Name: high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue at JoVE.com

저자들은 토마스 C. 메텐라이터와 베레나 테 캄프가 원고를 비판적으로 읽어 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 메클렌부르크 서부 포메라니아의 연방 우수 이니셔티브와 유럽 사회 기금 (ESF) 그랜트 KoInfekt (ESF/ 14-BM-A55-0002/16)와 에서 Lyssaviruses에 대한 교내 공동 연구 보조금에 의해 지원되었다 프리드리히 로플러 연구소 (리-0372).

RABV-감염, PFA 고정 보관 된 뇌 물질을 사용 하 고 있습니다. 각각의 동물 실험 연구는 메클렌부르크 서부 포메라니아(LALFF M-V)의 농업, 식품 안전 및 어업관리국의 책임있는 동물 관리, 사용 및 윤리 위원회에 의해 평가되었으며 허가를 받았습니다. 7221.3-2.1-002/11(마우스) 및 7221.3-1-068/16(페렛). 동물 실험에 사용된 일반적인 관리 및 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었다.
주의: ?...

<ol>
	<li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction.">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging.">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+types.">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies.">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consultation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , (2018).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).</li><li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens.">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry.">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li><li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters.">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li></ol>

최근 몇 년 동안 조직 정리 기술의부활과 추가 개발 2, 3,4,5,6,7,8, 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13세</...

