Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Das Projekt wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 und CONACYT 2012-037(S) an VP unterstützt.

1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie einen Fliegenkäfig vor, indem Sie etwa 50 Löcher in einem 100 ml Tragfähigkeittri-Eck-Kunststoffbecher mit einer heißen 25 G Nadel machen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>60 mm x 15 mm Petrischalen mit Apfelsaft-Agar (3% Agar und 30% Apfelsaft) zubereiten.</li>
	<li>Bereiten Sie frische Hefepaste durch Mischen von trockenem Hefegranulat und Wasser vor. Die Hefepaste auf die Apfelagarplatten verteilen, um die Eiablage zu erhöhen.</li>
	<li>Anästhetisi...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

Unsere Methode bietet eine quantitative Möglichkeit, wichtige Embryo-Verhalten während der Entwicklung zu analysieren, wie peristaltische Muskelkontraktionswellen, einschließlich Wellenperiodizität, Amplitude und Muster, sowie Wellenwirkung auf Embryo-Rollen und Haltung. Dies kann bei Analysen verschiedener Mutanten nützlich sein, um die Rolle bestimmter Gene bei der Regulierung dieser und anderer Verhaltensweisen während der embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Wir haben Veränderungen in der muskelspezifischen...

Peristaltische Muskelkontraktion ist ein rhythmisches motorisches Verhalten ähnlich wie Gehen und Schwimmen beim Menschen1,2,3. Embryonale Muskelkontraktionen, die in Drosophila-Embryonen im späten Stadium beobachtet werden, sind ein Beispiel für ein solches Verhalten. Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, um verschiedene Entwicklungsprozesse zu studieren, da die embryonale Entwicklung in Drosophila gut charakterisiert, relativ kurz und leicht zu überwachen ist. Das übergeordnete Ziel unserer Methode ist es, das wellenartige Muster der Kontraktion und Entspannung der embryonalen Muskeln sorgfältig aufzuzeichnen und zu analysieren. Wir verwendeten einen einfachen, nicht-invasiven Ansatz, der eine detaillierte Visualisierung, Aufzeichnung und Analyse von Muskelkontraktionen bietet. Diese Methode kann möglicherweise auch verwendet werden, um andere In-vivo-Prozesse zu untersuchen, wie z. B. embryonale Walzen, die in späten Embryonen kurz vor dem Schlüpfen beobachtet wurden. In früheren Studien wurden embryonale Muskelkontraktionen meist in Bezug auf Häufigkeit und Richtunganalysiert 1,2. Um das relative Ausmaß der Kontraktionen zu schätzen, während sie entlang der Körperachse in vorderer oder hinterer Richtung voranschreiten, haben wir Embryonen verwendet, die GFP spezifisch in muskeln ausdrücken. Diese Analyse bietet eine quantitativere Möglichkeit, Muskelkontraktionen zu analysieren und zu zeigen, wie die Körperhaltung in Embryonen während einer Reihe peristaltischer Wellen von Muskelkontraktionen aufrechterhalten wird.
Peristaltische Muskelkontraktionen werden durch zentrale Mustergenerator (CPG) Schaltungen und Kommunikation zwischen Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS), des zentralen Nervensystems (ZNS) und Muskeln4,5gesteuert. Wenn keine normalen peristaltischen Muskelkontraktionen auftreten, kann dies zu Defekten wie dem Versagen der Luke2 und der abnormalen Larvenfortbewegung6 führen und kann auf neurologische Anomalien hinweisen. Live-Bildgebung von peristaltischen Wellen der Muskelkontraktion und detaillierte Analyse von Kontraktion Phänotypen können helfen, pathogene Mechanismen im Zusammenhang mit genetischen Defekten, die Muskeln und neuronale Schaltkreise in der Fortbewegung beteiligt aufzudecken. Wir haben vor kurzem diesen Ansatz verwendet, um Mechanismen zu untersuchen, die zu einem Körperhaltungs-Torsion-Phänotypvon protin O-mannosyltransferase (POMT) Mutanten 7 führen.
Protein-O-Mannosylierung (POM) ist eine spezielle Art der posttranslationalen Modifikation, bei der ein Mannosezucker zu Serin- oder Threoninrückständen von sekretorischen Signalwegproteinen8,9hinzugefügt wird. Genetische Defekte in POM verursachen angeborene Muskeldystrophien (CMD) beim Menschen10,11,12. Wir untersuchten die ursächlichen Mechanismen dieser Krankheiten mit Drosophila als Modellsystem. Wir fanden heraus, dass Embryonen mit Mutationen in Drosophila-Protein O-mannosyltransferase Gene POMT1 und POMT2 (auch als rotierter Bauch (rt) und verdreht (tw)) Verschiebung ("Rotation") von Körpersegmenten, was zu einer abnormalen Körperhaltung führt7. Interessanterweise fiel dieser Defekt mit dem Entwicklungsstadium zusammen, wenn peristaltische Muskelkontraktionen prominent werden7.
Da abnorme Körperhaltung in POM-mutierten Embryonen entsteht, wenn muskulös und epidermis bereits gebildet sind und peristaltische Wellen koordinierter Muskelkontraktionen begonnen haben, vermuteten wir, dass eine abnorme Körperhaltung eine Folge abnormaler Muskeln sein könnte. Kontraktionen statt eines Defekts in der Muskel- oder/und Epidermismorphologie7. CMDs können mit abnormalen Muskelkontraktionen und Haltungsfehlern in Verbindung gebracht werden13, und daher kann die Analyse des Haltungsphänotyps bei Drosophila POMT-Mutanten pathologische Mechanismen im Zusammenhang mit Muskeldystrophien aufklären . Um den Zusammenhang zwischen dem Körperhaltungsphänotyp von Drosophila POMT Mutanten und möglichen Anomalien in peristaltischen Wellen von Muskelkontraktionen zu untersuchen, haben wir beschlossen, Muskelkontraktionen im Detail mit einem bildgebenden Ansatz.
Unsere Analyse von peristaltischen Kontraktionswellen in Drosophila-Embryonen ergab zwei unterschiedliche Kontraktionsmodi, die als Typ-1- und Typ-2-Wellen bezeichnet wurden. Typ-1-Wellen sind einfache Wellen, die sich von vorn zu hintergründ oder umgekehrt ausbreiten. Typ-2-Wellen sind biphasische Wellen, die sich am vorderen Ende antreiben, sich auf halbem Weg in die hintere Richtung ausbreiten, kurzzeitig anhalten, eine zeitliche statische Kontraktion bilden und dann, während der zweiten Phase, von einer peristaltischen Kontraktion gefegt werden, die sich fortausbreitet. vom hinteren Ende nach vorne. Wildtyp-Embryonen erzeugen normalerweise eine Reihe von Kontraktionen, die aus etwa 75 % Typ-1- und 25 %-Typ-2-Wellen bestehen. Im Gegensatz dazu erzeugen POMT-mutierte Embryonen Typ-1- und Typ-2-Wellen bei annähernd gleichen relativen Frequenzen.
Unser Ansatz kann detaillierte Informationen für die quantitative Analyse von Muskelkontraktionen und Embryorollen7liefern. Dieser Ansatz könnte auch für Analysen anderer Verhaltensweisen mit Muskelkontraktionen, wie Schlüpfen und Kriechen, angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

