Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Het project werd deels gesteund door National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, en CONACYT 2012-037 (S) naar VP.

1. voorbereiding
<ol><li>Maak een vlieg kooi door ongeveer 50 gaten te maken in een 100 mL capaciteit Tri-hoek plastic bekerglas met een hete 25 G naald (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Bereid 60 mm x 15 mm Petri schaaltjes met appelsap-agar (3% agar en 30% appelsap).</li>
	<li>Bereid verse gist pasta door droge gist korrels en water te mengen. Verdeel de gist pasta op de Apple agar platen om het leggen van eieren te verhogen.</li>
	<li>Anesthetiseer ongeveer 50-60 vliegen (gebruik ongeveer gelijk...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

Onze methode biedt een kwantitatieve manier om belangrijk embryo gedrag tijdens de ontwikkeling te analyseren, zoals peristaltische spiercontractie golven, waaronder golf periodetijd, amplitude en patroon, evenals golfeffect op het rollen en de houding van het embryo. Dit kan nuttig zijn bij analyses van verschillende mutanten om de rol van specifieke genen bij het reguleren van deze en andere gedragingen tijdens de embryonale ontwikkeling te bestuderen. We hebben veranderingen in de spier-specifieke GFP-marker intensite...

Peristaltische spiercontractie is een ritmisch motorische gedrag vergelijkbaar met wandelen en zwemmen bij mensen1,2,3. Embryonale spiercontracties gezien in Drosophila late stadium embryo's vormen een voorbeeld van een dergelijk gedrag. Drosophila is een uitstekend modelorganisme om verschillende ontwikkelingsprocessen te bestuderen, omdat de embryonale ontwikkeling in Drosophila goed gekarakteriseerd, relatief kort en gemakkelijk te monitoren is. Het algemene doel van onze methode is om het wavelike patroon van contractie en ontspanning van embryonale spieren zorgvuldig op te nemen en te analyseren. We gebruikten een eenvoudige, niet-invasieve aanpak die een gedetailleerde visualisatie, opname en analyse van spiercontracties biedt. Deze methode kan ook worden gebruikt om andere in vivo processen te bestuderen, zoals embryonaal rollen gezien in laat stadium embryo's net voor het uitkomen. In eerdere studies werden embryonale spiercontracties voornamelijk geanalyseerd in termen van frequentie en richting1,2. Om de relatieve omvang van de weeën te schatten als ze langs de hoofdas in de voorste of achterste richting gaan, hebben we embryo's gebruikt om GFP specifiek in spieren uit te drukken. Deze analyse biedt een meer kwantitatieve manier om te analyseren spiercontracties en om te onthullen hoe de lichaamshouding in embryo's wordt gehandhaafd tijdens de reeks van peristaltische golven van spiercontracties.
Peristaltische spiercontracties worden bestuurd door centrale patroon Generator (CPG) circuits en communicatie tussen neuronen van het perifere zenuwstelsel (PNS), het centrale zenuwstelsel (CNS), en de spieren4,5. Het niet produceren van normale peristaltische spiercontracties kan leiden tot defecten zoals het niet uitkomen van2 en abnormale larvale motoriek6 en kan indicatief zijn voor neurologische afwijkingen. Live beeldvorming van peristaltische golven van spiercontractie en gedetailleerde analyse van contractie fenotypes kunnen helpen bij het ontdekken van pathogene mechanismen in verband met genetische defecten die invloed hebben op de spieren en neurale circuits die betrokken zijn bij de motoriek. Onlangs gebruikten we die benadering om mechanismen te onderzoeken die resulteren in een lichaamshouding torsie fenotype van protein O-mannosyltransferase (pomt) mutanten7.
Proteïne O-mannosylation (POM) is een speciaal type posttranslationele modificatie, waarbij een mannose-suiker wordt toegevoegd aan serine-of Threonine-residuen van secretoire pathway-eiwitten8,9. Genetische defecten in POM veroorzaken aangeboren spier dystrofieën (CMD) bij de mens10,11,12. We onderzochten de causatieve mechanismen van deze ziekten met behulp van Drosophila als een modelsysteem. We constateerden dat embryo's met mutaties in Drosophila proteïne O-mannosyltransferase -genen POMT1 en POMT2 (a.k.a. geroteerde buik (RT) en twisted (tw)) een verplaatsing ("rotatie") van lichaams segmenten, wat resulteert in een abnormale lichaamshouding7. Belangwekkend, dit defect viel samen met de ontwikkelingsfase wanneer peristaltische spiercontracties worden prominent7.
Aangezien abnormale lichaamshouding bij POM Mutant embryo's ontstaat wanneer spieren en epidermis al worden gevormd en peristaltische golven van gecoördineerde spiercontracties zijn begonnen, veronderstellen we dat abnormale lichaamshouding een gevolg kan zijn van abnormale spier samentrekkingen in plaats van een defect in spier of/en epidermis morfologie7. Cmd's kunnen worden geassocieerd met abnormale spiercontracties en houdings defecten13, en dus kan de analyse van de houdings fenotype in Drosophila pomt mutanten de pathologische mechanismen van spier dystrofieën verheldeert . Om de relatie tussen de lichaamshouding fenotype van Drosophila pomt mutanten en mogelijke afwijkingen in peristaltische golven van spiercontracties te onderzoeken, hebben we besloten om spiercontracties in detail te analyseren met behulp van een live Imaging-benadering.
Onze analyse van peristaltische contractie golven in Drosophila embryo's onthulde twee verschillende contractie modi, aangeduid als type 1 en type 2-golven. Type 1 golven zijn eenvoudige golven die van voorste naar posterieure of omgekeerd. Type 2 golven zijn bifasische golven die beginnen aan het voorste uiteinde, de helft in de achterste richting voortplanten, kortstondig stoppen, een temporele statische contractie vormen, en vervolgens, tijdens de tweede fase, worden geveegd door een peristaltische contractie die voortgaat naar voren vanaf het achterste uiteinde. Wild-type embryo's genereren normaalgesproken een reeks contracties die bestaat uit ongeveer 75% type 1 en 25% type 2 golven. In tegenstelling, genereren Pomt Mutant embryo's type 1 en type 2 golven op ongeveer gelijke relatieve frequenties.
Onze aanpak kan gedetailleerde informatie bieden voor kwantitatieve analyse van spiercontracties en embryo Rolling7. Deze aanpak kan ook worden aangepast voor analyses van andere gedragingen waarbij spiercontracties, zoals uitbroeden en kruipen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