전통적인 조직학 기술은 주로 복잡한 3D 환경에 대한 2D 통찰력만 제공할 수 있는 장기 조직의 얇은 부분에 의존합니다. 원칙적으로 가능하지만, 직렬 얇은 섹션에서 3D 재구성은 획득 한 이미지의 실리코 정렬에슬라이스 및 후속 모두 까다로운 기술 파이프 라인을 필요로1 . 또한, 마이크로토임 슬라이싱 후 z-volumes의 원활한 재구성은 비오버랩 이미지 평면, 염색 변형 및 물리적으로 인한 최적이 아닌 이미지 등록으로 인해 기계적 및 계산 적 아티팩트가 모두 남아 있기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 마이크로토메 블레이드에 의해 조직의 파괴. 대조적으로, 그대로 두꺼운 조직 샘플의 순수한 광학 슬라이스는 중첩 이미지 평면 (오버 샘플링)의 수집을 허용하고, 따라서, 3D 재구성을 용이하게한다. 이것은, 차례로, 복잡한 세포 집단에 있는 감염 프로세스의 분석을 위해 높게 유리합니다 (예를 들면, 주변 신경교 및 면역 세포의 맥락에서 신경 세포). 그러나, 두꺼운 조직 단면도의 내재된 장애물은 조직으로 광 산란 및 제한된 항체 침투를 포함합니다. 최근에는이러한문제를 극복하기 위해 다양한 기술이 개발되고 최적화되어 2, 3,4,5,6,7,8 , 9개 , 10개 , 11세 , 12세 , 13. 본질적으로 대상 조직은수성2,3,4,5,6및7로 처리하여 광학적으로 투명하게 바뀌습니다. ,8,9 또는 유기 용매 기반10,11,12,13 솔루션. 3DISCO (용매 클리어 기관의 3D 이미징)11,12 및 그 후속 uDISCO (용매 클리어 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징)13의 도입은 상대적으로 빠르고 간단하고 저렴한 도구를 제공 우수한 클리어링 기능. 클리어링 프로토콜의 주요 성분은 유기 용매 테르트-부탄올(TBA), 벤질 알코올(BA), 벤질 벤조에이트(BB), 및 디페닐 에테르(DPE)이다. iDISCO(용매 클리어란의 면역표지 지원 3D 이미징)의 개발 및 추가14,호환 가능한 면역 염색 프로토콜은 기존 방법에 비해 또 다른 장점을 구성하고 항원의 심부 조직 라벨링을 가능하게 하였다. 면역 염색 된 샘플의 장기 저장뿐만 아니라 관심의. 따라서, iDISCO14 와 uDISCO13의 조합은 기존의 CLSM을 사용하여 큰 조직 섹션 (최대 1mm)에서 항체 표지 단백질의 고해상도 이미징을 허용합니다.
모든 3 차원에서 장기의 복잡 한 구조의 보존은 뇌 조직에 대 한 특히 중요 하다. 뉴런은 그들의 신경질적 투영에 기초하여 매우 다양한 3D 형태학을 가진 매우 이질적인 세포 하위 집단을 포함한다 (Masland15에의해 검토됨). 더욱이, 뇌는 신경교 세포 및 뉴런을 포함하는 상이한 세포 소집단 및 비율로 각각 구성된 다수의 구획 및 하위구획으로 구성된다(폰 바르톨드 등 16). 신경 트로픽 바이러스로서, 광견병 바이러스 (RABV, Fookset al. 17)는 주로 뉴런을 감염시키고, 그들의 수송 기계를 사용하여 감염의 기본 부위에서 중추 신경계 (CNS)로 의 축삭을 따라 역행 방향으로 여행합니다. 여기서 설명된 프로토콜(도1A)은 감염된 뇌 조직으로부터 수득된 크고 일관된 이미지 스택에서 RABV 및 RABV 감염 세포의 면역 염색 보조 검출 및 시각화를 허용한다. 이를 통해 감염 환경에 대한 편견없는 3D 고해상도 평가를 가능하게 합니다. 다양한 종으로부터의 뇌 조직에 적용 가능하며, 고정 직후 또는 파라포름알데히드(PFA)에서 시료를 장기간 보관한 후 즉시 수행할 수 있으며, 수개월 동안 염색 및 시료의 저장 및 재이미징을 허용한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">41218</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">BB6630-500ML</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4720.2</td>
			<td style="width:297px;">Various buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Diphenyl ether</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:160px;">240834-100G</td>
			<td style="width:297px;">Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">DL-&#945;-Tocopherol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">A17039</td>
			<td style="width:297px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Donkey serum</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:160px;">C06SBZ</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glycine</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3908.2</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Goat serum</td>
			<td style="width:119px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">S26-100ML</td>
			<td style="width:297px;">Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">7692.1</td>
			<td style="width:297px;">Background reduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrogen peroxide solution (30 %)</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">8070.2</td>
			<td style="width:297px;">Sample bleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Methanol</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">4627.4</td>
			<td style="width:297px;">Sample pretreatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">0335.3</td>
			<td style="width:297px;">Crystalline powder to make fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">K305.1</td>
			<td style="width:297px;">Prevention of microbial growth in stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">tert-Butanol</td>
			<td style="width:119px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:160px;">33278</td>
			<td style="width:297px;">Sample dehydration for tissue clearing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:160px;">T3605</td>
			<td style="width:297px;">Nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:160px;">3051.2</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tween 20</td>
			<td style="width:119px;">AppliChem</td>
			<td style="width:160px;">A4974,0500</td>
			<td style="width:297px;">Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:119px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:160px;">0030119401</td>