Koordinierte Muskelkontraktionen sind eine Form des rhythmischen Verhaltens, das früh während der Entwicklung bei Drosophila-Embryonen beobachtet wird. Um dieses Verhalten zu steuern, sind neuronale sensorische Rückkopplungskreise erforderlich. Wenn das rhythmische Muster von Kontraktionen nicht erzeugt wird, kann dies auf neurologische Anomalien hindeuten. Wir haben zuvor festgestellt, dass Defekte in der Protein-O-Mannosylierung, einer posttranslationalen Proteinmodifikation, die Axonmorphologie sensorischer Neuronen beeinflussen und zu abnormalen koordinierten Muskelkontraktionen in Embryonen führen. Hier stellen wir eine relativ einfache Methode zur Aufzeichnung und Analyse des Musters peristaltischer Muskelkontraktionen durch Live-Bildgebung von Embryon im späten Stadium bis zum Schraffur, die wir verwendet, um die Muskelkontraktion Phänotyp des Proteins charakterisieren O-mannosyltransferase Mutanten. Daten aus diesen Aufzeichnungen erhalten können verwendet werden, um Muskelkontraktionswellen zu analysieren, einschließlich Frequenz, Richtung der Ausbreitung und relative Amplitude von Muskelkontraktionen an verschiedenen Körpersegmenten. Wir haben auch die Körperhaltung untersucht und einen fluoreszierenden Marker genutzt, der speziell in den Muskeln ausgedrückt wird, um die Position der Embryo-Mittellinie genau zu bestimmen. Ein ähnlicher Ansatz kann auch verwendet werden, um verschiedene andere Verhaltensweisen während der Entwicklung zu studieren, wie embryonalieren und schlüpfen.

