Name: live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo
Uploaded: 2019-07-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Proje kısmen sağlık hibe RO1 NS099409, NS075534 ve CONACYT 2012-037 (S) VP için ulusal enstitüler tarafından desteklenmektedir.

1. hazırlık
<ol><li>Bir sıcak 25 G iğne kullanarak bir 100 ml kapasiteli üç köşe plastik kabı yaklaşık 50 delik yaparak bir sinek kafesi hazırlayın ( malzeme tablosunabakın).</li>
	<li>Hazırlama 60 mm x 15 mm Petri yemekleri elma suyu ile-agar (3% Agar ve 30% elma suyu).</li>
	<li>Kuru Maya granül ve su karıştırma taze Maya hamur hazırlayın. Yumurta döşeme artırmak için elma agar plakaları üzerine Maya hamur Spread.</li>
	<li>50-60 sinekler hakkında anestezi (erkek ve dişi ...

<ol>
	<li>Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+patterned+movement+during+late+embryogenesis+of+Drosophila.">The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).</li><li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input.">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li><li>Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+motor+coordination+in+Drosophila+embryos.">The development of motor coordination in Drosophila embryos.</a> Development. 135, 3707-3717 (2008).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).</li><li>Gorczyca, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ppk26,+a+DEG/ENaC+channel+functioning+with+Ppk1+in+a+mutually+dependent+manner+to+guide+locomotion+behavior+in+Drosophila.">Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila.</a> Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).</li><li>Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-Mannosyltransferases+affect+sensory+axon+wiring+and+dynamic+chirality+of+body+posture+in+the+Drosophila+embryo.">Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo.</a> Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).</li><li>Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+O-mannosylation+in+animal+development+and+physiology:+From+human+Disorders+to+Drosophila+phenotypes.">Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).</li><li>Lyalin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+twisted+gene+encodes+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+2+and+genetically+interacts+with+the+rotated+abdomen+gene+encoding+Drosophila+protein+O-mannosyltransferase+1.">The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1.</a> Genetics. 172, 343-353 (2006).</li><li>Beltr&#225;n-Valero de Bernabe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+O-Mannosyltransferase+gene+POMT1+give+rise+to+the+severe+neuronal+migration+disorder+Walker-Warburg+Syndrome.">Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).</li><li>Reeuwijk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=POMT2+mutations+cause+alpha-dystroglycan+hypoglycosylation+and+Walker-Warburg+syndrome.">POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome.</a> Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).</li><li>Jaeken, J., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+disorders+of+glycosylation:+A+rapidly+expanding+disease+family.">Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family.</a> Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).</li><li>Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+muscular+dystrophy:+a+review+of+the+literature.">Congenital muscular dystrophy: a review of the literature.</a> Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).</li><li>Roberts, D. B., Hames, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+A+Practical+Approach.+2nd+ed.">Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed.</a> The Practical Approach Series. , 389 (1998).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped++interneurons+are+core+components+of+a+sensorimotor+circuit+that+maintains+left-right+symmetric+muscle+contraction+amplitude.">Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude.</a> Neuron. 88, 314-329 (2015).</li><li>Penjweini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin:+a+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE.">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).</li></ol>

Yöntemimiz, dalga periodicity, genlik ve desen gibi peristaltik kas kasılma dalgaları, embriyo haddeleme ve duruş üzerinde dalga etkisi gibi gelişim sırasında önemli embriyo davranışlarını analiz etmek için nicel bir yol sağlar. Bu, embriyonik gelişim sırasında bu ve diğer davranışları düzenleyen belirli genlerin rolünü incelemek için farklı mutantların analizinde yararlı olabilir. Biz kas kasılma genliği, frekans ve embriyoların kasılma dalgası yayılma yönünü analiz etmek için kasl...