Gecoördineerde spiercontracties zijn een vorm van ritmisch gedrag dat vroegtijdig wordt gezien tijdens de ontwikkeling van Drosophila -embryo's. Neuronale sensorische feedback circuits zijn vereist om dit gedrag te beheersen. Het niet produceren van het ritmische patroon van weeën kan een indicatie zijn van neurologische afwijkingen. We ontdekten eerder dat defecten in eiwit-O-mannosylatie, een posttranslationele eiwit modificatie, de axon morfologie van sensorische neuronen aantasten en resulteren in abnormale gecoördineerde spiercontracties in embryo's. Hier presenteren we een relatief eenvoudige methode voor het opnemen en analyseren van het patroon van peristaltische spiercontracties door Live beeldvorming van laat stadium embryo's tot het punt van broedeieren, die we gebruikten om de spiercontractie fenotype van eiwit te karakteriseren O-mannosyltransferase mutanten. Gegevens verkregen uit deze opnames kunnen worden gebruikt om spiercontractie golven te analyseren, inclusief frequentie, richting van vermeerdering en relatieve amplitude van spiercontracties op verschillende lichaams segmenten. We hebben ook de lichaamshouding onderzocht en gebruik gemaakt van een fluorescerende marker die specifiek in spieren is uitgedrukt om de positie van de embryo-middenlijn nauwkeurig te bepalen. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om verschillende andere gedragingen tijdens de ontwikkeling te bestuderen, zoals het rollen van embryo's en broedeieren.

