Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

הפרויקט היה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות RO1 NS099409, NS075534, ו CONACYT 2012-037 (S) לסמנכ ל.

1. הכנה
<ol><li>להכין כלוב זבוב על ידי הפיכת כ 50 חורים בתוך 100 mL קיבולת פלסטיק תלת-ממדי הפינה באמצעות מחט חם 25 גרם (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>להכין 60 mm x 15 מ"מ מנות פטרי עם מיץ תפוחים-אגר (3% אגר ו 30% מיץ תפוחים).</li>
	<li>הכינו ממרח שמרים טריים על ידי ערבוב גרגרי שמרים יבשים ומים. הפיצו את שמרים להד?...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

השיטה שלנו מספקת דרך כמותית לנתח התנהגויות העובר חשוב במהלך הפיתוח, כגון גלי השריר הפריסטטי התכווצות, כולל גל תקופתיות, משרעת ודפוס, כמו גם אפקט גל על העובר מתגלגל ויציבה. זה יכול להיות שימושי ניתוחים של מוטציות שונות כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים בוויסות אלה והתנהגויות אחרות במהלך ...

התכווצות שרירים פריסטלטית היא התנהגות מוטורית קצבית דומה הליכה ושחייה בבני אדם1,2,3. התכווצויות שרירים עובריים לראות Drosophila ילה עוברים בשלב מאוחר מייצגים דוגמה של התנהגות כזאת. דרוזופילה היא אורגניזם מודל מצוין לחקר תהליכים התפתחותיים שונים, משום שפיתוח עובריים בדרוסופילה מאופיין היטב, קצר יחסית, וקל לניטור. המטרה הכוללת של השיטה שלנו היא להקליט בקפידה ולנתח את דפוס ההתכווצות של התכווצות והרפיה של השרירים העובריים. השתמשנו בגישה פשוטה, לא פולשנית המציעה הדמיה מפורטת, הקלטה וניתוח של התכווצויות שרירים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד אחרים בתהליכים vivo, כגון מתגלגל עובריים לראות העוברים בשלב מאוחר רק לפני הבקיעה. במחקרים קודמים, התכווצויות שרירים עובריים נותחו בעיקר במונחים של תדר וכיוון1,2. על מנת לאמוד את היקף יחסי של הצירים כפי שהם התקדמות לאורך ציר הגוף בכיוון הקדמי או האחורי, השתמשנו העוברים ביטוי GFP במיוחד השרירים. ניתוח זה מספק דרך כמותית יותר לנתח התכווצויות שרירים כדי לחשוף כיצד תנוחת הגוף העוברים נשמרת במהלך סדרה של גלי הפריסטטיים של התכווצויות שרירים.
התכווצויות שרירים פריסטלטיות נשלטות על ידי מחולל תבנית מרכזית (CPG) מעגלים ותקשורת בין נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מערכת העצבים המרכזית (cn), והשרירים4,5. אי הפקת התכווצויות שרירים נורמלית הפריסטלטית יכול להוביל לפגמים כגון כישלון בצוהר2 ו זחל נורמלי תנועה6 והוא יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. הדמיה חיה של גלים הפריסטטיים של התכווצות שרירים וניתוח מפורט של פנוטיפים התכווצות יכול לעזור לחשוף מנגנונים פתוגניים הקשורים פגמים גנטיים המשפיעים על השרירים ומעגלים עצביים מעורב תנועה. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כדי לחקור מנגנונים כי התוצאה של פיתול יציבה הגוף פנוטיפ של pפרוטאין O-mannosyltבראנפראז (pomt) מוטציות7.
החלבון O-mannosylation (פום) הוא סוג מיוחד של שינוי פוסט-ממדי, שם מתווסף הסוכר סרין או שאריות של חלבונים של מסלול הפרשה8,9. פגמים גנטיים ב פום לגרום dystrophies שרירים מולדים (CMD) בבני אדם10,11,12. בדקנו את המנגנונים הסיבתי של מחלות אלו באמצעות דרוסופילה כמערכת מודל. מצאנו כי עוברים עם מוטציות ב Drosophila ילה חלבון O-mannosyltransferase גנים POMT1 ו POMT2 (הידוע הבטן מסובב (rt) ו מעוות (tw)) להראות מ עקירה ("סיבוב") של חלקי הגוף, אשר התוצאה היא יציבה גוף7. מעניין, פגם זה בד בבד עם השלב ההתפתחותי כאשר התכווצויות שרירים הפריסטלטיות להיות בולטות7.
מאז יציבה גוף חריג העוברים מוטציה פום מתעוררת כאשר השרירים והאפידרמיס הם כבר הקימו וגלים הפריסטלטיים של התכווצויות שרירים מתואמת החלו, שיערו כי יציבה הגוף לא נורמלי יכול להיות תוצאה של שריר נורמלי התכווצויות במקום פגם שריר או/ו אפידרמיס מורפולוגיה7. CMDs יכול להיות משויך עם התכווצויות שרירים חריגים ופגמים יציבה13, ובכך ניתוח של התנוחה פנוטיפ ב- drosophila pomt מוטציות עשוי להבהיר מנגנונים פתולוגיים הקשורים dystrophies שרירי . על מנת לחקור את היחסים בין הגוף הפנוטיפ של מוטציות מוטנטים וליקויים אפשריים בגלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים, החלטנו לנתח התכווצויות שרירים בפירוט באמצעות לחיות גישת הדמיה.
הניתוח שלנו של גלי התכווצות הפריסטטיות בעוברים הדרוזופילה חשף שני מצבי התכווצות נפרדים, המיועדים כסוג 1 ומסוג 2 גלים. מסוג 1 גלים הם גלים פשוטים הפצת מן הקדמי לאחורי או להיפך. הגלים מסוג 2 הם גלים ביפאטיים היוזמים בקצה הקדמי, מופצים באמצע הדרך בכיוון האחורי, מסתיימים לרגע, יוצרים כיווץ סטטי זמני, ולאחר מכן, במהלך השלב השני, הם נסחפים באמצעות כיווץ פריסטי המחפיץ . קדימה מהקצה האחורי פראי טיפוס העוברים בדרך כלל ליצור סדרה של התכווצויות המורכבת של כ 75% סוג 1 ו -25% סוג 2 גלים. לעומת זאת, עוברי מוטציה של Pomt ליצור סוג 1 ו 2 גלים בערך שוויון תדרים יחסית.
הגישה שלנו יכול לספק מידע מפורט לניתוח כמותי של התכווצויות שרירים העובר מתגלגל7. גישה זו יכול גם להיות מותאם לניתוח של התנהגויות אחרות הקשורות התכווצויות שרירים, כגון בקיעה וזחילה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