Normale peristaltische Muskelkontraktionen werden in einem WT (Wildtyp, Canton-S) Embryo in Film 1gezeigt. Die durchschnittliche Häufigkeit peristaltischer Wellen von Muskelkontraktionen lag in unserer Analyse bei 47 Kontraktionen pro Stunde und die durchschnittliche Amplitude lag bei WT-Embryonen um 60 % über dem Ausgangswert. Embryo-Rollen wird für einen WT-Embryo in Film 2 gezeigt, wobei der weiße Pfeil die Anfangsposition einer Luftröhre und einen schwarzen Pfeil marki...

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Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Hier stellen wir eine Methode vor, um embryonale Muskelkontraktionen in Drosophila-Embryonen nicht-invasiv und detailorientiert aufzuzeichnen.

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Diese Methode befasst sich mit der Analyse von Entwicklungsprozessen wie Muskelkontraktionen und Rollieren, die im Drosophila-Embryo auftreten. Einige Vorteile dieser Technik sind, dass es nicht invasiv und ziemlich detailliert ist, aber es ist relativ einfach durchzuführen. Unsere Methode kann für das risikoreiche, analysebasierte Screening weiterentwickelt werden, um neue Mutationen zu isolieren und zu analysieren, die embryonale Muskelkontraktionen und andere Entwicklungsprozesse beeinflussen.Bei der Visualisierung von Muskelkontraktionen ist es wichtig, Embryo-Sammlungen richtig zu terminieren, da Kontraktionen erst in einem bestimmten Entwicklungsstadium beginnen. Die visuelle Demonstration kann Schritt für Schritt bei der quantitativen Analyse der Entwicklungsprozesse erheblich helfen. Zur Live-Bildgebung von montierten Drosophila-Embryonen legen Sie die Embryonen auf das Stadium eines Epifluoreszenzmikroskops mit Zeitrafferfunktion und einer Digitalkamera mit geeigneten Emissionsfiltern und wählen Sie eine 10-fache Wasser-Tauchobjektivlinse aus.Anschließend zeichnen Live-Videos die Embryonen mit der entsprechenden Mikroskop-Aufnahmesoftware für etwa ein bis zwei Stunden mit einer Erfassungsrate von vier Bildern pro Sekunde auf. Exportieren Sie das aufgenommene Video am Ende des Experiments direkt in ImageJ. Wählen Sie Bild und Zuschneiden aus, um eine Box um jeden einzelnen Embryo zu zeichnen, um die Videoaufzeichnungen auf die Größe jedes Embryos zuschneiden.Klicken Sie auf Bild, Transformieren und Drehen, um die zugeschnittenen Bilder zu drehen, um eine vertikale Position der Embryo-Mittellinie relativ zum Bildschirm zu erreichen. Um Entfernungsmessungen auf Mikrometer festzulegen, klicken Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen, und geben Sie dann den bekannten Umwandlungsfaktor für das Verhältnis Pixel zu Mikrometer für Ihr Mikroskop-Setup ein. Alle nachfolgenden Messungen werden dann in Mikrometern gemeldet.Um das Walzen des Embryos zu analysieren, markieren Sie zuerst die Position einer oder beider Luftröhren eines Embryos im ersten Frame des Videos auf halbem Weg zwischen den hinteren und vorderen Enden, und klicken Sie auf Analysieren, Tools und Region of Interest Manager. Zeichnen Sie eine ungefähre Sieben-Mikrometer-x-Sieben-Mikrometer-Box um die Luftröhre und klicken Sie auf die T-Taste auf der Tastatur, um diese Position als XY-Koordinate aufzuzeichnen. Markieren Sie die Position des gleichen Bereichs der Luftröhre nach peristaltischen Kontraktionen von Interesse und zeichnen Sie eine Linie, die die Mitten jedes Feldes verbindet, indem Sie auf m auf der Tastatur klicken, um den Abstand von der Position vor der Kontraktion zur Position nach der Kontraktion zu messen.Um embryonale Muskelkontraktionen mit Embryonen zu analysieren, die fluoreszierende Muskelmarker exdrücken, verwenden Sie die Aufzeichnung der fluoreszierenden Auslesung, um einen Bereich von Interesse zu zeichnen, der um die fluoreszierenden Muskeln eines bestimmten Körpersegments von Interesse zentriert ist. Wählen Sie die Registerkarte T hinzufügen im Bereichs-Interessen-Manager aus, um die Position der Interessenregion aufzuzeichnen. Klicken Sie auf "Bereichs-Interessen-Manager" und "Messen", um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der einzelnen Interessensgebiete aufzuzeichnen, die für jeden Frame des Videos ausgewählt wurden.Verschieben Sie das Feld