Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान आरओ 1 एनएस099409, एनएस075534 और कॉनैसाइट 2012-037(एस) द्वारा वीपी को सहायता प्रदान की गई थी।

1. तैयारी
<ol><li>एक गर्म 25 जी सुई का उपयोग कर एक 100 एमएल क्षमता त्रि-कॉर्नर प्लास्टिक बीकर में लगभग 50 छेद बनाकर एक मक्खी पिंजरे तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।</li>
	<li>सेब का रस-आगर (3% agar और 30% सेब का रस) के स?...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

हमारी विधि विकास के दौरान महत्वपूर्ण भ्रूण व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है, जैसे कि तरंग आवर्तता, आयाम और पैटर्न सहित peristaltic मांसपेशियों में संकुचन तरंगों, साथ ही भ्रू?...

पेरिस्टेलटिक मांसपेशियों में संकुचन एक लयबद्ध मोटर व्यवहार है जो मनुष्यों में चलने और तैराकी के समान होता है1,2,3. Drosophila देर से चरण भ्रूण में देखा भ्रूण मांसपेशियों में संकुचन इस तरह के एक व्यवहार का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। Drosophila विभिन्न विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है क्योंकि Drosophila में भ्रूण विकास अच्छी तरह से विशेषता है, अपेक्षाकृत कम है, और निगरानी करने के लिए आसान. हमारी विधि के समग्र लक्ष्य को ध्यान से रिकॉर्ड और संकुचन और भ्रूण की मांसपेशियों की छूट की लहर की तरह पैटर्न का विश्लेषण है. हम एक विस्तृत दृश्य प्रदान करता है कि एक सरल, गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, रिकॉर्डिंग और मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण. इस विधि को भी संभावित रूप से vivo प्रक्रियाओं में अन्य अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के भ्रूण रोलिंग के रूप में देर से चरण भ्रूण में देखा बस से पहले hatching. पिछले अध्ययनों में भ्रूणीय मांसपेशी के संकुचन का अधिकतर विश्लेषण आवृत्ति तथा दिशा1,2के संदर्भ में किया जाता था . आदेश में संकुचन के सापेक्ष हद तक अनुमान के रूप में वे पूर्वकाल या पीछे की दिशा में शरीर अक्ष के साथ प्रगति, हम विशेष रूप से मांसपेशियों में GFP व्यक्त भ्रूण का इस्तेमाल किया है. यह विश्लेषण मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने के लिए और पता चलता है कि कैसे भ्रूण में शरीर की मुद्रा मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों की श्रृंखला के दौरान बनाए रखा है एक अधिक मात्रात्मक तरीका प्रदान करता है.
Peristaltic मांसपेशियों में संकुचन केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (CPG) सर्किट और परिधीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच संचार द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं (पीएनएस), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), और मांसपेशियों4,5. सामान्य peristaltic मांसपेशियों के संकुचन का उत्पादन करने में विफलता इस तरह के 2 और असामान्य लार्वा चलन6 हैच करने के लिए विफलता के रूप में दोष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। मांसपेशियों के संकुचन और संकुचन phenotypes के विस्तृत विश्लेषण के peristaltic तरंगों के लाइव इमेजिंग मांसपेशियों और चलन में शामिल तंत्रिका सर्किट को प्रभावित आनुवंशिक दोषों के साथ जुड़े रोगजनक तंत्र को उजागर करने में मदद कर सकते हैं। हमने हाल ही में उस दृष्टिकोण का उपयोग ऐसे तंत्रों की जांच करने के लिए किया है जिसके परिणामस्वरूप शरीर की मुद्रा में मरोड़ हो जाता है , पोटिन ओ-एमएनोससिलटीरैनस्फेरेस (पीओएमटी) म्यूटेंट7.
