Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

该项目部分得到国家卫生研究院批准RO1 NS099409、NS075534和CONACYT 2012-037(S)副总裁的支持。

1. 准备
<ol><li>使用热的 25 G 针头在 100 mL 容量的三角塑料烧杯中打大约 50 个孔,准备飞笼(参见材料表)。</li>
	<li>准备 60 毫米 x 15 毫米培养皿,配苹果汁-琼脂(3% 琼脂和 30% 苹果汁)。</li>
	<li>通过混合干酵母颗粒和水来制备新鲜的酵母糊。将酵母糊涂在苹果琼脂板上以增加卵子的产卵。</li>
	<li>在CO2上麻醉大约50-60只苍蝇(使用大致相等数量的雄性和雌性),并将其放入苍蝇笼中。 ...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

该方法为分析发育过程中的重要胚胎行为提供了定量方法,如蠕动性肌肉收缩波,包括波周期、振幅和模式,以及波效应对胚胎滚动和姿势的影响。这在分析不同突变体时非常有用,可以研究特定基因在胚胎发育过程中调节这些和其他行为的作用。我们使用肌肉特异性GFP标记强度的变化来分析肌肉收缩幅度、频率和胚胎收缩波传播的方向。GFP 信号的这些变化反映了收缩的程度,因为收缩体段将更多的 GFP...

蠕动性肌肉收缩是一种有节奏的运动行为,类似于人类行走和游泳1,2,3。在果蝇晚期胚胎中看到的胚胎肌肉收缩就是这种行为的一个例子。果蝇是研究各种发育过程的优秀模型生物体,因为果蝇的胚胎发育特征良好,相对较短,易于监测。我们的方法的总体目标是仔细记录和分析胚胎肌肉收缩和放松的波浪状模式。我们使用一种简单、非侵入性的方法,提供肌肉收缩的详细可视化、记录和分析。这种方法还可用于研究其他体内过程,如在孵化前在晚期胚胎中看到的胚胎滚动。在以前的研究中,胚胎肌肉收缩主要根据频率和方向1、2进行分析。为了估计收缩的相对程度,因为它们沿着身体轴在前或后方向前进,我们使用了在肌肉中专门表达GFP的胚胎。这一分析提供了一个更定量的方法来分析肌肉收缩,并揭示在肌肉收缩的一系列蠕动波中,胚胎的身体姿势是如何维持的。
蠕动性肌肉收缩由中央模式发生器(CPG)回路和周围神经系统(PNS)、中枢神经系统(CNS)和肌肉4、5的神经元之间的通信控制。未能产生正常的蠕动性肌肉收缩可能导致缺陷,如孵化2和异常幼虫运动6,并可能指示神经异常。肌肉收缩蠕动波的实时成像和收缩表型的详细分析可以帮助发现与影响运动有关的肌肉和神经回路的遗传缺陷相关的致病机制。我们最近使用这种方法来研究机制,导致身体姿势扭转表型的p死神O-m annosylt兰斯芬酶(POMT)突变体7。
蛋白质O-mannosylation(POM)是一种特殊的翻译后修饰,其中单体糖被添加到丝氨酸或三角氨酸残留的分泌途径蛋白8,9。POM的遗传缺陷导致先天性肌肉萎缩症(CMD)在人类10,11,12。我们用果蝇作为模型系统调查了这些疾病的致病机制。我们发现,在果蝇蛋白O-mannos转酶基因POMT1和POMT2(又名旋转腹部(rt)和扭曲(tw)中发生突变的胚胎显示身体段的位移("旋转"),导致身体异常姿势7。有趣的是,这个缺陷与发育阶段相吻合,当时蠕动性肌肉收缩变得突出7。
由于POM突变胚胎的异常身体姿势是在肌肉和表皮已经形成,并且协调肌肉收缩的蠕动波已经开始时产生的,我们假设异常的身体姿势可能是异常肌肉的结果收缩,而不是肌肉或/和表皮形态的缺陷7。CMD可能与异常肌肉收缩和姿势缺陷13相关,因此,在果蝇POMT突变体中,对姿势表型的分析可以阐明与肌肉萎缩症相关的病理机制.为了研究果蝇POMT突变体的身体姿势表型与肌肉收缩蠕动波的可能异常之间的关系,我们决定使用活的成像方法。
我们对果蝇胚胎的蠕动收缩波的分析揭示了两种截然不同的收缩模式,被指定为1型和2型波。类型 1 波是从前波传播到后波的简单波,反之亦然。类型 2 波是在前端启动的双相波,在后方方向半传播,暂时停止,形成暂时静态收缩,然后,在第二阶段,被传播的蠕动收缩所席卷从后端向前。野生型胚胎通常产生一系列收缩,包括大约75%的1型和25%的2型2波。相反,POMT突变胚胎以大约相等的相对频率产生1型和2型波。
我们的方法可以提供详细的信息,定量分析肌肉收缩和胚胎滚动7。这种方法也可以用于分析涉及肌肉收缩的其他行为,如孵化和爬行。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

协调肌肉收缩是果蝇胚胎早期出现的节奏行为的一种形式。神经感官反馈电路需要控制此行为。未能产生有节奏的收缩模式可能表明神经异常。我们之前发现,蛋白质O-mannosylation的缺陷,一种翻译后蛋白质修饰,影响感觉神经元的斧头形态,并导致胚胎异常协调肌肉收缩。在这里,我们提出了一个相对简单的方法来记录和分析蠕动肌肉收缩的模式,通过活成像的晚期胚胎到孵化点,我们用它来描述蛋白质的肌肉收缩表型O-mannosyl转移酶突变体。从这些记录获得的数据可用于分析肌肉收缩波,包括频率、传播方向和不同身体段肌肉收缩的相对振幅。我们还检查了身体姿势,并利用在肌肉中专门表达的荧光标记,以准确确定胚胎中线的位置。类似的方法也可以用来研究发育过程中的各种其他行为,如胚胎滚动和孵化。

正常的蠕动肌肉收缩在电影1中显示在WT(野生型,广S)胚胎中。在我们的分析中,肌肉收缩蠕动波的平均频率为每小时47次收缩,平均振幅比WT胚胎的基线高出60%。影片 2 中为WT胚胎显示胚胎滚动,白色箭头标记气管的初始位置,黑色箭头表示背端附属项的位置。背端附属体(外部)不移动,而气管(内部)移动,表明胚胎在其壳内滚动
在分析肌肉收缩模式时,我...