			<td style="width:297px;">Sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 22 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111620</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Coverslip, circular (diameter: 30 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:160px;">0111700</td>
			<td style="width:297px;">Part of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hypodermic needle (27 G x &#190;&#8221; [0.40 mm x 20 mm])</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:160px;">4657705</td>
			<td style="width:297px;">Filling of the imaging chamber with clearing solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">RTV-1 silicone rubber</td>
			<td style="width:119px;">Wacker</td>
			<td style="width:160px;">Elastosil E43</td>
			<td style="width:297px;">Adhesive for the assembly of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Ultimaker CPE 2.85 mm transparent</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">8718836374869</td>
			<td style="width:297px;">Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Technical equipment and software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">3D printer</td>
			<td style="width:119px;">Ultimaker</td>
			<td style="width:160px;">Ultimaker 2+</td>
			<td style="width:297px;">Printing of imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Automated water immersion system</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15640019</td>
			<td style="width:297px;">Software-controlled water pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">Elmi</td>
			<td style="width:160px;">DOS-20M</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Benchtop orbital shaker, heated</td>
			<td style="width:119px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:160px;">G24 Environmental Shaker</td>
			<td style="width:297px;">Sample incubation at 37 &#176;C (~ 150 rpm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">DMI 6000 TCS SP5</td>
			<td style="width:297px;">Inverted confocal microscope for sample imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Fiji</td>
			<td style="width:119px;">NIH (ImageJ)</td>
			<td style="width:160px;">open source software (v1.52h)</td>
			<td style="width:297px;">Image processing package based on ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Long working distance water immersion objective</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">15506360</td>
			<td style="width:297px;">HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vibratome</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">VT1200S</td>
			<td style="width:297px;">Sample slicing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:251px;">Workstation</td>
			<td style="width:119px;">Dell</td>
			<td style="width:160px;">Precision 7920</td>
			<td style="width:297px;">CPU: Intel Xeon Gold 5118 
			GPU: Nvidia Quadro P5000 
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 
			SSD: 2 TB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:251px;">Goat anti-RABV N</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N 
			Dilution: 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-GFAP</td>
			<td style="width:119px;">Dako</td>
			<td style="width:160px;">Z0334</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) 
			Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Rabbit anti-MAP2</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:160px;">ab32454</td>
			<td style="width:297px;">Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) 
			Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:251px;">Rabbit anti-RABV P 160-5</td>
			<td style="width:119px;">Friedrich-Loeffler-Institut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;">Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) 
			Dilution: 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:297px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">depending on conjugated fluorophore</td>
			<td style="width:297px;">Highly cross-absorbed 
			Dilution: 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution 3d imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue

