Name: high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

著者は、トーマス・C・メッテンライターとヴェレナ・テ・カンプが原稿を批判的に読んでくれたことに感謝しています。この研究は、メクレンブルク西部ポメラニア連邦優秀イニシアティブと欧州社会基金(ESF)グラント・コインフェクット(ESF/14-BM-A55-0002/16)およびリッサウイルスに関する内部共同研究助成金によって支援されました。フリードリヒ・ローフラー研究所(Ri-0372)。

RABV感染、PFA固定アーカイブ脳材料が使用された。それぞれの動物実験研究は、メクレンブルク西部ポメラニア(LALFF M-V)の農業、食品安全、漁業のための国家オフィスの責任ある動物のケア、使用、倫理委員会によって評価され、許可を得て承認を得ました。7221.3-2.1-002/11 (マウス) および 7221.3-1-068/16 (フェレット)。動物実験で使用される一般的なケアおよび方法は、承認されたガイドラインに...

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	<li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction.">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Dodt, H. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+types.">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Fooks, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens.">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry.">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li><li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters.">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li></ol>

近年の組織浄化技術の復活とさらなる発展2,3,4,5,6,7,8,9,10歳,11歳,12歳,13歳,<sup clas...

従来の組織学の技術は、主に複雑な3D環境に2D洞察しか提供できない臓器組織の薄い部分に依存しています。原理的には実現可能ですが、シリアルシンセクションからの3D再構成は、取得した画像1のシリコアライメントのスライスおよびその後の両方に対して、厳しい技術的パイプラインを必要とします。さらに、マイクロトームスライス後のZボリュームのシームレスな再構成は、非重なり合う画像平面、染色バリエーション、物理的な画像登録によって引き起こされる最適でない画像登録のために、機械的および計算的なアーティファクトの両方が残る可能性があるため、重要です。例えば、マイクロトームブレードによる組織の破壊。対照的に、無傷の厚い組織サンプルの純粋な光学スライスは重なり合うイメージ平面の獲得(オーバーサンプリング)を可能にし、それによって、3D再建を促進する。これは、複雑な細胞集団(例えば、周囲のグリア細胞および免疫細胞の文脈における神経ネットワーク)における感染プロセスの分析に非常に有益である。しかしながら、厚い組織切片の固有の障害は、組織への光散乱および限られた抗体の浸透を含む。近年、これらの問題を克服するために様々な技術が開発され、最適化されています2,3,4,5,6,7,8,9,10歳,11歳,12歳,13.本質的に、標的組織は、水性2、3、4、5、6、7のいずれかの治療によって光学的に透明に変わる 、8、9または有機溶媒ベースの10、11、12、13溶液。3DISCO(溶媒クリア臓器の3Dイメージング)11、12およびその後継uDISCO(溶媒クリア臓器の究極の3Dイメージング)13の導入は、比較的高速でシンプルで安価なツールを提供しました。優秀なクリアリング機能。クリアリングプロトコルの主な構成要素は、有機溶媒テルトブタノール(TBA)、ベンジルアルコール(BA)、ベンジル安息香酸ベンゾエート(BB)、およびジフェニルエーテル(DPE)です。iDISCO(溶媒クリア臓器の免疫標識可能な3Dイメージング)14の開発と添加は、互換性のある免疫染色プロトコルであり、既存の方法に対する別の利点を構成し、抗原の深部組織標識を可能にした関心のあるだけでなく、免疫染色サンプルの長期保存。したがって、iDISCO14とuDISCO13の組み合わせは、従来のCLSMを使用して、大きな組織切片(最大1mm)における抗体標識タンパク質の高解像度イメージングを可能にします。
すべての次元で臓器の複雑な構造の保存は、脳組織のために特に重要です。ニューロンは、その神経突起に基づいて非常に多様な3D形態を有する非常に不均一な細胞サブ集団を含む(マスランド15によってレビュー)。さらに、脳は多数のコンパートメントおよびサブコンパートメントから構成され、それぞれがグリア細胞およびニューロンを含む異なる細胞細胞亜集団およびその比率で構成される(von Bartheld et al.16によるレビュー)。神経型ウイルスとして、狂犬病ウイルス(RABV、Fooks et al.17によってレビュー)は、主にニューロンに感染し、その輸送機械を使用して、感染の一次部位から中枢神経系(CNS)に軸方向に沿って移動する。ここで説明するプロトコル(図1A)は、感染した脳組織から得られる大きな一貫性のある画像スタックにおけるRABVおよびRABV感染細胞の免疫染色支援検出および可視化を可能にする。これにより、感染環境の公平な3D高解像度評価が可能になります。これは、様々な種からの脳組織に適用可能であり、固定後、またはパラホルムアルデヒド(PFA)中のサンプルの長期保存後に行うことができ、数ヶ月間染色およびクリアされたサンプルの保存および再画像化を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">41218</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">BB6630-500ML</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4720.2</td>
			<td style="width:297px;">Various buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Diphenyl ether</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">240834-100G</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">DL-&#945;-Tocopherol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">A17039</td>
			<td style="width:297px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:160px;">C06SBZ</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycine</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3908.2</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Goat serum</td>
			<td style="width:119px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">S26-100ML</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">7692.1</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrogen peroxide solution (30 %)</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">8070.2</td>
			<td style="width:297px;">Sample bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Methanol</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4627.4</td>
			<td style="width:297px;">Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">0335.3</td>
			<td style="width:297px;">Crystalline powder to make fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">K305.1</td>
			<td style="width:297px;">Prevention of microbial growth in stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">tert-Butanol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">33278</td>
