Name: evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats
Uploaded: 2019-06-28T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à Fundação Helmsley por fornecer equipamentos de ultra-som para realizar nossos experimentos. Este trabalho foi apoiado por NIA R01 053585 subvenção.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Louisville (IACUC-protocolo aprovado 18223) e o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório11.
1. os animais
<ol><li>Use 4-month-old fêmeas Fisher 344 ratos (BW ~ 150-180 g) para o estudo.</li>
</ol>2. imagem latente do ultra-som antes da cirurgia do IR
<ol><li>Anestesie o rato com...

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nature medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>French, C. J., Zaman, A. K., Sobel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+erythropoietin+to+render+jeopardized+ischemic+myocardium+amenable+to+incremental+salvage+by+early+reperfusion.">Failure of erythropoietin to render jeopardized ischemic myocardium amenable to incremental salvage by early reperfusion.</a> Coronary Artery Disease. 20 (4), 295-299 (2009).</li><li>Marzilli, M., Mariani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+and+microvascular+dysfunction:+implications+for+salvage+of+jeopardized+myocardium+and+reduction+of+infarct+size.">Ischemia-reperfusion and microvascular dysfunction: implications for salvage of jeopardized myocardium and reduction of infarct size.</a> Italian Heart Journal. 2 Suppl 3, (2001).</li><li>Prasad, A., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+microvascular+dysfunction+and+reperfusion+injury.">Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury.</a> Heart (British Cardiac Society). 91 (12), 1530-1532 (2005).</li><li>Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coronary+flow+reserve+immediately+after+coronary+angioplasty+in+patients+with+acute+myocardial+infarction.">Impaired coronary flow reserve immediately after coronary angioplasty in patients with acute myocardial infarction.</a> British heart journal. 69 (4), 288-292 (1993).</li><li>Camici, P. G., d&#39;Amati, G., Rimoldi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+microvascular+dysfunction:+mechanisms+and+functional+assessment.">Coronary microvascular dysfunction: mechanisms and functional assessment.</a> Nature Reviews Cardiology. 12 (1), 48-62 (2015).</li><li>Chung, K. S., Nguyen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measures+of+coronary+microcirculation:+Taking+the+long+road+to+the+clinic.">Non-invasive measures of coronary microcirculation: Taking the long road to the clinic.</a> Journal of Nuclear Cardiology. , (2017).</li><li>Kelm, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+cells+improve+left+ventricular+diastolic+function+and+increase+microvascular+perfusion+in+advanced+age.">Adipose-derived cells improve left ventricular diastolic function and increase microvascular perfusion in advanced age.</a> PLoS One. 13 (8), e0202934 (2018).</li><li>Pan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+recovery+of+coronary+flow+reserve+in+patients+successfully+treated+with+a+percutaneous+procedure.">Late recovery of coronary flow reserve in patients successfully treated with a percutaneous procedure.</a> Revista Espa&#241;ola de Cardiolog&#237;a. 56 (5), 459-464 (2003).</li><li>Samim, A., Nugent, L., Mehta, P. K., Shufelt, C., Bairey Merz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+angina+and+microvascular+coronary+dysfunction.">Treatment of angina and microvascular coronary dysfunction.</a> Current treatment options in cardiovascular medicine. 12 (4), 355-364 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Ciuffreda, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+experimental+model+of+myocardial+ischemia/reperfusion+injury:+an+ethical+approach+to+set+up+the+analgesic+management+of+acute+post-surgical+pain.">Rat experimental model of myocardial ischemia/reperfusion injury: an ethical approach to set up the analgesic management of acute post-surgical pain.</a> PloS one. 9 (4), (2014).</li><li>van de Hoef, T. P., Siebes, M., Spaan, J. A. E., Piek, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+in+clinical+coronary+physiology:+why+coronary+flow+is+more+important+than+coronary+pressure.">Fundamentals in clinical coronary physiology: why coronary flow is more important than coronary pressure.</a> European Heart Journal. 36 (47), 3312-3319 (2015).</li><li>Naya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+coronary+flow+reserve+effectively+excludes+high-risk+coronary+artery+disease+on+angiography.">Preserved coronary flow reserve effectively excludes high-risk coronary artery disease on angiography.</a> Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 55 (2), 248-255 (2014).</li><li>Cortigiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+value+of+Doppler+echocardiographic+coronary+flow+reserve+in+the+left+anterior+descending+artery.">Diagnostic and prognostic value of Doppler echocardiographic coronary flow reserve in the left anterior descending artery.</a> Heart (British Cardiac Society). 97 (21), 1758 (2011).</li><li>Kawata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+coronary+flow+reserve+assessed+by+transthoracic+Doppler+echocardiography+on+long-term+outcome+in+asymptomatic+patients+with+type+2+diabetes+without+overt+coronary+artery+disease.">Prognostic value of coronary flow reserve assessed by transthoracic Doppler echocardiography on long-term outcome in asymptomatic patients with type 2 diabetes without overt coronary artery disease.</a> Cardiovascular diabetology. 12, 121-121 (2013).</li></ol>