in die Zentren anderer Körpersegmente von Interesse, und klicken Sie auf T hinzufügen, um ihre Positionen aufzuzeichnen, um Bereiche gleicher Größe in allen zu analysierenden Körpersegmenten zu erhalten. Halten Sie im Bereichs-Interessen-Manager die Steuertaste, während Sie alle Interessenbereiche auswählen, die als XY-Koordinaten aufgezeichnet sind. Klicken Sie auf Mehr und Mehrfachmaß, um die mittlere fluoreszierende Intensität jeder Region zu messen, die für alle Frames des Videos von Interesse ist.Dadurch wird jede Messung in einer Tabelle mit jedem Interessenbereich als Spalte der Tabelle und jedem Frame als Zeile gemeldet. Übertragen Sie die Tabelle dann zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Zeichnen Sie ein Diagramm mit der Bildnummer auf der x-Achse und der mittleren Fluoreszenzintensität auf der y-Achse und konvertieren Sie die Framezahl mithilfe der Bildrate von vier Bildern pro Sekunde in Zeit.Die Muskelkontraktionen erhöhen die GFP-Intensität, da sie mehr GFP in die Nähe des Brennbereichs bringen, da mehr Muskeln während dieser Kontraktionen eingezogen werden. Um die Amplitude der Muskelkontraktion zu bestimmen, schätzen Sie die GFP-Basisintensität als die durchschnittliche Intensität der Regionen zwischen Denspitzen. Bewerten Sie dann den Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität im Verhältnis zu dieser Basislinie.Dividieren Sie dann jeden Bereich mit der Intensität des Interesses durch die Basisintensität, um die GFP-Intensität auf die Basislinie zu normalisieren. Vergleichen Sie die normalisierten GFP-Intensitäten an hinteren, medialen und vorderen Segmenten während der Muskelkontraktionswelle, um die Veränderungen im Ausmaß der Muskelkontraktion zu untersuchen, wenn sich die Welle ausbreitet, und um die Richtung der Welle zu bestimmen. Um die Muskelkontraktionen auf der linken und rechten Seite des Embryos zu vergleichen, analysieren Sie die Spitzenintensitäten für die gleichen Segmente auf beiden Seiten des Embryos.Verwenden Sie die Kontraktionsamplitude und das Timing der Peaks, um die Unterschiede, falls vorhanden, und das Ausmaß und das Timing der peristaltischen Muskelkontraktionswellen aufzuzeigen. Hier werden normale peristaltische Muskelkontraktionen in einem wilden Drosophila-Embryo gezeigt. Beachten Sie in diesem Video, in dem ein embryonaler Wilder-Embryo gerollt wird, dass sich das dorsale Anhängsivnichte nicht bewegt, während die Luftröhre darauf hinweist, dass der Embryo in seiner Schale gerollt ist.In dieser repräsentativen Analyse stellen die Muskelkontraktionen während des Zeitraums von 165 bis 178 Sekunden eine einzelne Vorwärtswelle dar. Für diesen Embryo wurde kein Unterschied in der Amplitude und der Zeit der Muskelkontraktionen auf der rechten und linken Seite des Embryos gemessen. Eine peristaltische Kontraktion wird als Vorwärtstyp-1-Welle bezeichnet, wenn ihr Profil einen Gipfel hat, der zuerst in der hinteren Region entsteht, gefolgt von Spitzen in der mittleren und vorderen Region.Eine rückwärts gerichtete Welle typ ist ein Peak, der zuerst an vorderen Segmenten entsteht und sich dann in richtungsträge Regionen ausbreitet. Typ zwei Wellen beginnen an einem Ende des Embryos und gehen in Richtung der mittleren Regionen, bevor sie zu ihrem Ursprung zurückkehren, als eine schwungvolle Welle am entgegengesetzten Ende wieder angestoßen wird. Körperhaltung mutierte Embryonen zeigen eine abnormale relative Häufigkeit von Typ eins bis Typ zwei Wellengeneration, die zu einer Körperhaltung Anomalie bezeichnet als KörperTorsion oder Rotation Phänotyp führt.Um Fluoreszenz als Auslese für die Parameter der Muskelkontraktion zu verwenden, ist es wichtig, Embryonen mit einem Reporter im Muskelgewebe zu verwenden. Diese Methode kann für die gleichzeitige Aufzeichnung der Muskelkontraktionen vieler Embryonen und für die Beurteilung der Reaktionen auf verschiedene Reize, Medikamente oder Umweltveränderungen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

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In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

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The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...