면역 표지에 의한 조직 및 기관의 감염 과정의 시각화는 현대 감염 생물학의 핵심 방법입니다. 장기 조직의 내부 병원체의 분포, 트로피즘 및 풍부를 관찰하고 연구하는 능력은 질병 발달과 진행에 대한 중추적 인 데이터를 제공합니다. 기존의 현미경 검사법을 사용하여, 면역 표지는 주로 파라핀 임베디드 또는 냉동 샘플에서 얻은 얇은 단면으로 제한됩니다. 그러나, 이 얇은 단면도의 한정된 2D 심상 평면은 감염한 기관의 복잡한 구조 및 감염의 세포 문맥에 중요한 정보의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 현대다색, 면역염색 호환 조직 청산 기술은 이제 바이러스에 감염된 장기 조직의 대용량 3D 이미지 스택을 연구하는 비교적 빠르고 저렴한 방법을 제공합니다. 유기 용매에 조직을 노출시킴으로써 광학적으로 투명해집니다. 이는 샘플의 굴절 지수와 일치하며 결국 광 산란이 크게 감소합니다. 따라서, 긴 자유 작동 거리 목표와 함께, 최대 1mm 크기의 큰 조직 섹션은 고해상도에서 기존의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법(CLSM)에 의해 이미지화될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 바이러스 병인, 퍼짐, 트로피즘 및 신경 침략 같이 주제를 공부하기 위하여 감염된 두뇌에 있는 광견병 바이러스 분포를 구상하기 위하여 조직 정리 후에 심층 조직 화상 진찰을 적용하는 프로토콜을 기술합니다.

iDISCO14와 uDISCO13의 고해상도 CLSM 조합은 뇌 조직의 RABV 감염과 주변 세포 맥락의 시공간적 분해능과 가소성에 대한 깊은 통찰력을 제공합니다.
RABV 인단백질(P)의 면역염색을 사용하여, 감염된 뉴런 세포의 복잡한 층은 마우스 뇌의 두꺼운단면에서 가시화될 수 있다(그림 3). 이어서, 획득한 이미지 스택의 원활한 3D 프로...