התכווצויות שרירים מתואמת הם צורה של התנהגות קצבית לראות מוקדם במהלך הפיתוח של העוברים דרוסופילה . מעגלי משוב חושי סנסוריים נדרשים לשלוט באופן פעולה זה. אי הפקת דפוס קצבי של התכווצויות יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. בעבר גילינו כי פגמים בחלבון O-mannosyזילציה, שינוי חלבון posttranslational, להשפיע על מורפולוגיה אקסון של נוירונים חושים ולגרום התכווצויות שרירים מתואמת נורמלי עוברים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית להקלטה וניתוח התבנית של התכווצויות שרירים הפריסטלטיות על ידי הדמיה חיה של עוברי שלב מאוחר עד לנקודת הבקיעה, אשר השתמשנו כדי לאפיין את התכווצות שרירים מרשם של חלבון . או-מנסילאז מוטציות נתונים שהתקבלו מהקלטות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח גלי התכווצות שרירים, כולל תדירות, כיוון התפשטות ומשרעת יחסי של התכווצויות שרירים בחלקי גוף שונים. בדקנו גם את תנוחת הגוף ואת היתרון של סמן פלורסנט הביע במיוחד השרירים כדי לקבוע במדויק את מיקומו של העובר באמצע הקו. גישה דומה יכולה להיות מנוצל גם לחקר התנהגויות שונות במהלך הפיתוח, כגון העובר מתגלגל והבקיעה.