Os principais achados do presente estudo são que o IR aumenta a velocidade da artéria coronária em repouso e prejudica a CFR, mesmo na ausência de qualquer estenose angiográfica residual.
Compreender a fisiologia coronária é uma parte essencial da tomada de decisão clínica para que os cardiologistas tratem a doença arterial coronariana. O CFR é um dos importantes parâmetros funcionais na compreensão da fisiopatologia da microcirculação coronariana7</...

A reperfusão de isquemia miocárdica (IR) é uma condição em que o suprimento sanguíneo é restrito ao coração, seguido da restauração da perfusão e da reavaliação simultânea1. A oclusão das artérias coronárias pode ser causada por uma ruptura da placa do êmbolo ou do colesterol, que resulte em um desequilíbrio severo da fonte e da demanda metabólicas, causando a hipóxia do tecido. O salvamento do miocárdio comprometido, melhora a função ventricular esquerda, e aumenta a sobrevivência nos pacientes com infarction miocárdico agudo foram observados pela terapia do reperfusão. Entretanto, após a recanalização da artéria coronária, anormalidades funcionais de pequenos vasos coronarianos podem ocorrer2,3,4,5. Uma proporção significativa de pacientes, talvez até 40%, não recupera a perfusão microvascular e miocárdica, apesar da restauração do fluxo coronariano. A visualização e a avaliação da microvasculatura coronária podem ser difíceis in vivo, mas há um número de técnicas invasoras e não invasoras que podem ser usadas para avaliar diretamente parâmetros dependendo da função microvascular coronária6 ,7. Além disso, a função endotelial pode ser avaliada ao nível da circulação coronária através do CFR5.
A Ecocardiografia transtorácica Doppler é uma ferramenta não invasiva que nos permite estudar a velocidade de fluxo da artéria coronária e CFR5. O CFR representa a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso8. Durante o desafio de stress, um coração normal aumenta o fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima do valor de repouso. O risco cardiovascular aumenta quando o CFR é diminuído9. Ishihara et al mostraram que o CFR foi severamente prejudicado imediatamente após a angioplastia coronariana5. Na ausência de estenose da artéria coronária, o CFR diminui durante a disfunção microvascular coronariana e está presente em cerca de metade dos pacientes com doença arterial coronariana estável10.
O objetivo geral deste método é a visualização não invasiva da função da artéria coronária descendente anterior (LAD) em ratos via ecocardiografia, que pode ser utilizada para o cálculo do QCR. Isto oferece uma ferramenta importante da avaliação para diagnosticar a deficiência orgânica microvascular e avaliar tratamentos terapêuticos potenciais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250S 13&#8211;24 MHz linear probe</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dobutamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0676-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RRC</td>
			<td>27376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set, 27G x 1/2&#34;,</td>
			<td>Medline.com</td>
			<td>TMOSV27ELZ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats

A doença arterial coronariana é a principal causa de morte em todo o mundo. Após infarto agudo do miocárdio, a intervenção miocárdica precoce e bem-sucedida via recanalização da artéria coronária é a estratégia mais efetiva para a redução do tamanho do miocárdio isquêmico. A microvasculatura coronária não pode ser visualizada e imaged in vivo, mas existem várias técnicas invasivas e não invasivas que podem ser utilizadas para avaliar parâmetros que dependem diretamente da função microvascular coronariana. A função endotelial após a reperfusão de isquemia pode ser avaliada também ao nível da circulação coronária através da reserva de fluxo coronariano (CFR). Neste estudo, a velocidade de pico das artérias coronárias de descida anterior esquerda (LAD) foi mensurada em ratos in vivo via ecocardiografia transtorácica Doppler durante o desafio de repouso e estresse (induzido pela Dobutamina). Um coração normal pode aumentar o seu fluxo sanguíneo coronariano até quatro vezes acima dos valores de repouso durante a indução do stress. Após a reperfusão da isquemia, nós encontramos um CFR significativamente diminuído, que possa ser usado como um marcador da deficiência orgânica microvascular coronária. O CFR abriu uma janela sobre a importância da disfunção microvascular e demonstrou prever o risco cardiovascular independentemente de a doença obstrutiva grave estar presente.

Para este estudo, foram utilizados 12 ratos fêmeas Fisher 344. Nós executamos um teste de esforço com dobutamine e medimos a velocidade da artéria coronária de LAD antes e 72 horas após a cirurgia do IR. Antes da cirurgia do IR, a velocidade de repouso da artéria coronária de LAD foi medida como 423 ± 59 milímetros/s, que foi aumentada após a infusão do dobutamine (1005 ± 77mm/s) (Figura 3a). Após 72 h de reperfusão de isquemia, a velocidade da...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats at JoVE.com

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

A reserva de fluxo coronariano (CFR) é definida como a razão do fluxo sanguíneo coronariano máximo para o fluxo sanguíneo coronariano em repouso. Apresentamos um protocolo de avaliação do CFR em ratos via ultrassonografia, que oferece a oportunidade de prever fatores de risco cardiovasculares na ausência de doença coronariana obstrutiva.

Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

O objetivo geral deste método é a visualização da função da artéria coronária descendente anterior esquerda em ratos usando ecocardiografia para calcular a reserva de fluxo coronário. Este método oferece uma importante ferramenta de avaliação para o diagnóstico de disfunção microvascular em corações doentes e para avaliação de tratamentos potenciais ao longo do estudo. Embora a terapia de reperfusão tenha sido demonstrada para salvar o miocárdio comprometido e melhorar a função ventricular esquerda, anormalidades funcionais de pequenos vasos coronários podem ocorrer após a recanalização da artéria coronária.Este método pode fornecer informações sobre a microcirculação coronária de ratos, bem como em outros modelos, incluindo infarto do miocárdio, e sobrecarga de volume de pressão do ventrículo esquerdo. Antes da cirurgia de reperfusão pré-isquemia, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato Fischer 344 anestesiado. Raspe o cabelo do peito.Aplique pomada aos olhos do animal e coloque o animal na posição supina em uma plataforma de aquecimento incorporada de 37 a 38 graus Celsius. Conecte a sonda linear de 13 a 24 mega-hertz à máquina de ultrassom. Defina a pré-configuração do aplicativo para a configuração de imagem cardíaca e use o sistema ferroviário para posicionar a sonda para obter a visão do eixo curto parasternal.Use o micromanípulador do eixo XY para mover a sonda na direção rostral para localizar a artéria pulmonar. Mova a sonda, tornando o ventrículo esquerdo mais facilmente visível. Uma vez que a imagem do modo B tenha sido capturada e Cine Armazenada, clique na cor Doppler e visualize a artéria coronária no eixo curto.A cor vermelha, como observado em tempo real, é indicativa da direção do fluxo. Depois de visualizar a artéria coronária descendente anterior inferior no modo Doppler colorido, mude o modo para a onda de pulso e procure a presença de uma linha indicadora amarela na artéria coronária. Coloque a linha de onda de pulso amarela no meio da artéria coronária, tomando cuidado para que o ângulo seja paralelo à direção do fluxo e use a Cine Store para capturar a velocidade do fluxo coronário descendente anterior e a diástola de pico das formas de onda.Depois de obter a velocidade de fluxo descendente anterior, coloque uma pequena faixa de gaze ao redor da base da cauda e use hemostatas para agarrar e torcer o torniquete para aplicar pressão, fazendo com que a veia aumente. Coloque cuidadosamente uma agulha borboleta de infusão de 25 bitolas presa a uma seringa de 10 mililitros carregada com dobutamina na veia da cauda dilatada e estabilize a agulha com cola e um pedaço de fita cirúrgica. Quando a linha de infusão estiver fixada, remova os hemostatos e o torniquete para recuperar o fluxo e coloque a seringa em uma bomba de infusão definida para injetar 20 microgramas por quilograma por minuto.Durante a infusão, monitore cuidadosamente o pico da artéria descendente anterior esquerda e a frequência cardíaca, registrando periodicamente os picos de onda de pulso da artéria descendente anterior esquerdo no modo Doppler sob as condições de estresse induzidas por dobutamina. Após os picos de artéria coronária descendente anterior e a frequência cardíaca terem se estabilizado durante o desafio, pare a infusão, remova o conjunto de infusão da veia da cauda e remova o animal da plataforma. Em seguida, use a ferramenta de velocidade máxima para obter as velocidades diatólicas máximas das imagens e calcular o índice de reserva de fluxo coronariano como a razão da velocidade de fluxo diastólico de tensão da artéria descendente anterior anterior para a velocidade de fluxo diastólico de ressarcimento anterior da artéria descendente anterior.Utilizando uma fonte de luz de fibra óptica, entubar o rato com um cateter IV de calibre 18 e conectar-se ao cateter a um ventilador. Em seguida, use um 8-0 sutura monofilamento para ligar a artéria descendente anterior esquerda através de uma abertura de 15 milímetros no quinto espaço intercostal com um nó simples por 30 minutos. No final do período isquemia, confirme visualmente a isquemia através da descoloração da superfície do coração e libere a ligadura.A reperfusão pode ser verificada pelo vermelhidão da área anteriormente descolorida do músculo cardíaco. 72 horas após a cirurgia, meça o fluxo coronário e a reserva de fluxo coronário como demonstrado, e compare as medidas às obtidas antes da lesão. Neste experimento representativo, antes da cirurgia de reperfusão da isquemia, a velocidade da artéria coronária descendente anterior foi medida como aproximadamente 423 milímetros por segundo para mais do que o dobro da velocidade após a infusão de dobutamina.72 horas após a reperfusão da isquemia, a velocidade da artéria coronária descendente anterior foi significativamente maior em comparação com a velocidade da artéria coronária descendente anterior antes da cirurgia. A resposta ao estresse a um teste de dobutamina após a lesão foi significativamente reduzida em comparação com a resposta antes das respostas da cirurgia. A reserva de fluxo coronariano é calculada como a razão da velocidade de fluxo de pico durante o estresse para a velocidade de fluxo de repouso e foi aproximadamente 2,1 em ratos jovens antes da cirurgia, mas significativamente reduzida 72 horas após a lesão.Além disso, não houve alterações significativas na função sistólica do ventrículo esquerdo 72 horas após a lesão. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitirá que os pesquisadores explorem e usem imagens de ultrassom de artérias coronárias em pequenos modelos animais que imitam com precisão as condições da doença humana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão muito boa de como medir o fluxo sanguíneo coronário e avaliar a microcirculação coronariana em um modelo de doença cardíaca animal de pequeno porte.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute Myocardial Infarction in Rats

Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Medicina

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography

A confirmação da Isquemia Miocárdica e reperfusão em ratos usando Pad Superfície Eletrocardiografia

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality ...

Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty

Células progenitoras coronárias e biomarcadores solúveis no prognóstico cardiovascular após angioplastia coronária

Major adverse cardiovascular events (MACEs) negatively impact the cardiovascular prognosis of patients undergoing coronary angioplasty due to coronary ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in G&#246;ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Post-Myocardial Infarction Heart Failure in Closed-chest Coronary Occlusion/Reperfusion Model in GÃƒÆ’Ã‚Â¶ttingen Minipigs and Landrace Pigs

Insuficiência cardíaca pós-miocárdio em oclusão coronariana de peito fechado/modelo de reperfusão em Miniporcos de Göttingen e Poros landrace

The development of heart failure is the most powerful predictor of long-term mortality in patients surviving acute myocardial infarction (MI). There is an ...

Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion

Preparação de coração e tecido cerebral para fotografia digital de macro após isquemia-reperfusão

Macro photography is applicable for imaging various tissue samples at high magnification to perform qualitative and quantitative analyses. Tissue ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...