Peristaltik kas kasılma, insanlar1,2,3yürüyüş ve yüzme benzer bir ritmik motor davranışıdır. Drosophila geç evre embriyolar görülen embryonik kas kasılmaları böyle bir davranış örneği temsil eder. Drosophila çeşitli gelişimsel süreçleri incelemek için mükemmel bir model organizmadır, çünkü Drosophila 'da embriyonik gelişim iyi karakterize edilir, nispeten kısa ve izlenmesi kolay. Bizim yöntemin genel amacı dikkatle kaydetmek ve kasılma ve embriyonik kasların rahatlama dalga boyunu desen analiz etmektir. Biz ayrıntılı bir görselleştirme, kayıt ve kas kasılmaları analizi sunan basit, non-invaziv bir yaklaşım kullandık. Bu yöntem de potansiyel olarak diğer in vivo süreçleri incelemek için kullanılabilir, gibi embriyonik Rolling geç evre embriyolar sadece önce tarlama öncesinde görülen. Önceki çalışmalarda, embriyonik kas kasılmaları çoğunlukla frekans ve yön1,2açısından analiz edildi. Anterior veya posterior yönde vücut ekseni boyunca ilerleme olarak kasılmalar bağıl kapsamını tahmin etmek için, biz kas özellikle GFP ifade embriyoları kullandık. Bu analiz, kas kasılmaları analiz etmek ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar serisi sırasında embriyolar vücut duruş nasıl sürdürülür ortaya çıkarmak için daha nicel bir yol sağlar.
Peristaltik kas kasılmaları merkezi desen jeneratör (CPG) devreler ve periferik sinir sistemi (PNS), merkezi sinir sistemi (CNS) ve kaslar4,5nöronlar arasında iletişim tarafından kontrol edilir. Normal peristaltik kas kasılmaları üretmek için başarısızlık,2 ve anormal larva lokomolojik6 ve nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir kaçak gibi kusurları neden olabilir. Kas kasılma ve kasılma fenotiplerinin detaylı analizi peristaltik dalgaların canlı görüntüleme, lokomotif dahil kaslar ve nöral devreleri etkileyen genetik kusurları ile ilişkili patojen mekanizmaları ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Son zamanlarda bu yaklaşım, pRotein O-mannosyltransferaz (pomt) mutantlar7bir vücut duruş torsiyon fenotürü neden mekanizmaları araştırmak için kullandık.
Protein O-mannosylation (POM) posttranslasyonel modifikasyon özel bir türüdür, bir mannoz şeker serin eklenir ya da salgı yolu proteinleri treonin kalıntıları8,9. Genetik kusurları POM neden konjenital kas distrophies (CMD) insanlarda10,11,12. Bu hastalıkların etken mekanizmalarını model sistemi olarak Drosophila kullanarak araştırdık. Biz Drosophila protein O-mannosyltransferase genler POMT1 ve POMT2 (aka Döndürülmüş karın (RT) ve bükülmüş (tw)) içinde mutasyonlar ile embriyo bulundu bir anormal vücut duruş sonuçları vücut segmentleri, deplasman ("dönme")7. İlginçtir ki, bu kusur, peristaltik kas kasılmaları belirgin hale geldiğinde gelişimsel aşamasına denk gelmiştir7.
Kaslı ve epidermis zaten oluşmuş ve koordine kas kasılmaları peristaltik dalgalar başladı POM mutant embriyolar anormal vücut duruş doğar beri, biz anormal vücut duruş anormal kas bir sonucu olabilir hipotez kas veya/ve epidermis morfoloji bir kusur yerine kasılmalar7. CMDS anormal kas kasılmaları ve duruş kusurları ile ilişkili olabilir13, ve böylece Drosophila pomt mutantlarda duruş fenotipi Analizi kas distrophies ile ilişkili patolojik mekanizmaları aydınlatmak olabilir . Drosophila pomt mutantların vücut duruş fenotipi ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar olası anomaliler arasındaki ilişkiyi incelemek için, biz canlı kullanarak detaylı kas kasılmaları analiz karar verdi görüntüleme yaklaşımı.