			<td style="width:297px;">Sample dehydration for tissue clearing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:160px;">T3605</td>
			<td style="width:297px;">Nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3051.2</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">AppliChem</td>
			<td style="width:160px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:119px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:160px;">0030119401</td>
			<td style="width:297px;">Sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 22 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111620</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 30 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111700</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hypodermic needle (27 G x &#190;&#8221; [0.40 mm x 20 mm])</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:160px;">4657705</td>
			<td style="width:297px;">Filling of the imaging chamber with clearing solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">RTV-1 silicone rubber</td>
			<td style="width:119px;">Wacker</td>
			<td style="width:160px;">Elastosil E43</td>
			<td style="width:297px;">Adhesive for the assembly of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Ultimaker CPE 2.85 mm transparent</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">8718836374869</td>
			<td style="width:297px;">Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Technical equipment and software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">3D printer</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">Ultimaker 2+</td>
			<td style="width:297px;">Printing of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Automated water immersion system</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15640019</td>
			<td style="width:297px;">Software-controlled water pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">Elmi</td>
			<td style="width:160px;">DOS-20M</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker, heated</td>
			<td style="width:119px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:160px;">G24 Environmental Shaker</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at 37 &#176;C (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">DMI 6000 TCS SP5</td>
			<td style="width:297px;">Inverted confocal microscope for sample imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Fiji</td>
			<td style="width:119px;">NIH (ImageJ)</td>
			<td style="width:160px;">open source software (v1.52h)</td>
			<td style="width:297px;">Image processing package based on ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Long working distance water immersion objective</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15506360</td>
			<td style="width:297px;">HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vibratome</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">VT1200S</td>
			<td style="width:297px;">Sample slicing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Workstation</td>
			<td style="width:119px;">Dell</td>
			<td style="width:160px;">Precision 7920</td>
			<td style="width:297px;">CPU: Intel Xeon Gold 5118 
			GPU: Nvidia Quadro P5000 
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 
			SSD: 2 TB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:251px;">Goat anti-RABV N</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-GFAP</td>
			<td style="width:119px;">Dako</td>
			<td style="width:160px;">Z0334</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-MAP2</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:160px;">ab32454</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) 
			Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:251px;">Rabbit anti-RABV P 160-5</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) 
			Dilution: 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue

免疫標識による組織や臓器の感染過程の可視化は、現代の感染生物学における重要な方法である。臓器組織内の病原体の分布、栄養学、および豊富さを観察し、研究する能力は、疾患の発症と進行に関する重要なデータを提供します。従来の顕微鏡検査法を用いて、免疫標識は、パラフィン埋め込みまたは凍結サンプルから得られる薄いセクションに主に制限される。しかし、これらの薄い部分の限られた2D画像面は、感染した器官の複雑な構造および感染の細胞コンテキストに関する重要な情報の喪失につながる可能性がある。現代の多色、免疫染色互換組織クリアリング技術は、ウイルスに感染した臓器組織の大量の3D画像スタックを研究するための比較的高速かつ安価な方法を提供します。組織を有機溶媒にさらすことで、光学的に透明になります。これはサンプルの屈折率指数と一致し、最終的には光散乱の大幅な減少につながります。従って、長い自由な働く間隔の目的と組み合わせて、サイズの1 mmまでの大きいティッシュセクションは高リゾリューションの慣習的な共焦点レーザースキャン顕微鏡(CLSM)によってイメージ化することができる。ここでは、ウイルス病因、広がり、トロピズム、神経侵襲などのトピックを研究するために、感染した脳における狂犬病ウイルス分布を可視化するために、組織クリア後に深部組織イメージングを適用するプロトコルについて説明する。