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High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

이 프로토콜은 바이러스 감염의 시각화를 가능하게하고 감염 환경과 그 주변 세포 맥락의 현면 적 해결에 깊은 통찰력을 제공합니다. 심층 조직 이미징에 면역 스테인링의 적용성은 바이러스의 검출을 허용할 뿐만 아니라, 실제로는 각각의 세포 마커를 사용하여 다양한 세포 하위 집단의 분화를 가능하게 합니다. 면역 염색을 위한 조직을 고치기 위하여는 4섭씨에서 적어도 48 시간 동안 조직 부피를 샘플링하기 위하여 PBS에 있는 4%paraformaldehyde의 1 1 10 비율에 두뇌 견본을 두는.고정 기간이 끝나면 PBS에서 3회 이상 세척한 후 4°C에서 PBS에서 02%의 나트륨 아지드로 샘플을 이송한다. 그런 다음 초당 0.3 ~ 0.5 밀리미터로 설정된 진동체를 사용하여 조직을 1밀리미터 두께의 섹션으로 섹션화합니다. PBS에서 신선한 02% 나트륨 아지드에 섹션을 섭씨 4도에 저장합니다.메탄올 전처리를 위해 부드러운 진동으로 실내 온도에서 인큐베이션 당 1 시간 동안 표시된 대로 오름차순 메탄올 시리즈에 샘플을 담그면 됩니다. 마지막 인큐베이션 후 샘플을 섭씨 4도로 냉각시합니다. 100% 메탄올을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식할 수 있도록 미리 냉각된 표백 용액 4밀리리터로 교체하십시오.다음날 아침 표백 액액을 실온에서 1시간 동안 신선한 80%메탄올 4밀리리터로 대체합니다. 그런 다음 방금 시연된 메탄올의 내림차순 에 샘플을 담그고, 20%의 메탄올 침수 후 PBS의 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 한 번 세척합니다. 뇌조직 섹션의 면역염색을 위해 PBS에서 0.2%트리톤 X-100의 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 2회 세척하고, 2일간 37도에서 37도의 투과를 4밀리리터에서 0.2%트리톤 X-100, 20%디메틸 황산화물, 0.3°C의 글리티로 세척한다.섭씨 37도에서 2일 동안 PBS에서 0.2%트리톤 X-100, 10%디메틸 설프리산화물, 6%의 일반 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서 37섭씨에서 5일 동안 2밀리리터의 1차 항체 용액을 가진 시료를 2일 및 1/2일 후에 상쾌하게 한다. 다음으로, PBS에서 밀리리터 헤파린 당 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램의 4밀리리터로 하루 동안 샘플을 세척하여 하루 중 적어도 4~5회 세척 버퍼를 교환하고 밤새 최종 세척을 종료합니다.다음 날, 37섭씨에서 5일간 이차 항체 용액의 2밀리리터로 샘플을 배양한다. 그런 다음 PBS에서 밀리리터 헤파린 당 신선한 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램의 4밀리리터에서 샘플을 세척합니다. 시료의 핵 염색을 위해 빛으로부터 보호되는 5시간 동안 핵산 얼룩 TO-PRO-3의 4밀리리터에서 샘플을 배양한다.인큐베이션의 끝에서 PBS에서 밀리리터 헤파린 당 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램으로 샘플을 세척하고, 침지당 2시간 동안 오름차순 터트 부타놀 시리즈에서 탈수상태가 뒤따랐다. 90%의 침수 후 샘플을 하룻밤 동안 96% tert-butanol 용액으로 옮길 수 있습니다. 다음 아침, 샘플을 100% tert-butanol에서 2시간 동안 더 탈수한 후, 신선하게 준비된 BABB-D15의 조직 섹션을 광학적으로 투명해질 때까지 2~6시간 동안 제거합니다.그런 다음 샘플은 장착 및 이미징까지 빛으로부터 보호되는 BABB-D15에 저장할 수 있습니다. 샘플 마운팅의 경우 3D 프린터를 사용하여 이미징 챔버와 뚜껑을 인쇄합니다. 30mm 직경의 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하여 1성분 실온을 가압하는 실리콘 고무를 장착합니다.마찬가지로 뚜껑에 22mm 커버슬립을 장착합니다. 물에 젖은 면봉을 사용하여 두 링의 과도한 실리콘 고무를 제거한 후 고무가 하룻밤 동안 치료할 수 있도록 합니다. 다음 날, 이미징 챔버에 샘플을 놓고 뚜껑을 삽입하기 전에 챔버에 소량의 BABB-D15를 추가합니다.피하 바늘을 사용하여 입구를 통해 BABB-D15로 챔버를 채우고 실리콘 고무로 이미징 챔버를 밀봉하기 전에 입구를 연결합니다. 이미지 수집을 설정하려면 사용되는 형광에 적합한 레이저 라인을 선택하고 각 검출기의 검출 범위를 조정하여 채널 간의 신호 중첩을 방지합니다. 그런 다음 획득 매개 변수를 설정하여 Z 스택의 상하 경계를 찾아 이미지 스택을 획득합니다.이미지 스택의 3D 프로젝션을 생성하려면 피지의 이미지 파일을 열고 이미지 컬러 채널 도구 자세히 선택하고 채널을 분할하여 병합된 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 이미지의 표백제 보정을 위해 각 채널에 대해 이미지 조정 표백제 보정을 선택하고 간단한 비율을 선택합니다. 슬라이더를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정하고 이미지 색상 및 병합 채널을 선택합니다.옵션을 선택합니다 합성 만들기. 이미지를 RGB 형식으로 변환하고 이미지 스택 및 3D 프로젝트를 선택하여 3D 프로젝션을 생성합니다. 가장 밝은 점을 프로젝션 메서드로 선택하고 획득한 이미지 스택의 Z 단계 크기에 맞게 슬라이스 간격을 설정합니다.최대 품질의 경우 회전 각도를 하나로 설정하고 보간을 활성화합니다. 필요에 따라 총 회전, 투명도 임계값 및 불투명도를 수정합니다. 그런 다음 3D 프로젝션을 티프 및 AVI 파일 형식으로 저장합니다.광견병 바이러스 인포단백질 복합층의 면역염색을 사용하여 마우스 뇌 조직 샘플의 두꺼운 섹션에서 시각화할 수 있다. 그 후 획득된 이미지 스택의 원활한 3D 프로젝션을 재구성할 수 있습니다. 이미지 스택이 획득되는 고해상도 때문에, 감염은 단일 세포 수준까지 평가될 수 있으며, 예를 들어 관심 있는 세포 내의 항원의 풍부하고 분포에 대한 주장을 허용한다.마우스 뇌 조직 이외에, 프로토콜은 다른 동물 종의 뇌 조직 샘플에 적용 될 수있다. 예를 들면, 감염된 페렛 두뇌의 다른 구획에서 얻은 단면도광견 바이러스 감염의 다양한 정도를 드러냅니다. 성상세포는 신경교 섬유산 단백질의 발현을 통해 분화될 수 있으며, 중성염은 마이크로튜버-관련 단백질 II.동시에, 바이러스 성 단백질은 감염된 세포와 강조된 세포 하위 집단 사이의 관계를 평가하기 위해 공동 염색될 수 있다.관심 있는 단백질을 검출하기 위하여 항체의 선택을 면역 염색하는 것은 중요합니다. 표준 면역 히스토화학 농도는 종종 좋은 출발점이지만 일부 항체는 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 대부분은 유해한 특성을 가지고 있습니다.실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용 연기 후드에서 각각의 실험을 수행합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...