התכווצויות שרירים נורמלי קנולות מוצגים WT (פראי סוג, קנטון-S) העובר בסרט 1. התדר הממוצע של גלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים בניתוח שלנו היה 47 התכווצויות לשעה ואת משרעת הממוצע היה 60% מעל הבסיס עבור עוברי WT. מתגלגל העובר מוצג עבור העובר WT בסרט 2, כאשר החץ הלבן מסמן את ה...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

כאן, אנו מציגים שיטה להקליט התכווצויות שרירים עובריים בעוברי דרוזוהילה בצורה לא פולשנית ומונחה פרטים.

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

שיטה זו עוסקת כיצד לנתח תהליכים התפתחותיים כגון התכווצויות שרירים וגלגול המתרחשים בעובר Drosophila. כמה יתרונות של טכניקה זו הם שזה פולשני ומפורט למדי, עדיין זה פשוט יחסית לבצע. השיטה שלנו יכולה להיות מפותחת עוד יותר עבור סינון מבוסס ניתוח תוכן גבוה כדי לבודד ולנתח מוטציות חדשות המשפיעות על התכווצויות שרירים עובריים ותהליכים התפתחותיים אחרים.כאשר מדמיינים התכווצויות שרירים, חשוב לתזמן כראוי אוספי עוברים מכיוון שההתכווצים מתחילים רק בשלב התפתחותי ספציפי. הדגמה חזותית צעד אחר צעד יכולה לסייע רבות בניתוח הכמותי של התהליכים ההתפתחותיים. להדמיה חיה של עוברי דרוסופילה רכובים, מניחים את העוברים על הבמה של מיקרוסקופ epifluorescence עם פונקציית timelapse ומצלמה דיגיטלית עם מסנני פליטה מתאימים ובחרו עדשה אובייקטיבית טבילת מים 10X.ואז וידאו חי להקליט את העוברים באמצעות תוכנת הקלטת מיקרוסקופ המתאים במשך כשעה עד שעתיים עם קצב רכישה של ארבע מסגרות לשנייה. בסוף הניסוי, לייצא את הווידאו המוקלט ישירות לתוך ImageJ. בחר תמונה וחיתוך כדי לצייר תיבה סביב כל עובר בודד כדי לחתוך את הקלטות הווידאו לגודל של כל עובר.לחצו על 'תמונה', 'שינוי צורה' ו'סובב' כדי לסובב את התמונות החתוכה כדי להגיע למיקום אנכי של קו האמצע של העובר ביחס למסך. כדי להגדיר מידות מרחק למיקרומטרים, לחץ על נתח והגדר קנה מידה ולאחר מכן הזן את גורם ההמרה הידוע של יחס פיקסל למיקרון עבור הגדרת המיקרוסקופ. כל המדידות הבאות ידווחו לאחר מכן במיקרומטרים.כדי לנתח את גלגול העובר, סמן תחילה את המיקום של קנה הנשימה של עובר אחד או את שניהם במסגרת הראשונה של הווידאו באמצע הדרך בין הקצוות האחוריים והמנייניים ולחץ על נתח, כלים ואזור של מנהל עניין. צייר תיבת שבעה מיקרומטר בקירוב על-ידי שבעה מיקרומטר מסביב קנה הנשימה ולחץ על מקש T בלוח המקשים כדי לתעד מיקום זה כמתאם XY. סמן את המיקום של אותו אזור של קנה הנשימה לאחר התכווצויות פריסטואליות של עניין ולצייר קו המחבר את המרכזים של כל תיבה לחיצה על M על המקלדת כדי למדוד את המרחק מעמדת טרום התכווצות למצב שלאחר התכווצות.כדי לנתח התכווצויות שרירים עובריות באמצעות עוברים המבטאים סמני שריר פלואורסצנטיים, השתמש בהקלטת הקריאה הפלואורסצנטית כדי לצייר אזור עניין שבמרכזו שרירי הפלואורסצנטיות של קטע גוף מסוים של עניין. בחר בכרטיסיה הוספת T במנהל אזור העניין כדי לתעד את מיקום אזור העניין. לחץ על אזור מנהל העניין ולמדוד כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטי הממוצעת של כל אזור עניין שנבחר עבור כל מסגרת של הסרטון.