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Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

果蝇胚胎肌肉收缩的实时成像和分析

在这里,我们提出一种以非侵入性和细节导向的方式记录果蝇胚胎胚胎肌肉收缩的方法。

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

此方法涉及如何分析发育过程，如肌肉收缩和滚动发生在果蝇胚胎。这种技术的一些优点是，它是非侵入性的，相当详细，但它是相对简单的执行。我们的方法可以进一步开发高含量分析为基础的筛选，以分离和分析影响胚胎肌肉收缩和其他发育过程的新突变。当可视化肌肉收缩时，正确时间胚胎收集很重要，因为收缩只在特定的发育阶段开始。分步可视化演示可以极大地帮助对开发过程的定量分析。对于安装的果蝇胚胎的活成像，将胚胎放在具有延时功能的荧光显微镜和带适当发射过滤器的数码相机的舞台上，并选择 10 倍水浸物的客观透镜。然后使用适当的显微镜记录软件录制胚胎的实时视频约一到两个小时，采集速率为每秒四帧。在实验结束时，将录制的视频直接导出到 ImageJ 中。选择图像和裁剪，围绕每个胚胎绘制一个框，将录像裁剪到每个胚胎的大小。单击"图像、变换"和"旋转"可旋转裁剪的图像，以实现胚胎中线相对于屏幕的垂直位置。要将距离测量设置为千分尺，请单击"分析"和"设置比例"，然后输入显微镜设置的已知像素到微米比率转换系数。然后，所有后续测量都将以千分尺为单位报告。要分析胚胎滚动，首先在视频的后端和前端中间的第一帧中标记胚胎的一个或两个气管的位置，然后单击"分析、工具和兴趣区域管理器"。在气管周围绘制大约七微米 x 7 微米的框，然后单击键盘上的 T 键以 XY 坐标记录此位置。标记兴趣的永久收缩后气管相同区域的位置，并绘制一条线，连接每个框的中心，单击键盘上的 M，以测量从收缩前位置到收缩后位置的距离。要使用表达荧光肌肉标记的胚胎来分析胚胎肌肉收缩，请使用荧光读出的录音来绘制一个以特定身体部分的荧光肌肉为中心的感兴趣区域。选择"兴趣区域管理器"中的"添加 T"选项卡以记录感兴趣区域的位置。单击"兴趣区域管理器"和"度量"可记录为视频每一帧选择的每个感兴趣区域的平均荧光强度。将框移动到其他感兴趣的正文段的中心，然后单击"添加 T"以记录其位置，以获取要分析的所有正文段中相同大小的感兴趣区域。在兴趣区域管理器中，按住控制键，同时选择记录为 XY 坐标的所有感兴趣区域。单击"更多"和"多度量"可测量视频所有帧的每个感兴趣区域的均荧光强度。这将报告表中的每个度量，每个感兴趣区域作为表的一列，每个帧作为一行。然后将表转移到电子表格程序进行进一步分析。绘制具有 x 轴上的帧数和 y 轴上平均荧光强度的图形，并使用每秒四帧帧的帧速率将帧数转换为时间。肌肉收缩增加GP强度，因为他们带来更多的GP到焦点区域附近，因为更多的肌肉在这些收缩期间被拉入。要确定肌肉收缩幅度，请将基线 GFP 强度估计为峰值之间区域的平均强度。然后评估相对于此基线的 GFP 荧光强度的增加。然后将每个兴趣强度值区域除以基线强度，使 GFP 强度与基线标准化。比较肌肉收缩波中后段、中段和前部的正常化 GFP 强度，以检查随着波传播而肌肉收缩程度的变化，并确定波的方向。要比较胚胎左右两侧的肌肉收缩，分析胚胎两侧相同部分的峰值强度。使用收缩幅度和峰值的时间显示差异（如果有）以及近体肌肉收缩波的范围和时间。在这里，野生型果蝇胚胎的正常围皮肌肉收缩显示。在这段在野生胚型胚胎中滚动的视频中，请注意，当气管指示胚胎在其壳内滚动时，后体附属物不会移动。在此代表性分析中，肌肉收缩峰值在 165 到 178 秒的时间段代表单个前进波。对于这个胚胎，在胚胎的左右两侧测量肌肉收缩的幅度和时间没有差异。如果近位收缩的轮廓先出现在后区域，后区域先出现峰值，后在中前区域出现峰值，那么其轮廓被指定为前向型一波。向后型一波是首先出现在前段，然后向后段传播的峰。类型两波从胚胎的一端开始，然后向中间区域前进，然后返回其来源，因为另一端的横扫波重新开始。身体姿势突变胚胎表现出1型至二型波生成的相对异常频率，导致身体姿势异常被指定为身体躯干或旋转表型。要使用荧光作为肌肉收缩参数的读出，在肌肉组织中使用带记者的胚胎至关重要。此方法可用于同时记录许多胚胎的肌肉收缩，并评估对各种刺激、药物或环境变化的反应。

Research

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