Name: ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization at JoVE.com

המחברים מודים ד ר צאפי דניאלי (מרכז וולפסון עבור להחיל ביולוגיה מבנית, האוניברסיטה העברית) על לה עצות ושיתופי פעולה. המחברים מודים גם דניאל ביוטק בע מ (רחובות) על סיוע והקמת מערכת FPLC-MALS אנליטית מנוצל במחקר זה.

1. הכנת המערכת
<ol><li>להתקין את חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) ומערכת גלאי אינדקס (RI) MALS/השבירה (ראה טבלה של חומרים) יחד עם חבילות תוכנה בהתאמה שלהם בקרה, חדרי קירור והקפאה של ניתוח לכל היצרנים הוראות.</li>
	<li>לחבר את MALS ואת RI גלאי במורד הזרם של גלאי UV ו מוליכות של FPLC. לעקוף את גלאי ה-pH אלא אם הדבר הכרחי עבור מעברי צבע pH, כדי למזער את אמצעי האחסון interdetector בין הגלאים UV ו MALS. השתמש צינורות קפילר של 0.25-0.5 הקוטר הפנימי מ"מ (זהות) בין עמודת, גלאי, 0.75 מ מ זהות צינורות קפילר על הפלט של הגלאי RI האספן פסולת או לשבר.</li>
	<li>ודא כי החיבורים הדרושים אות בין FPLC לבין גלאי הוקמו, כולל פלט אנלוגי של UV של הגלאי FPLC לקלט MALS Aux ו פלט דיגיטלי מ FPLC MALS Autoinject ב, דרך תיבת קלט/פלט.</li>
</ol>2. הכנת המדגם, מאגר
<ol><li>לסנן כל ריאגנטים, כולל המאגרים כביסה ו • תנאי, עם מסנן 0.1 מיקרומטר. לסנן את הראשון 50 – 100 מ של מאגר לתוך בקבוק פסולת כדי לחסל את החלקיקים של המסננים יבש, ולשמור את השארית של המאגר בתוך בקבוק נקי, סטרילי, יש כבר שטפו ביסודיות עם מים מסוננים, הכתיר כדי למנוע אבק מלהיכנס.</li>
	<li>התאם מדגם BSA pH ו כוח יונית (למשל, pH = 8, 50 מ מ NaCl) המאפשרות קשירה העמודה IEX במהלך הדילול, אולטראפילטרציה או מאגר exchange הליכים. הערה: מומלץ לסנן מראש את הדגימה חלבון לגודל נקבובית הקטן ביותר אינו מסיר את החומר של ריבית (0.02 – 0.1 µm). לחלופין, הדגימה יכול להיות centrifuged במהירות גבוהה (13,000 – 16,000 x g) למשך 10 דקות לאפשר את המשקעים של חלקיקים גדולים.</li>
	<li>להכין לפחות 0.3-0.5 מ ג של BSA (ראה טבלה של חומרים) כדי להזריק בעמודה 1 מ"ל (5/50 מ מ) להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. שימו לב כי הנפח של הזרקת ללא הגבלה.</li>
</ol>3. בחירה ופיתוח של שיטה IEX עבור חלבון
<ol><li>לחשב את איזואלקטרית (pI) של החלבון בהתבסס על הרצף העיקרי, עבור השרתים שאליהם כגון כלי Protparam על ExPASy האתר יכול להיות בשימוש15. שימו לב כי החוקר של BSA 5.8.</li>
	<li>בחר עמודה מאגר וסוג הפרמטרים.<ol>
<li>השתמש מאגרים שונים עבור AIEX ו- CIEX, בהתאם pK המאגר ואת הטבע יוניים של המאגר. שימוש מאגרי cationic בעת הפעלת AIEX עמודה על מאגרי anionic בעת הפעלת העמודה CIEX עם counterions קטן. בדוגמה זו, השתמש 20 מ מ טריס-HCl מאגר, pH 8, לניתוח של BSA על עמודת AIEX.</li>