प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन (पोम) एक विशेष प्रकार का पोस्टट्रांसल संशोधन है, जहां एक मैनोस चीनी को स्रावपथप्रोटीन 8,9के सेरीन या थ्रियोनिन अवशेषों में जोड़ा जाता है। पोम में आनुवंशिक दोष के कारण मनुष्यों में जन्मजात पेशीय अपस्थीश (सीएमडी )10,11,12. हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila का उपयोग कर इन रोगों के कारक तंत्र की जांच की. हमने पाया कि ड्रोसोफिला प्रोटीन ओ-मैनोसिलट्रांसफरस जीन पोमटी1 और पोमटी2 (उर्फ घुमा हुआ पेट ( आरटी) और मुड़ (ट्वी) में उत्परिवर्तन के साथ भ्रूण एक दिखाते हैं शरीर के खंडों का विस्थापन ("रोटेशन") जिसके परिणामस्वरूप शरीर की असामान्य मुद्रा7होती है। दिलचस्प बात यह है कि यह दोष विकास की अवस्था के साथ हुआ जब peristaltic मांसपेशियों में संकुचन प्रमुख7हो जाते हैं.
चूंकि पोम उत्परिवर्ती भ्रूण में असामान्य शरीर मुद्रा तब उत्पन्न होती है जब पेशी और बाह्य त्वचा पहले से ही बनती है और समन्वित मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों शुरू कर दिया है, हम hypothesized कि असामान्य शरीर मुद्रा असामान्य मांसपेशियों का एक परिणाम हो सकता है संकुचन मांसपेशियों में दोष के बजाय या / और बाह्य आकृति विज्ञान7. सीएमडी असामान्य मांसपेशियों के संकुचन और मुद्रा दोष13के साथ जुड़ा हो सकता है , और इस प्रकार Drosophila POMT उत्परिवर्ती में आसन phenotype के विश्लेषण मांसपेशियों dystrophies के साथ जुड़े रोग तंत्र स्पष्ट कर सकते हैं . आदेश में Drosophila POMT म्यूटेंट और मांसपेशियों में संकुचन के peristaltic तरंगों में संभावित असामान्यताओं के शरीर मुद्रा phenotype के बीच संबंध की जांच करने के लिए, हम एक जीवित का उपयोग कर विस्तार से मांसपेशियों के संकुचन का विश्लेषण करने का फैसला किया इमेजिंग दृष्टिकोण.
Drosophila भ्रूण में peristaltic संकुचन तरंगों के हमारे विश्लेषण दो अलग संकुचन मोड, प्रकार 1 और प्रकार के रूप में नामित पता चला 2 तरंगों. प्रकार 1 तरंगों सरल तरंगों पूर्वकाल से पीछे या इसके विपरीत करने के लिए प्रचार कर रहे हैं। प्रकार 2 तरंगों biphasic तरंगों है कि पूर्वकाल के अंत में आरंभ कर रहे हैं, पीछे की दिशा में आधे रास्ते का प्रचार, क्षण भर में रोक, एक अस्थायी स्थिर संकुचन बनाने, और फिर, दूसरे चरण के दौरान, एक peristaltic संकुचन है कि प्रचार द्वारा बह रहे हैं पीछे के अंत से आगे. जंगली प्रकार भ्रूण आम तौर पर संकुचन की एक श्रृंखला है कि लगभग 75% प्रकार के होते हैं उत्पन्न 1 और 25% प्रकार 2 तरंगों. इसके विपरीत, POMT उत्परिवर्ती भ्रूण प्रकार उत्पन्न 1 और टाइप 2 तरंगों लगभग बराबर रिश्तेदार आवृत्तियों पर.
हमारा दृष्टिकोण मांसपेशियों के संकुचन और भ्रूण रोलिंग7के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है . इस दृष्टिकोण को मांसपेशियों में संकुचन से जुड़े अन्य व्यवहारों के विश्लेषण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि हैचिंग और रेंगने।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

