליף את תסכולת ההלבנה בארבעה מיליליטר של מתנול טרי של 80% עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. ואז לטבול את הדגימות בסדרה יורדת של מתנול הפוך של מה שהוכח רק, לשטוף את הדגימות פעם אחת במשך שעה אחת בארבעה מיליליטר של PBS לאחר טבילה 20% מתנול. לכשל חיסוני של חלקי רקמת המוח לשטוף את הדגימות פעמיים במשך שעה אחת בארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS, ואחריו permeabilization במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס בארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 20% dimethyl sulfoxide, ו 0.3חסום כל כריכה לא ספציפית עם ארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10%dimethyl sulfoxide, ו 6% סרום נורמלי PBS במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף דגירה חסימה תווית הדגימות עם שני מיליליטר של פתרון נוגדנים ראשוני במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, רענון פתרון הנוגדן לאחר יומיים וחצי. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות ליום אחד בארבעה מיליליטר של 0.2%Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS החלפת מאגר לשטוף לפחות ארבע עד חמש פעמים במהלך היום ולהשאיר את הכביסה הסופית על לילה.למחרת, להדגיר את הדגימות בשני מיליליטר של פתרון נוגדנים משני במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות בארבעה מיליליטר של טרי 0.2%Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS כפי שהוכח. עבור כתמים גרעיניים של הדגימות להדגיר את הדגימות בארבעה מיליליטר של כתם חומצת הגרעין TO-PRO-3 במשך חמש שעות מוגן מפני אור.בסוף הדגירה לשטוף את הדגימות ב 0.2% Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS כפי שהוכח, ואחריו התייבשות בסדרה עולה tert-butanol במשך שעתיים לטבילה. לאחר טבילה 90%להעביר את הדגימות 96%tert-butanol פתרון לילה. למחרת בבוקר, לייבש את הדגימות עוד יותר ב 100% tert-butanol במשך שעתיים לפני ניקוי חלקי הרקמה ב BABB-D15 מוכן טרי במשך שעתיים עד שש שעות עד שהם שקופים אופטית.לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות ב BABB-D15 מוגן מפני אור עד הרכבה והדמיה שלהם. להרכבה לדוגמה, השתמש במדפסת תלת-ממד להדפסת תא דימות ומכסה. הר קוטר של 30 מילימטר מכסה על תא ההדמיה עם טמפרטורת חדר של רכיב אחד וולקניזציה גומי סיליקון.באופן דומה, הר כיסוי 22 מילימטר על המכסה. השתמש ספוגית כותנה רטובה במים כדי להסיר את גומי סיליקון עודף על שתי הטבעות לפני המאפשר גומי לרפא בן לילה. למחרת, מניחים דגימה בתא ההדמיה ומוסיפים נפח קטן של BABB-D15 לתא לפני החדרת המכסה.באמצעות מחט hypodermic למלא את התא עם BABB-D15 דרך inlet ולחבר את inlet לפני איטום תא ההדמיה עם גומי סיליקון. כדי להגדיר את רכישת התמונה בחר את קווי הלייזר המתאימים עבור הפלואורופורים המשמשים, והתאם את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפה בין ערוצים. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה כדי למצוא את הגבול העליון והתחתון של מחסנית Z ולרכוש את מחסנית התמונות.ליצירת הקרנות תלת-מימדיות של ערימת התמונות, פתחו את קובצי התמונה בפיג'י ובחרו 'כלי ערוצי צבע תמונה עוד' ו'פיצול ערוצים' כדי לפצל את התמונות הממוזגות לערוצים בודדים. לתיקון אקונומיקה של התמונות, לכל ערוץ בחרו 'התאמת תמונה לתיקון אקונומיקה' ובחרו 'יחס פשוט'. השתמשו במ המחוונים להתאמת הבהירות והניגודיות של כל ערוץ, ובחרו 'צבע תמונה' ו'מזג ערוצים'.סמן את האפשרות צור ללא הפרדות צבע. המירו את התמונה לתבנית RGB ובחרו 'ערימות תמונה' ו'פרוייקט תלת-מימדי' ליצירת הקרנה תלת-מימדית. בחרו 'הנקודה הבהירה ביותר' כשיטה 'הקרנה' והגדירו את מרווח הפרוסה כך שיתאימו לגודל שלב Z של מחסנית התמונה שנרכשה.לקבלת איכות מרבית, הגדר את תוספת זווית הסיבוב לאחת והפוך את האינטרפולציה לזמינה. שנה את הסיבוב הכולל, את ספי השקיפות ואת האטימות לפי הצורך. לאחר מכן שמרו את ההקרנה תלת-מימדית הן בתבניות קובץ tiff והן בתבניות קובץ AVI.באמצעות immunostaining של וירוס כלבת phosphoprotein שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים ניתן לדמיין בחלקים עבים של דגימות רקמת המוח של העכבר. לאחר מכן, ניתן לשחזר הקרנות תלת-מימד חלקות של ערימות התמונות שנרכשו. בגלל הרזולוציה הגבוהה שבה ערימות התמונה נרכשות, ניתן להעריך את הזיהום עד לרמת תא יחיד, המאפשרת קביעות על, למשל, שפע והפצה של אנטיגן בתוך תא מעניין.בנוסף לרקמת המוח של העכבר, ניתן ליישם את הפרוטוקול על דגימות רקמת מוח ממין אחר של בעלי חיים. לדוגמה, קטעים המתקבלים מתאים שונים של מוח חמוס נגוע חושפים דרגה משתנה של זיהום בנגיף הכלבת. אסטרוציטים ניתן להבדיל באמצעות ביטוי של חלבון חומצה פוליברילית גליה בעוד neurites יכול להיות מוכתם במיוחד עבור חלבון הקשורים microtubule II.בו זמנית, חלבונים ויראליים יכולים להיות מוכתמים במשותף כדי להעריך את הקשר בין התאים הנגועים ואת subpopulation הסלולר מודגש.עבור immunostaining הבחירה של נוגדנים כדי לזהות את החלבונים של עניין הוא חיוני. בעוד ריכוזי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים הם לעתים קרובות נקודת התחלה טובה, נוגדנים מסוימים עשויים להזדקק להתאמה נוספת. רבים מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה יש תכונות מזיקות.לנהל את הניסוי בהתאמה ברדס אדים לובש ציוד מגן אישי מתאים כולל חלוק מעבדה וכפפות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

דגמי Zika בנגיף של ה בפיתוח המוח האנושי במבחנה באמצעות תאי גזע נגזר Organoids מוחי

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...