Drosophila embriyolarında peristaltik kasılma dalgaları analizimiz, tip 1 ve tip 2 dalgaları olarak belirlenmiş iki farklı kasılma modu ortaya koydu. Tip 1 dalgalar anterior posterior veya tersi yayılan basit dalgalar vardır. Tip 2 dalgalar anterior ucunda Başlatan bifazik dalgalar, posterior yönde yarım yaymak, anlık durağan, bir temporal statik kasılma şekillendirme, ve daha sonra, ikinci aşamada, yayar bir peristaltik kasılma tarafından süpürülür arka ucunda ileri. Vahşi tip embriyolar normalde yaklaşık 75% tip 1 ve% 25 tip 2 dalgadan oluşan bir dizi kasılmalar üretir. Buna karşılık, Pomt mutant embriyo türü 1 ve tip 2 dalgalar yaklaşık eşit göreli Frekanslar oluşturur.
Yaklaşımımız kas kasılmaları ve embriyo haddeleme7nicel analizi için ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Bu yaklaşım, kas kasılmaları içeren diğer davranışların analizine de uyarlanabilir, örneğin tarama ve tarama gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Digital camera</td>
			<td style="width:155px;">Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td style="width:283px;">With different emission filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Forceps</td>
			<td style="width:155px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LED</td>
			<td style="width:155px;">X-cite BDX (Excelitas)</td>
			<td style="width:119px;">XLED1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope</td>
			<td style="width:155px;">Carl Ziess Examiner D1</td>
			<td style="width:119px;">491405-0005-000</td>
			<td>Epiflourescence with time lapse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Needle</td>
			<td style="width:155px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305767</td>
			<td>25 G x 1-1/2 in</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:155px;">Contemporary crafts</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any paintbrush will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25384-164</td>
			<td>60 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Software</td>
			<td style="width:155px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thread Zap Wax pen</td>
			<td style="width:155px;">Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">TZ1300</td>
			<td>Burner Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:215px;">Tricorner plastic beaker</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>25384-152</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging and analysis of muscle contractions in drosophila embryo

Eşgüdümlü kas kasılmaları, Drosophila embriyolarında gelişme sırasında erken görülen ritmik davranışların bir biçimidir. Neuronal duyusal geri besleme devreleri bu davranışı kontrol etmek için gereklidir. Kasılmalar ritmik deseni üretmek için başarısızlık nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir. Daha önce protein o-mannosylation kusurları, bir posttranslasyonel protein modifikasyon, duyusal nöronların Akon morfolojisi etkileyen ve embriyolar anormal koordine kas kasılmaları sonucu bulundu. Burada, biz protein kas kasılma fenotipi karakterize etmek için kullanılan hatching noktasına kadar geç evre embriyo canlı görüntüleme tarafından peristaltik kas kasılmaları desen kayıt ve analiz için nispeten basit bir yöntem sunuyoruz O-mannosyliltransferase mutantlar. Bu kayıtlardan elde edilen veriler, farklı vücut segmentlerinde kas kasılmasının frekans, yayılma yönü ve bağıl amplitül gibi kas kasılma dalgalarını analiz etmek için kullanılabilir. Biz de vücut duruş incelenmiştir ve doğru embriyo orta çizgi konumunu belirlemek için kaslar özellikle ifade edilen bir floresan işaretçinin avantajlarından alınmıştır. Benzer bir yaklaşım da embriyo haddeleme ve hatching gibi geliştirme sırasında çeşitli davranışları incelemek için kullanılabilir.