समन्वित मांसपेशी संकुचन लयबद्ध व्यवहार का एक रूप है जो ड्रोसोफिला भ्रूण में विकास के दौरान जल्दी देखा जाता है। न्यूरोनल संवेदी प्रतिक्रिया सर्किट इस व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं. संकुचन के लयबद्ध पैटर्न का उत्पादन करने में विफलता तंत्रिका संबंधी असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। हमने पहले पाया है कि प्रोटीन ओ-मैनोसिलेशन में दोष, एक posttranslational प्रोटीन संशोधन, संवेदी न्यूरॉन्स के एक्सॉन आकारिकी को प्रभावित और भ्रूण में असामान्य समन्वित मांसपेशियों में संकुचन में परिणाम. यहाँ, हम रिकॉर्डिंग और देर से चरण भ्रूण के लाइव इमेजिंग द्वारा peristaltic मांसपेशियों के संकुचन के पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि प्रस्तुत करने के लिए hatching के बिंदु तक, जो हम प्रोटीन की मांसपेशियों के संकुचन phenotype की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया हे-मनोसिल्ट्रान्सेस म्यूटेंट्स। इन रिकॉर्डिंग से प्राप्त डेटा आवृत्ति सहित मांसपेशियों में संकुचन तरंगों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रसार की दिशा और विभिन्न शरीर क्षेत्रों में मांसपेशियों के संकुचन के रिश्तेदार आयाम. हम भी शरीर की मुद्रा की जांच की है और एक फ्लोरोसेंट मार्कर मांसपेशियों में विशेष रूप से व्यक्त करने के लिए सही भ्रूण midline की स्थिति का निर्धारण का लाभ उठाया. इसी तरह के दृष्टिकोण भी इस तरह के भ्रूण रोलिंग और hatching के रूप में विकास के दौरान विभिन्न अन्य व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

सामान्य peristaltic मांसपेशियों में संकुचन मूवी 1में एक WT (जंगली प्रकार, कैंटन-एस) भ्रूण में दिखाए जाते हैं। हमारे विश्लेषण में मांसपेशियों के संकुचन की peristaltic तरंगों की औसत आवृत्ति प्रति घंटे 47 संक?...

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Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

लाइव इमेजिंग और Drosophila भ्रूण में मांसपेशी संकुचन का विश्लेषण

यहाँ, हम एक गैर इनवेसिव और विस्तार उन्मुख तरीके से Drosophila भ्रूण में भ्रूण मांसपेशियों के संकुचन रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

