Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Il progetto è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534 e CONACYT 2012-037 (S) a VP.

1. Preparazione
<ol><li>Preparare una gabbia di mosca facendo circa 50 fori in un bicchiere di plastica tri-angolo di capacità 100 mL utilizzando un aghi caldo 25 G (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare 60 mm x 15 mm piatti Petri con succo di mela-agar (3% agar e 30% succo di mela).</li>
	<li>Preparare la pasta di lievito fresco mescolando granuli di lievito secco e acqua. Stendere la pasta di lievito sui piatti di agar di mela per aumentare la deposizione delle uova.</li>
	<li>Anasthetizz...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

Il nostro metodo fornisce un modo quantitativo per analizzare importanti comportamenti embrionali durante lo sviluppo, come le onde di contrazione muscolare peristale, tra cui la periodicità delle onde, l'ampiezza e il modello, nonché l'effetto delle onde sul rotolamento e sulla postura. Questo può essere utile nelle analisi di diversi mutanti per studiare il ruolo di geni specifici nella regolazione di questi e altri comportamenti durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo utilizzato cambiamenti nell'intensità del marc...

La contrazione muscolare peristaltica è un comportamento motorio ritmico simile al camminare e nuotare negli esseri umani1,2,3. Le contrazioni muscolari embrionali osservate negli embrioni in fase avanzata della Drosophila rappresentano un esempio di tale comportamento. La Drosophila è un eccellente organismo modello per studiare vari processi di sviluppo perché lo sviluppo embrionale nella Drosophila è ben caratterizzato, relativamente breve e facile da monitorare. L'obiettivo generale del nostro metodo è quello di registrare e analizzare attentamente il modello ondulatorio di contrazione e rilassamento dei muscoli embrionali. Abbiamo usato un approccio semplice e non invasivo che offre una visualizzazione dettagliata, la registrazione e l'analisi delle contrazioni muscolari. Questo metodo può anche essere potenzialmente utilizzato per studiare altri processi in vivo, come il rotolamento embrionale visto negli embrioni in fase avanzata appena prima della schiusa. In studi precedenti, le contrazioni muscolari embrionali sono state analizzate per lo più in termini di frequenza e direzione1,2. Per stimare l'entità relativa delle contrazioni man mano che progrediscono lungo l'asse del corpo nella direzione anteriore o posteriore, abbiamo usato embrioni che esprimono GFP in modo specifico nei muscoli. Questa analisi fornisce un modo più quantitativo per analizzare le contrazioni muscolari e per rivelare come la postura del corpo negli embrioni viene mantenuta durante una serie di onde peristaliche di contrazioni muscolari.
Le contrazioni muscolari peristaltiche sono controllate da circuiti centrali del generatore di pattern (CPG) e comunicazioni tra neuroni del sistema nervoso periferico (PNS), il sistema nervoso centrale (SNC) e muscoli4,5. La mancata produzione di normali contrazioni muscolari peristaliche può portare a difetti come la mancata schiusa2 e la locomozione larvale anormale6 e può essere indicativa di anomalie neurologiche. L'imaging dal vivo di onde peristalitiche di contrazione muscolare e l'analisi dettagliata dei fenotipi di contrazione possono aiutare a scoprire i meccanismi patogeni associati ai difetti genetici che interessano i muscoli e i circuiti neurali coinvolti nella locomozione. Recentemente abbiamo usato questo approccio per studiare i meccanismi che provocano una postura del corpo torsione fenotipo di proteino O-mannosyltransferase (POMT) mutanti7.
Protein O-mannosylation (POM) è un tipo speciale di modifica post-traduzionale, dove uno zucchero mannoso viene aggiunto ai residui di serine o di treonina di proteine della via secretoria8,9. I difetti genetici nella POM causano distrofie muscolari congenite (CMD) negli esseri umani10,11,12. Abbiamo studiato i meccanismi causali di queste malattie usando la Drosophila come sistema modello. Abbiamo scoperto che gli embrioni con mutazioni nella proteina della Proteina di Drosophila O-mannosyltransferasis geni POMT1 e POMT2 (a.k.a. addominale ruotato (rt) e contorti (tw )) mostrano un spostamento ("rotazione") di segmenti del corpo, che si traduce in una postura anormale del corpo7. È interessante notare che, questo difetto ha coinciso con la fase di sviluppo quando le contrazioni muscolari peristaliche diventano prominenti7.
Poiché la postura anomala del corpo negli embrioni mutanti di POM si verifica quando la muscolatura e l'epidermide sono già formate e sono iniziate onde peristaliche di contrazioni muscolari coordinate, abbiamo ipotizzato che la postura anormale del corpo potrebbe essere il risultato di un muscolo anormale contrazioni piuttosto che un difetto nella morfologia muscolare o/e epidermide7. I CMD possono essere associati a contrazioni muscolari anormali e difetti postura1,e quindi l'analisi del fenotipo della postura nei mutanti PSIMT Drosophila può chiarire i meccanismi patologici associati a distrofie muscolari . Al fine di studiare la relazione tra il fenotipo della postura del corpo dei mutanti Posophila POMT e le possibili anomalie nelle onde peristaliche delle contrazioni muscolari, abbiamo deciso di analizzare le contrazioni muscolari in dettaglio utilizzando un approccio imaging.
La nostra analisi delle onde di contrazione peristale negli embrioni di Drosophila ha rivelato due modalità di contrazione distinte, designate come onde di tipo 1 e di tipo 2. Le onde di tipo 1 sono onde semplici che si propagano da anteriore a posteriore o viceversa. Le onde di tipo 2 sono onde bifasiche che iniziano all'estremità anteriore, si propagano a metà della direzione posteriore, si fermano momentaneamente, formando una contrazione statica temporale, e poi, durante la seconda fase, vengono spazzate da una contrazione peristale che propaga in avanti dall'estremità posteriore. Gli embrioni selvatici di tipo selvaggio normalmente generano una serie di contrazioni che consiste di circa 75% tipo 1 e 25% di tipo 2 onde. Al contrario, gli embrioni mutanti POMT generano onde di tipo 1 e tipo 2 a frequenze relative approssimativamente uguali.
Il nostro approccio può fornire informazioni dettagliate per l'analisi quantitativa delle contrazioni muscolari e del rotolamento degli embrioni7. Questo approccio potrebbe anche essere adattato per l'analisi di altri comportamenti che coinvolgono contrazioni muscolari, come la schiusa e la scansione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