Normal peristaltik kas kasılmaları Film 1' de bir WT (Wild-Type, Canton-S) embriyo gösterilir. Analizimizde kas kasılmaları peristaltik dalgaların ortalama sıklığı saat başına 47 kasılmalar oldu ve ortalama amplitüd WT embriyoları için temel olarak% 60 üzerinde oldu. Embriyo haddeleme film 2 bir WT embriyo için gösterilir, beyaz ok bir trakea ilk pozisyonu ve bir dorsal uzantının konumunu tasvir siyah bir ok işaretleme ile. Dorsal eklentisi (dış) trachea...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo at JoVE.com

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Burada, non-invaziv ve detay odaklı bir şekilde Drosophila embriyolarında embriyonik kas kasılmaları kaydetmek için bir yöntem sunuyoruz.

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Bu yöntem, Drosophila embriyomeydana kas kasılmaları ve haddeleme gibi gelişimsel süreçlerin nasıl analiz edilebildiğini ele almaktadır. Bu tekniğin bazı avantajları noninvaziv ve oldukça ayrıntılı olması, henüz nispeten gerçekleştirmek için basittir. Yöntemimiz, embriyonik kas kasılmaları ve diğer gelişimsüreçlerini etkileyen yeni mutasyonları izole etmek ve analiz etmek için yüksek içerikli analiz tabanlı tarama için daha da geliştirilebilir.Kas kasılmaları görselleştirme, kasılmalar sadece belirli bir gelişimaşamasında başlar, çünkü düzgün zaman embriyo koleksiyonları için önemlidir. Adım adım görsel gösteri, gelişim süreçlerinin nicel analizine büyük ölçüde yardımcı olabilir. Monte Drosophila embriyolarının canlı görüntülemesi için, embriyoları timelapse fonksiyonu ve uygun emisyon filtrelerine sahip bir dijital kamera ile epifloresans mikroskobunun sahnesine yerleştirin ve 10X su daldırma objektif lens seçin.Daha sonra canlı video saniyede dört kare bir satın alma oranı ile yaklaşık bir ila iki saat için uygun mikroskop kayıt yazılımı kullanarak embriyolar kaydedin. Denemenin sonunda, kaydedilen videoyu doğrudan ImageJ'ye aktarın. Her embriyonun etrafına bir kutu çizmek için görüntü ve kırpma seçin ve video kayıtlarını her embriyonun boyutuna göre kırpın.Kırpılan görüntüleri döndürmek ve ekrana göre embriyo orta hattının dikey konumunu elde etmek için Görüntü, Dönüştür ve Döndür'ü tıklatın. Mesafe ölçümlerini mikrometrelere ayarlamak için, Çözümle ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatın ve ardından mikroskop kurulumunuz için bilinen pikselden mikron oranına dönüşüm faktörü girin. Daha sonra yapılan tüm ölçümler mikrometreler halinde raporlanacaktır.Embriyo yuvarlanmasını analiz etmek için, ilk olarak bir embriyonun bir veya her iki trakeasının konumunu arka ve ön uçlar arasındaki videonun ilk karesinde işaretleyin ve Analyze, Tools and Region of Interest Manager'ı tıklatın. Trakeanın etrafına yaklaşık yedi mikrometrelik bir kutu çizin ve bu konumu XY koordinatı olarak kaydetmek için klavyedeki T tuşuna tıklayın. İlgiperistaltik daralmalardan sonra trakeanın aynı alanının konumunu işaretleyin ve daralma öncesi konumdan daralma sonrası pozisyona olan mesafeyi ölçmek için klavyedeki M tuşuna basan her kutunun merkezlerini birbirine bağlayan bir çizgi çizin.Floresan kas belirteçleri ifade embriyolar kullanarak embriyonik kas kasılmaları analiz etmek için, ilgi belirli bir vücut segmentinin floresan kasları etrafında merkezli bir ilgi bölgesi çizmek için floresan okuma kaydını kullanın. İlgi alanı yöneticisinin konumunu kaydetmek için İlgi Alanı Yöneticisi'nde T Ekle sekmesini