Normale peristaltische spiercontracties worden weergegeven in een WT (wild-type, Canton-S) embryo in film 1. De gemiddelde frequentie van peristaltische golven van spiercontracties in onze analyse was 47 contracties per uur en de gemiddelde amplitude was 60% boven Baseline voor WT-embryo's. De embryonale rollen worden weergegeven voor een WT -embryo in film 2, met de witte pijl die de beginpositie van een luchtpijp markeert en een zwarte pijl die de positie van een dorsale aanh...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo

Hier presenteren we een methode om embryonale spiercontracties in Drosophila embryo's op te nemen op een niet-invasieve en detail georiënteerde manier.

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Deze methode richt zich op het analyseren van ontwikkelingsprocessen zoals spiercontracties en rollen die voorkomen in het Drosophila embryo. Enkele voordelen van deze techniek zijn dat het niet invasief en vrij gedetailleerd is, maar het is relatief eenvoudig uit te voeren. Onze methode kan verder worden ontwikkeld voor analyse op basis van hoge inhoud om nieuwe mutaties te isoleren en te analyseren die embryonale spiercontracties en andere ontwikkelingsprocessen beïnvloeden.Bij het visualiseren van spiercontracties is het belangrijk om embryoverzamelingen goed te timen, omdat weeën pas in een specifieke ontwikkelingsfase beginnen. Stapsgewijze visuele demonstratie kan enorm helpen bij de kwantitatieve analyse van de ontwikkelingsprocessen. Voor live beeldvorming van gemonteerde Drosophila embryo's, plaats de embryo's op het stadium van een epifluorescentie microscoop met een timelapse functie en een digitale camera met geschikte emissiefilters en selecteer een 10X water onderdompeling objectieve lens.Vervolgens live video opnemen van de embryo's met behulp van de juiste microscoop opname software voor ongeveer een tot twee uur met een acquisitiesnelheid van vier frames per seconde. Exporteer de opgenomen video aan het einde van het experiment rechtstreeks naar ImageJ. Selecteer afbeelding en bijsnijden om een vak rond elk afzonderlijk embryo te tekenen om de video-opnamen bij te snijden tot de grootte van elk embryo.Klik op Afbeelding, Transformeren en Roteren om de bijgesneden afbeeldingen te roteren om een verticale positie van het embryo midline ten opzichte van het scherm te bereiken. Als u afstandsmetingen wilt instellen op micrometers, klikt u op Schaal analyseren en instellen en voert u vervolgens de bekende conversiefactor pixel-micron-verhouding in voor uw microscoopinstelling. Alle volgende metingen worden dan in micrometers gerapporteerd.Als u embryorollen wilt analyseren, markeert u eerst de positie van een of beide luchtpijp van een embryo in het eerste frame van de video halverwege tussen de achterste en voorste uiteinden en klikt u op Analyseren, Hulpmiddelen en Regio van Belang Manager. Teken een doos van ongeveer zeven micrometer bij zeven micrometer rond de luchtpijp en klik op de T-toets op het toetsenbord om deze positie op te nemen als een XY-coördinaat. Markeer de positie van hetzelfde gebied van de luchtpijp na peristaltische contracties van belang en teken een lijn die de centra van elk vak verbindt en op M op het toetsenbord klikt om de afstand van de precontractiepositie tot de postcontractiepositie te meten.Voor het analyseren van embryonale spiercontracties met behulp van embryo's uitdrukken fluorescerende spiermarkers, gebruik maken van de opname van de fluorescerende uitlezing om een regio van belang gecentreerd rond de fluorescerende spieren van een bepaald lichaamssegment van belang te trekken. Selecteer het tabblad T toevoegen in de regio van interessebeheer om de positie van het interessegebied vast te leggen. Klik op Regio van Belang Manager en Meet om de gemiddelde fluorescerende intensiteit van elke regio van belang geselecteerd