Le contrazioni muscolari coordinate sono una forma di comportamento ritmico visto all'inizio durante lo sviluppo negli embrioni della Drosophila. I circuiti di feedback sensoriale neuronale sono necessari per controllare questo comportamento. La mancata produzione del modello ritmico delle contrazioni può essere indicativa di anomalie neurologiche. In precedenza abbiamo scoperto che i difetti nella proteina O-mannosilation, una modificazione delle proteine post-traduzionale, influenzano la morfologia degli assoni dei neuroni sensoriali e provocano contrazioni muscolari coordinate anormali negli embrioni. Qui, presentiamo un metodo relativamente semplice per registrare e analizzare il modello delle contrazioni muscolari peristalitiche mediante l'imaging dal vivo di embrioni in fase avanzata fino al punto di schiusa, che abbiamo usato per caratterizzare il fenotipo di contrazione muscolare delle proteine Mutanti O-mannosyltransferase. I dati ottenuti da queste registrazioni possono essere utilizzati per analizzare le onde di contrazione muscolare, tra cui la frequenza, la direzione di propagazione e l'ampiezza relativa delle contrazioni muscolari in diversi segmenti del corpo. Abbiamo anche esaminato la postura del corpo e sfruttato un marcatore fluorescente espresso specificamente nei muscoli per determinare con precisione la posizione della linea mediana dell'embrione. Un approccio simile può anche essere utilizzato per studiare vari altri comportamenti durante lo sviluppo, come il rotolamento degli embrioni e la schiusa.