העבר את התיבה למרכזי מקטעי גוף אחרים של עניין ולחץ על הוסף T כדי לתעד את מיקומם כדי לקבל אזורים בעלי עניין זהה בכל מקטעי הגוף שיש לנתח. במנהל אזור העניין, החזק את מקש בקרה לחוץ בעת בחירת כל אזורי העניין שנרשמו כנקודות ציון של XY. לחץ על More ו- Multi-Measure כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל אזור מעניין עבור כל המסגרות של הווידאו.פעולה זו תדווח על כל מדידה בטבלה עם כל אזור מעניין כעמודה בטבלה וכל מסגרת כשורה. לאחר מכן העבר את הטבלה לתוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. התווה גרף עם מספר המסגרת על ציר ה- x ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בציר ה- y והמרת מספר המסגרת לזמן באמצעות ארבע המסגרות לשנייה.התכווצויות השרירים מגבירות את עוצמת ה-GFP כשהן מביאות יותר GFP לסביבה של אזור המוקד ככל שיותר שרירים נמשכים פנימה במהלך התכווצויות אלה. כדי לקבוע את משרעת התכווצות השריר, להעריך את עוצמת GFP הבסיסית כעוצמה הממוצעת של האזורים בין פסגות. לאחר מכן להעריך את העלייה בעוצמת פלואורסצנטיות GFP יחסית לקו בסיס זה.לאחר מכן חלקו כל אזור בעל ערך עוצמת ריבית בעוצמה הבסיסית כדי לנרמל את עוצמת GFP לקו הבסיס. השווה את התעצמויות GFP מנורמל בחלקים האחוריים, המדיאליים והפנימיים במהלך גל התכווצות השרירים כדי לבחון את השינויים בהיקף התכווצות השרירים ככל שהגל יתפשט ולקבוע את כיוון הגל. כדי להשוות את התכווצויות השרירים בצד שמאל ויימין של העובר, לנתח את התעצמות השיא עבור אותם מקטעים משני צידי העובר.השתמש משרעת התכווצות ואת העיתוי של הפסגות כדי לחשוף את ההבדלים, אם בכלל, ואת היקף ואת העיתוי של גלי התכווצות שרירים פריסטואלית. כאן התכווצויות שרירים פריסטואליות נורמליות בסוג פראי של עובר דרוסופילה מוצגות. בסרטון זה של גלגול בעובר מסוג פראי, שים לב כי התוספת הגבית אינה זזה בעוד קנה הנשימה עושה המציין כי העובר התגלגל בתוך הקליפה שלה.בניתוח מייצג זה, התכווצות השרירים מגיעה לשיאה במהלך תקופת הזמן של 165 עד 178 שניות מייצגת גל קדמי יחיד. עבור עובר זה, אין הבדל משרעת ואת הזמן של התכווצויות השריר נמדד על הצדדים הימניים והשמאליים של העובר. התכווצות פריסטואלית מוגדרת כגל קדמי מסוג אחד אם הפרופיל שלו הוא שיא המתעורר באזור האחורי ואחריו פסגות באזורים האמצעיים והקדום.גל אחד מסוג אחורה הוא שיא המתעורר תחילה במקטעים לפנים ולאחר מכן מתפיץ לכיוון אזורים אחוריים. סוג שני גלים מתחילים בקצה אחד של העובר ומתקדם לכיוון האזורים האמצעיים לפני שהם חוזרים למקורם כגל גורף שיזם מחדש בקצה הנגדי. עוברים מוטנטים יציבת הגוף להדגים תדירות יחסית חריגה של סוג אחד לסוג שני גל הדור שתביאים חריגות יציבת הגוף המיועד פיתיון הגוף או פנוטיפ סיבוב.כדי להשתמש פלואורסצנטיות כקריאת הפרמטרים התכווצות שריר, זה חיוני כדי להשתמש בעוברים עם כתב ברקמת השריר. שיטה זו יכולה לשמש להקלטה בו זמנית של התכווצויות השרירים של עוברים רבים ולהערכת התגובות לגירויים שונים, תרופות או שינויים סביבתיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...