iDISCO14およびuDISCO13の組み合わせは高リゾリューションCLSMと結合され、脳組織および周囲の細胞文脈のRABV感染の時空間的な決断および可塑性に深い洞察を提供する。
RABVリンタンパク質(P)の免疫染色を用いて、感染した神経細胞の複雑な層をマウス脳の厚い部分で可視化することができる(図3)。その後、取得した?...

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High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

溶媒除去された器官の究極の3Dイメージングのような新しい、免疫染色互換組織クリアリング技術は、狂犬病ウイルス脳感染症とその複雑な細胞環境の3D可視化を可能にします。厚い、抗体標識された脳組織スライスは、画像深さを高め、共焦点レーザー走査顕微鏡による3D解析を可能にするために光学的に透明に作られています。

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

このプロトコルは、ウイルス感染の可視化を可能にし、感染環境とその周囲の細胞のコンテキストの時空間的な解決に深い洞察を提供します。深部組織イメージングへの免疫染色の適用性は、ウイルスの検出を可能にするだけでなく、実際にそれぞれの細胞マーカーを用いて様々な細胞亜集団の分化を可能にする。免疫染色のための組織を固定するには、脳サンプルをPBSの4%パラホルムアルデヒドの1〜10の比率に入れ、4°Cで少なくとも48時間組織体積をサンプリングする。固定期間の終わりに、4°CでPBSの02%ナトリウムアジドにサンプルを移す前に、洗浄ごとに少なくとも30分間PBSで組織サンプルを3回洗浄します。その後、0.3〜0.5ミリメートル/秒のブレード供給速度に設定されたビブラートメを使用して、組織を1ミリメートルの厚いセクションに切り離します。新鮮な02%ナトリウムアジドで4度のPBSでセクションを保存します。メタノール前処理の場合、穏やかな振動で室温でインキュベーションごとに1時間示されるように、上昇メタノールシリーズにサンプルを浸します。最後のインキュベーションの後、サンプルを摂氏4度に冷却します。100%メタノールを4ミリリットルの冷やした漂白液に置き換え、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、漂白液を新鮮な80%メタノールの4ミリリットルに置き換え、室温で1時間インキュベーションします。次に、サンプルを示したものと逆にメタノールの降順シリーズに浸し、20%メタノール浸漬後にPBSの4ミリリットルで1時間ずつサンプルを洗浄する。脳組織切片の免疫染色では、PBSで0.2%トリトンX-100の4ミリリットルで1時間サンプルを2回洗浄し、続いて0.2%トリトンX-100、20%ジメチルスルホキシド、および0.3モルグリシンで摂氏37度で2日間パーメアビライゼーションを行う。4ミリリットルの0.2%トリトンX-100、10%ジメチルスルホキシド、および6%正常血清をPBSで37°Cで2日間ブロックします。ブロッキングインキュベーションの最後に、サンプルを摂氏37度で5日間一次抗体溶液の2ミリリットルで標識し、2日後および1/2日後に抗体溶液をリフレッシュする。次に、PBSで0.2%Tween 20と10マイクログラムの4ミリリットルで1日のサンプルを洗浄し、一日の間に少なくとも4〜5回洗浄バッファーを交換し、最後の洗浄を一晩残します。翌日、2ミリリットルの二次抗体溶液でサンプルを摂氏37度で5日間インキュベートします。次に、サンプルをPBSで新鮮な0.2%Tween 20と10マイクログラムの新鮮な0.2%Tween 20と10マイクログラムで洗浄します。サンプルの核染色のために、核酸染色TO-PRO-3の4ミリリットルのサンプルを光から保護して5時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、サンプルを0.2%Tween 20および10マイクログラムでPBSで1ミリリットルヘパリンで洗浄し、続いて浸漬ごとに2時間上昇するtert-ブタノール系列で脱水を行う。90%浸漬後、サンプルを一晩で96%tert-ブタノール溶液に移します。翌朝、サンプルをさらに100%tert-ブタノールでさらに2時間脱水し、調製したばかりのBABB-D15の組織切片を光学的に透明になるまで2〜6時間クリアする。サンプルは、その取り付けおよびイメージングまで光から保護されたBABB-D15に保存することができます。