Le normali contrazioni muscolari peristaltiche sono mostrate in un embrione WT (wild-type, Canton-S) nel film 1. La frequenza media delle onde peristalitiche delle contrazioni muscolari nella nostra analisi era di 47 contrazioni all'ora e l'ampiezza media era del 60% superiore alla linea di base per gli embrioni WT. Il rotolamento dell'embrione è mostrato per un embrione WT nel film 2, con la freccia bianca che segna la posizione iniziale di una trachea e una freccia nera che ...

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Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Qui, presentiamo un metodo per registrare le contrazioni muscolari embrionali negli embrioni della Drosophila in modo non invasivo e orientato ai dettagli.

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Questo metodo affronta come analizzare i processi di sviluppo come le contrazioni muscolari e il rotolamento che si verificano nell'embrione Drosophila. Alcuni vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva e abbastanza dettagliata, ma è relativamente semplice da eseguire. Il nostro metodo può essere ulteriormente sviluppato per lo screening basato sull'analisi ad alto contenuto per isolare e analizzare nuove mutazioni che influenzano le contrazioni muscolari embrionali e altri processi di sviluppo.Quando si visualizzano le contrazioni muscolari, è importante temporizzare correttamente le raccolte di embrioni perché le contrazioni iniziano solo in una fase di sviluppo specifica. La dimostrazione visiva dettagliata può aiutare notevolmente nell'analisi quantitativa dei processi di sviluppo. Per l'imaging dal vivo di embrioni Drosophila montati, posizionare gli embrioni sullo stadio di un microscopio a epifluorescenza con funzione timelapse e una fotocamera digitale con filtri di emissione adatti e selezionare un obiettivo di immersione in acqua 10X.Quindi i video in diretta registrano gli embrioni utilizzando l'appropriato software di registrazione al microscopio per circa una o due ore con una velocità di acquisizione di quattro fotogrammi al secondo. Alla fine dell'esperimento, esportare il video registrato direttamente in ImageJ. Seleziona l'immagine e ritaglia per disegnare una scatola intorno a ogni singolo embrione per ritagliare le registrazioni video alle dimensioni di ogni embrione.Fate clic su Immagine (Image), Trasforma (Transform) e Ruota (Rotate) per ruotare le immagini ritagliate per ottenere una posizione verticale della linea mediana dell'embrione rispetto allo schermo. Per impostare le misurazioni della distanza su micrometri, fate clic su Analizza (Analyze) e imposta scala (Set Scale), quindi immettete il fattore di conversione noto tra pixel e micron ratio per la configurazione del microscopio. Tutte le misurazioni successive saranno quindi riportate in micrometri.Per analizzare il rotolamento dell'embrione, contrassegnare innanzitutto la posizione di una o entrambe le trachee di un embrione nel primo fotogramma del video a metà strada tra le estremità posteriore e anteriore e fare clic su Analizza, Strumenti e Region of Interest Manager. Disegna una casella approssimativa di sette micrometri per sette micrometri intorno alla trachea e fai clic sul tasto T sulla tastiera per registrare questa posizione come coordinata XY. Contrassegnare la posizione della stessa area della trachea dopo contrazioni peristaltiche di interesse e tracciare una linea che colleghi i centri di ogni casella facendo clic su M sulla tastiera per misurare la distanza dalla posizione di pre-contrazione alla posizione post-contrazione.Per analizzare le contrazioni muscolari embrionali utilizzando embrioni che esprimono marcatori muscolari fluorescenti, utilizzare la registrazione della lettura fluorescente per disegnare una regione di interesse incentrata sui muscoli fluorescenti di un particolare segmento corporeo di interesse. Selezionare la scheda Aggiungi T in Gestione regioni di interesse per registrare la posizione dell'area di interesse. Fare clic su Region of Interest Manager e Measure per registrare l'intensità fluorescente media di ogni area di interesse selezionata per ogni