seçin. Videonun her karesi için seçilen ilgi alanının her bölgesinin ortalama floresan yoğunluğunu kaydetmek için İlgi Alanı Yöneticisi ve Ölçü'yi tıklatın.Kutuyu ilgi çekici diğer gövde segmentlerinin merkezlerine taşıyın ve analiz edilecek tüm gövde segmentlerinde aynı boyutta ilgi alanları elde etmek için konumlarını kaydetmek için T Ekle'yi tıklatın. İlgi Alanı Yöneticisi'nde, XY koordinatları olarak kaydedilen tüm ilgi alanları seçerken Denetim anahtarını tutun. Videonun tüm kareleri için ilgi çekici her bölgenin ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın.Bu, her ölçümü tablonun sütunu ve her karenin satır olarak ilgi alanı olan bir tabloda raporedecektir. Daha sonra daha fazla analiz için tabloyu elektronik tablo programına aktarın. X ekseninde kare numarası ve y eksenindeki ortalama floresan yoğunluğu içeren bir grafik çizin ve kare numarasını saniye kare hızı başına dört kare yi kullanarak zamana dönüştürün.Kas kasılmaları gfp yoğunluğunu artırır, çünkü bu kasılmalar sırasında daha fazla kas çekildikçe odak bölgesinin çevresine daha fazla GFP getirir. Kas kasılması genliğini belirlemek için, zirveler arasındaki bölgelerin ortalama yoğunluğu olarak temel GFP yoğunluğunu tahmin edin. Daha sonra bu taban çizgisine göre GFP floresan yoğunluğundaki artışı değerlendirin.Ardından, GFP yoğunluğunu taban çizgisine normalleştirmek için ilgi yoğunluğu değerinin her bölgesini taban çizgisine bölün. Dalga yayılırgibi kas kasılma ölçüde değişiklikleri incelemek ve dalga yönünü belirlemek için kas kasılma dalgası sırasında posterior, medial ve ön segmentlerde normalleştirilmiş GFP yoğunlukları karşılaştırın. Embriyonun sol ve sağ tarafındaki kas kasılmaları karşılaştırmak için, embriyonun her iki tarafında ki aynı segmentler için tepe yoğunluklarını analiz edin.Eğer varsa, farklılıkları ve peristaltik kas kasılması dalgalarının kapsamını ve zamanlamasını ortaya çıkarmak için kasılma genliğini ve zirvelerin zamanlamasını kullanın. Burada yabani tip Drosophila embriyosunda normal peristaltik kas kasılmaları gösterilmiştir. Yabani tip bir embriyo haddeleme bu videoda, dorsal uzantının hareket etmediğini, trakea ise embriyonun kabuğunun içinde yuvarlandığını gösterir.Bu temsili analizde, kas kasılması 165-178 saniyelik zaman diliminde zirveler tek bir ileri dalga temsil eder. Bu embriyo için embriyonun sağ ve sol taraflarında kas kasılmaları ve genlik lerinde bir fark yoktur. Peristaltik daralma, profili ilk olarak orta ve ön bölgelerdeki zirveler takip eden arka bölgede ortaya çıkan bir tepeye sahipse, ileri tip bir dalga olarak belirlenir.Geriye doğru tip bir dalga, önce ön segmentlerde ortaya çıkan ve daha sonra arka bölgelere doğru yayılan bir tepedir. Tip iki dalgalar embriyonun bir ucundan başlar ve karşı uçta yeniden başlatılan süpürme dalgası olarak kökenlerine dönmeden önce orta bölgelere doğru ilerler. Vücut duruşu mutant embriyolar tip bir tip bir anormal göreceli frekans göstermek iki dalga nesil vücut burulma veya rotasyon fenotip olarak belirlenen bir vücut duruş anormalliği ile sonuçlanır.Kas kasılması parametreleri için bir okuma olarak floresan kullanmak için, kas dokusunda bir muhabir ile embriyolar kullanmak esastır. Bu yöntem birçok embriyokas kasılmaları eşzamanlı kayıt ve çeşitli uyaranlara tepkilerin değerlendirilmesi için kullanılabilir, ilaçlar veya çevresel değişiklikler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...