サンプル取り付け用に、3Dプリンタを使用してイメージングチャンバーと蓋を印刷します。直径30ミリのカバースリップを、シリコンゴムを加硫させた1成分の室温で撮像チャンバーに取り付けます。同様に、蓋に22ミリメートルのカバースリップを取り付けます。水を濡らした綿棒を使用して、両方のリングに余分なシリコーンゴムを取り除き、ゴムを一晩硬化させます。翌日、サンプルを撮像チャンバーに入れ、蓋を挿入する前に少量のBABB-D15をチャンバに加えます。皮下注射針を使用して、入口を通してBABB-D15でチャンバーを満たし、シリコンゴムでイメージングチャンバーを密封する前に入口を差し込みます。画像取得を設定するには、使用するフルオロフォアに適したレーザーラインを選択し、各検出器の検出範囲を調整して、チャンネル間の信号の重複を防ぎます。次に、取得パラメータを設定して Z スタックの上下境界を見つけ、イメージ スタックを取得します。画像スタックの3Dプロジェクションを生成するには、フィジーで画像ファイルを開き、画像カラーチャンネルツールその他とチャンネルを分割して、マージされた画像を個々のチャンネルに分割します。画像の漂白補正の場合、チャンネルごとに[画像調整][ブリーチ補正]を選択し、[単純な比率]を選択します。各チャンネルの明るさとコントラストを調整するには、スライダを使用して、[画像の色] と [チャンネルの結合] を選択します。[コンポジットを作成]オプションにチェックマークを付けます。画像を RGB 形式に変換し、[イメージ スタック] と [3D プロジェクト] を選択して 3D 投影を生成します。プロジェクション方法として[最も明るい点]を選択し、取得したイメージ スタックの Z ステップ サイズに合わせてスライス間隔を設定します。最大品質の場合は、回転角度の増分を 1 に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、合計回転、透明度のしきい値、不透明度を変更します。次に、3D 投影を tiff ファイル形式と AVI ファイル形式の両方として保存します。狂犬病ウイルスホスホ蛋白質複合体層の感染した神経細胞の免疫染色を使用して、マウス脳組織サンプルの厚いセクションで可視化することができる。その後、取得した画像スタックのシームレスな3D投影を再構築することができます。画像スタックが獲得される高分解能のため、感染は単一の細胞レベルまで評価することができ、例えば、関心のある細胞内の抗原の豊富さと分布に関する主張を可能にする。マウスの脳組織に加えて、プロトコルは、他の動物種からの脳組織サンプルに適用することができる。例えば、感染したフェレット脳の異なる区画から得られたセクションは、狂犬病ウイルス感染の様々な程度を明らかにする。アストロサイトはグリアフィブリラリー酸タンパク質の発現を介して分化することができ、一方、神経突起は微小管関連タンパク質II.に特異的に染色することができ、同時に、ウイルスタンパク質は、感染細胞と強調された細胞の部分集団との関係を評価するために共染色することができる。免疫染色のために目的のタンパク質を検出する抗体の選択は非常に重要です。標準的な免疫組織化学の濃度は、多くの場合、良い出発点であるが、いくつかの抗体は、追加の調整が必要な場合があります。このプロトコルで使用される化学物質の多くは、有害な特性を有する。ラボコートや手袋など、適切な個人用保護具を着用したヒュームフードでそれぞれの実験を行います。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

人間の中脳の高解像度機能的磁気共鳴画像法

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

高解像度<em&gt;インビボ</em&gt; 3T磁気共鳴画像を用いたヒト海馬サブフィールドのためのマニュアルセグメンテーションプロトコル

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

ヒト皮質下の高分解能構造磁気共鳴イメージング<I&gt;インビボ</I&gt;と死後

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

脳オルガノイドを派生開発人間の脳の培養幹細胞を使用してジカ ウイルス感染症をモデル化

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...