यह विधि इस बात को संबोधित करती है कि मांसपेशियों के संकुचन और रोलिंग जैसी विकासात्मक प्रक्रियाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए जो ड्रोसोफिला भ्रूण में होते हैं। इस तकनीक के कुछ फायदे यह हैं कि यह अउपसिव और काफी विस्तृत है, फिर भी यह प्रदर्शन करना अपेक्षाकृत सरल है। भ्रूणीय मांसपेशियों के संकुचन और अन्य विकास प्रक्रियाओं को प्रभावित करने वाले नए उत्परिवर्तनों को अलग और विश्लेषण करने के लिए हमारी विधि को उच्च सामग्री विश्लेषण-आधारित स्क्रीनिंग के लिए और विकसित किया जा सकता है।मांसपेशियों के संकुचन की कल्पना करते समय, भ्रूण संग्रह को ठीक से समय देना महत्वपूर्ण है क्योंकि संकुचन केवल एक विशिष्ट विकासात्मक चरण में शुरू होते हैं। कदम-दर-कदम दृश्य प्रदर्शन विकास प्रक्रियाओं के मात्रात्मक विश्लेषण में बहुत सहायता कर सकता है। घुड़सवार ड्रोसोफिला भ्रूण की लाइव इमेजिंग के लिए, भ्रूण को एक टाइमलैप्स फ़ंक्शन और उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक डिजिटल कैमरा के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और 10X पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस का चयन करें।फिर लाइव वीडियो प्रति सेकंड चार फ्रेम की अधिग्रहण दर के साथ लगभग एक से दो घंटे के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर भ्रूण रिकॉर्ड करता है। प्रयोग के अंत में, रिकॉर्ड किए गए वीडियो को सीधे इमेजजे में निर्यात करें। प्रत्येक भ्रूण के आकार के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग फसल के लिए प्रत्येक व्यक्ति भ्रूण के आसपास एक बॉक्स आकर्षित करने के लिए छवि और फसल का चयन करें ।क्लिक करें छवि, ट्रांसफॉर्म और स्क्रीन के सापेक्ष भ्रूण मिडलाइन की एक ऊर्ध्वाधर स्थिति को प्राप्त करने के लिए फसली छवियों को घुमाने के लिए बारी से । माइक्रोमीटर तक दूरी माप निर्धारित करने के लिए, विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करें, फिर अपने माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए ज्ञात पिक्सेल को माइक्रोएन अनुपात रूपांतरण कारक में दर्ज करें। इसके बाद के सभी मापों की रिपोर्ट माइक्रोमीटर में दी जाएगी ।भ्रूण रोलिंग का विश्लेषण करने के लिए, पहले पीछे और पूर्वकाल समाप्त होता है और विश्लेषण, उपकरण और ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र के बीच वीडियो मिडवे के पहले फ्रेम में एक या दोनों श्वासनली की स्थिति को चिह्नित करें । श्वासनली के चारों ओर सात माइक्रोमीटर बॉक्स द्वारा लगभग सात माइक्रोमीटर ड्रा करें और एक्सवाई समन्वय के रूप में इस स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए कीबोर्ड पर टी कुंजी पर क्लिक करें। ब्याज के परिस्ताटिक संकुचन के बाद श्वासनली के एक ही क्षेत्र की स्थिति को चिह्नित करें और पूर्व-संकुचन स्थिति से संकुचन की स्थिति से दूरी को मापने के लिए कीबोर्ड पर एम क्लिक करने वाले प्रत्येक बॉक्स के केंद्रों को जोड़ने वाली एक लाइन खींचें।फ्लोरोसेंट मांसपेशी मार्कर व्यक्त भ्रूण का उपयोग कर भ्रूण की मांसपेशियों संकुचन का विश्लेषण करने के लिए, ब्याज के एक विशेष शरीर खंड की फ्लोरेसेपिंग मांसपेशियों के आसपास केंद्रित ब्याज के एक क्षेत्र आकर्षित करने के लिए फ्लोरोसेंट readout की रिकॉर्डिंग का उपयोग करें । ब्याज के क्षेत्र की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र में ऐड टी टैब का चयन करें। वीडियो के प्रत्येक फ्रेम के लिए चुने गए ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता को रिकॉर्ड करने के लिए ब्याज प्रबंधक और उपाय के क्षेत्र पर क्लिक करें।बॉक्स को ब्याज के अन्य निकाय खंडों के केंद्रों पर ले जाएं और विश्लेषण किए जाने वाले सभी शरीर खंडों में समान आकार के हित के क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए अपनी स्थिति रिकॉर्ड करने के लिए जोड़ें टी पर क्लिक करें। ब्याज प्रबंधक के क्षेत्र में, XY निर्देशांक के रूप में दर्ज ब्याज के सभी क्षेत्रों का चयन करते समय नियंत्रण कुंजी पकड़ो। वीडियो के सभी फ्रेम के लिए ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र की औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए अधिक और बहु-उपाय पर क्लिक करें।यह तालिका के कॉलम के रूप में ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के साथ एक तालिका में प्रत्येक माप और पंक्ति के रूप में प्रत्येक फ्रेम की रिपोर्ट करेगा। फिर आगे के विश्लेषण के लिए टेबल को स्प्रेडशीट प्रोग्राम में स्थानांतरित करें। एक्स-एक्सिस पर फ्रेम नंबर और वाई-एक्सिस पर मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ एक ग्राफ प्लॉट करें और फ्रेम नंबर को चार फ्रेम प्रति सेकंड फ्रेम रेट का उपयोग करके समय पर परिवर्तित करें।