fotogramma del video.Spostate la casella ai centri di altri segmenti di corpo di interesse e fate clic su Aggiungi T per registrare le loro posizioni per ottenere regioni di interesse di dimensioni identiche in tutti i segmenti del corpo da analizzare. In Region of Interest Manager tenere premuto ctrl selezionando tutte le regioni di interesse registrate come coordinate XY. Fate clic su Altro (More) e Multi-misura (Multi-Measure) per misurare l'intensità fluorescente media di ogni regione di interesse per tutti i fotogrammi del video.In questo modo ogni misurazione verrà riportata in una tabella con ogni area di interesse come colonna della tabella e ogni fotogramma come riga. Quindi trasferire la tabella in un programma di fogli di calcolo per ulteriori analisi. Tracciate un grafico con il numero di fotogramma sull'asse x e l'intensità media della fluorescenza sull'asse y e convertite il numero di fotogramma nel tempo utilizzando i quattro fotogrammi al secondo.Le contrazioni muscolari aumentano l'intensità della GFP in quanto portano più GFP in prossimità dell'area focale man mano che più muscoli vengono tirati durante queste contrazioni. Per determinare l'ampiezza della contrazione muscolare, stimare l'intensità della FPG di base come intensità media delle regioni tra i picchi. Quindi valutare l'aumento dell'intensità di fluorescenza della FPG rispetto a questa linea di base.Quindi dividi ogni valore di intensità della regione di interesse per l'intensità della linea di base per normalizzare l'intensità della FPG alla linea di base. Confrontare le intensità GFP normalizzate nei segmenti posteriore, mediale e anteriore durante l'onda di contrazione muscolare per esaminare i cambiamenti nell'estensione della contrazione muscolare man mano che l'onda si propaga e per determinare la direzione dell'onda. Per confrontare le contrazioni muscolari sui lati sinistro e destro dell'embrione, analizzare le intensità di picco per gli stessi segmenti su entrambi i lati dell'embrione.Usa l'ampiezza della contrazione e la tempistica dei picchi per rivelare le eventuali differenze, e l'estensione e la tempistica delle onde di contrazione muscolare peristaltica. Qui vengono mostrate normali contrazioni muscolari peristaltiche in un embrione di Drosophila di tipo selvatico. In questo video di rotolamento in un embrione di tipo selvatico, si noti che l'appendice dorsale non si muove mentre la trachea indica che l'embrione è rotolato all'interno del suo guscio.In questa analisi rappresentativa, i picchi di contrazione muscolare durante il periodo di tempo da 165 a 178 secondi rappresentano una singola onda in avanti. Per questo embrione, nessuna differenza nell'ampiezza e nel tempo delle contrazioni muscolari è stata misurata sul lato destro e sinistro dell'embrione. Una contrazione peristaltica è designata come onda di tipo 1 anteriore se il suo profilo ha un picco che si presenta nella regione posteriore per primo seguito da picchi nelle regioni centrali e anteriori.Un'onda di tipo uno all'indietro è un picco che si verifica prima nei segmenti anteriori e poi si propaga verso le regioni posteriori. Le onde di tipo due iniziano da un'estremità dell'embrione e procedono verso le regioni centrali prima di tornare alla loro origine come un'onda di spazzamento ria iniziata all'estremità opposta. Gli embrioni mutanti della postura corporea dimostrano una frequenza relativa anomala di tipo uno alla generazione di onde di tipo due che si traduce in un'anomalia della postura corporea designata come torsione del corpo o fenotipo di rotazione.Per usare la fluorescenza come lettura per i parametri di contrazione muscolare, è essenziale utilizzare embrioni con un reporter nel tessuto muscolare. Questo metodo può essere utilizzato per la registrazione simultanea delle contrazioni muscolari di molti embrioni e per la valutazione delle risposte a vari stimoli, farmaci o cambiamenti ambientali.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

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Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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