voor elk frame van de video op te nemen.Verplaats het vak naar de centra van andere lichaamssegmenten van belang en klik op T toevoegen om hun posities op te nemen om gebieden van belang te verkrijgen van identieke grootte in alle te analyseren lichaamssegmenten. Houd in de regio van belangbeheer de controlesleutel vast terwijl u alle regio's selecteert die als XY-coördinaten zijn geregistreerd. Klik op Meer en Multi-Measure om de gemiddelde fluorescerende intensiteit van elk gebied van belang voor alle frames van de video te meten.Hiermee wordt elke meting in een tabel met elk interessegebied als kolom van de tabel en elk frame als een rij rapporteer. Breng de tabel vervolgens over naar een spreadsheetprogramma voor verdere analyse. Plot een grafiek met het framenummer op de x-as en de gemiddelde fluorescentieintensiteit op de y-as en zet het framenummer om in tijd met behulp van de framesnelheid van vier frames per seconde.De spiercontracties verhogen de GFP intensiteit als ze meer GFP in de buurt van het brandpuntsgebied als meer spieren krijgen getrokken tijdens deze weeën. Om de spiercontractie amplitude te bepalen, schat de baseline GFP intensiteit als de gemiddelde intensiteit van de regio's tussen pieken. Bekijk vervolgens de toename van de GFP-fluorescentieintensiteit ten opzichte van deze uitgangswaarde.Verdeel vervolgens elk gebied van de waarde van de rente-intensiteit door de basislijnintensiteit om de GFP-intensiteit te normaliseren naar de basislijn. Vergelijk de genormaliseerde GFP-intensiteiten op achterste, mediale en voorste segmenten tijdens de spiercontractiegolf om de veranderingen in de mate van spiercontractie te onderzoeken terwijl de golf zich voortplant en om de richting van de golf te bepalen. Om de spiercontracties aan de linker- en rechterkant van het embryo te vergelijken, analyseert u de piekintensiteiten voor dezelfde segmenten aan beide zijden van het embryo.Gebruik de samentrekkingsamplitude en de timing van de pieken om de eventuele verschillen en de omvang en de timing van de peristaltische spiercontractiegolven te onthullen. Hier worden normale peristaltische spiercontracties bij een wild type Drosophila embryo getoond. In deze video van het rollen in een wild type embryo, merk op dat de dorsale aanhangsel niet beweegt, terwijl de luchtpijp doet aangeeft dat het embryo heeft gerold in zijn schelp.In deze representatieve analyse, de spiercontractie pieken tijdens de 165 tot 178-seconden periode vertegenwoordigen een enkele voorwaartse golf. Voor dit embryo werd geen verschil in de amplitude en de tijd van de spiercontracties gemeten aan de rechter- en linkerkant van het embryo. Een peristaltische contractie wordt aangewezen als een voorwaartse type een golf als het profiel heeft een piek die zich voordoet op het achterste gebied eerst gevolgd door pieken in het midden en voorste regio's.Een achterwaartse type een golf is een piek die zich eerst voordoet bij voorste segmenten en zich vervolgens voortplant naar achterste gebieden. Typ twee golven beginnen aan het ene uiteinde van het embryo en ga naar de middelste regio's voordat u terugkeert naar hun oorsprong als een vegende golf opnieuw geïnitieerd aan de andere kant. Lichaamshouding gemuteerde embryo's tonen een abnormale relatieve frequentie van type een tot type twee golf generatie die resulteert in een lichaamshouding afwijking aangewezen als het lichaam torsie of rotatie fenotype.Om fluorescentie te gebruiken als uitlezing voor de spiercontractieparameters, is het essentieel om embryo's te gebruiken met een verslaggever in het spierweefsel. Deze methode kan worden gebruikt voor de gelijktijdige registratie van de spiercontracties van veel embryo's en voor de beoordeling van de reacties op verschillende stimuli, geneesmiddelen of veranderingen in het milieu.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...