मांसपेशियों के संकुचन जीएफपी तीव्रता को बढ़ाते हैं क्योंकि वे फोकल क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में अधिक जीएफपी लाते हैं क्योंकि इन संकुचनों के दौरान अधिक मांसपेशियां खींच ली जाती हैं। मांसपेशियों में संकुचन आयाम निर्धारित करने के लिए, चोटियों के बीच क्षेत्रों की औसत तीव्रता के रूप में बेसलाइन जीएफपी तीव्रता का अनुमान लगाएं। फिर इस आधार रेखा के सापेक्ष जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि का आकलन करें।फिर जीएफपी तीव्रता को आधार रेखा तक सामान्य बनाने के लिए आधारभूत तीव्रता से ब्याज तीव्रता मूल्य के हर क्षेत्र को विभाजित करें। मांसपेशियों के संकुचन तरंग के दौरान पीछे, मध्य और पूर्वकाल खंडों में सामान्यीकृत जीएफपी तीव्रता की तुलना करें ताकि मांसपेशियों के संकुचन की सीमा में परिवर्तन की जांच की जा सके क्योंकि तरंग प्रचारित होती है और तरंग की दिशा निर्धारित करती है। भ्रूण के बाएं और दाएं किनारों पर मांसपेशियों के संकुचन की तुलना करने के लिए, भ्रूण के दोनों किनारों पर एक ही खंडों के लिए चोटी की तीव्रता का विश्लेषण करें।संकुचन आयाम और चोटियों के समय का उपयोग करने के लिए मतभेदों को प्रकट, यदि कोई हो, और हद तक और peristaltic मांसपेशियों संकुचन तरंगों के समय । यहां एक जंगली प्रकार ड्रोसोफिला भ्रूण में सामान्य पेरिस्टाल्टिक मांसपेशियों के संकुचन दिखाए जाते हैं। एक जंगली प्रकार के भ्रूण में रोलिंग के इस वीडियो में, ध्यान दें कि पृष्ठीय उपांग नहीं चलता है, जबकि श्वासनली यह दर्शाता है कि भ्रूण अपने खोल के भीतर लुढ़का है ।इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, 165 से 178-दूसरी बार अवधि के दौरान मांसपेशियों में संकुचन चोटियों एक ही आगे की लहर का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस भ्रूण के लिए, आयाम में कोई अंतर नहीं और मांसपेशियों के संकुचन के समय भ्रूण के दाईं और बाईं ओर मापा गया था। एक परिस्त संकुचन को आगे के प्रकार की एक लहर के रूप में नामित किया जाता है यदि इसकी प्रोफ़ाइल में एक चोटी होती है जो पहले मध्य और पूर्वकाल क्षेत्रों में चोटियों के बाद पीछे के क्षेत्र में उत्पन्न होती है।एक पिछड़े प्रकार एक लहर एक चोटी है कि पहले पूर्वकाल क्षेत्रों में उठता है और फिर पीछे के क्षेत्रों की ओर प्रचार करता है । टाइप दो तरंगों भ्रूण के एक छोर पर शुरू और एक व्यापक लहर के रूप में अपने मूल में लौटने से पहले मध्य क्षेत्रों की ओर आगे बढ़ना फिर से विपरीत अंत में शुरू की । शरीर मुद्रा उत्परिवर्ती भ्रूण टाइप वन की एक असामान्य सापेक्ष आवृत्ति को दो तरंग पीढ़ी टाइप करने के लिए प्रदर्शित करता है जिसके परिणामस्वरूप शरीर की मुद्रा असामान्यता शरीर मरोड़ या रोटेशन फेनोटाइप के रूप में नामित होती है।मांसपेशियों में संकुचन मापदंडों के लिए एक readout के रूप में फ्लोरेसेंस का उपयोग करने के लिए, मांसपेशियों के ऊतकों में एक रिपोर्टर के साथ भ्रूण का उपयोग करना आवश्यक है। इस विधि का उपयोग कई भ्रूणों के मांसपेशियों के संकुचन की एक साथ रिकॉर्डिंग और विभिन्न उत्तेजनाओं, दवाओं या पर्यावरणीय परिवर्तनों के जवाबों के आकलन के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

का लाइव-इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; पोटा संबंधी नेत्र

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

एक लाइव zebrafish भ्रूण में mitotic डिवीजन और गतिशीलता अवलोकन

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

लंबे समय तक की लाइव इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; नेत्र डिस्क

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

इन विट्रो Arabidopsis थालियाना में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए बीजांड खेती

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo में मांसपेशी की इमेजिंग- Drosophila कोषस्थों में पट्टा Morphogenesis

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

लाइव, बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन के विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला लार्वा और पुपल टेस्ट की तैयारी

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

लाइव हीट में इमेजिंग इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड्स ने ड्रोसोफिला भ्रूण पर जोर दिया

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण तैयारी और माइक्रोइंजेक्शन एक स्वचालित उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करके किया जाता है

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...