		<li>חלבון עם חזה ענק נמוך יותר מאשר 7, כגון BSA, לשימוש של עמודה AIEX, מאגר עם pH גבוה יותר מאשר החוקר על ידי לפחות שתי יחידות. על חלבון עם חזה ענק גבוה מ- 7, להשתמש CIEX עמודה בעלת מאגר עם pH נמוך יותר החוקר חלבון לפחות שתי יחידות.</li>
		<li>למטב את מאגר ה-pH לפי עוצמת איגוד בין החלבון המטריקס עמודה. אם חלבון שאינו בקשירה. ובכן אל העמודה להשתמש pH רחוק יותר החוקר. ודא כי החלבון הוא יציב על ה-pH בשימוש.</li>
		<li>השתמש ריכוז מלח נמוך באיגוד, לשטוף את המאגרים כדי לאפשר קשירה של החלבון למטריקס, מאז חלבון מחייב תלוי כוח יונית המדגם טעון. חלבונים דורשות בדרך כלל קצת מלח ליציבות שלהם; לכן, השתמש NaCl 50 מ מ (או מלח חלופי) במהלך השלבים חלבון-וטעינה של שטיפת העמודה.</li>
		<li>• תנאי מאגר, לשימוש לכל היותר 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה. הערה: ריכוז המלח גבוה לא מומלצים בעת עבודה עם משאבות-מעבדות RI תקן-דגם עקב המגבלה טווח של המכשיר. עם זאת, מודל ריכוז גבוהה יכול לשמש, יוכל להכיל 2 M NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע שיטה ראשונית כדלקמן.<ol>
<li>לטעון 1 מ ג של BSA (170 µL של 6 מ"ג/מ"ל) ב- ~0.5 מ של מאגר טעינת מאגר 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכיל 50 מ"מ NaCl. רוחצים את העמודה עם המאגר באותו אמצעי אחסון עמודה 10 – 15 (CV) לאפשר את השלם • תנאי של מולקולות לא מאוגד, חלקיקים מן המערכת עד פיזור אור (האם), UV, את אותות RI מלא התייצבו.</li>
		<li>לבצע מעבר הדרגתי מלח קצר, ליניארי של 20 – 30 CV, באמצעות מאגר • תנאי של 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכילה 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה. לבצע מעבר הדרגתי של 0%-100% (או צבע נפוצה חלופי) המאגר • תנאי או לפצל את זה ל שני מעברי צבע: 0% – 50% • תנאי מאגר ואחריו צבע נוסף של 50%-100% • תנאי מאגר, מעבר הצבע עבור CV 10 – 20. עבור BSA, השתמש הדרגתי נרחבת של 15% – 70% עבור 30 קורות חיים עבור פעולת השירות הראשוני. הערה: במקרים מסוימים, השיטה הראשוני עשוי מספקים הפרדה ניתוח MALS אמין, מסלולים נוספים אינם הכרחיים. במקרים רבים, השיטה הראשונית מספקת רק הנחיות נוספות שיטת אופטימיזציה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לייעל את השיטה IEX להגדיל את הרזולוציה ולשפר את ההפרדה שיא על-ידי שינוי פרמטרים שונים.<ol>
<li>לשנות את שיפוע הדרגתי ואת אורך. קצר מעברי צבע עם מדרונות גבוהה מספקים פסגות אינטנסיבי עם הפרדה פחות, בזמן ארוך מעברי צבע עם מדרונות מתונים לספק פסגות נמוך עם הפרדה טובה יותר. למצוא את האיזון בין עוצמת האות של רזולוציה שיא לניתוח MALS אופטימלית. הערה: טעינת כמות גבוהה יותר של חלבון יכול להגדיל LS, UV, ו רי אותות אבל עושה זאת על חשבון רזולוציה.</li>
		<li>השתמש פרופיל stepwise ריכוז המלחים • תנאי. זכור כי שילוב של צעדים, צבע ליניארי משמש בדרך כלל.</li>
		<li>להקטין את קצב הזרימה כדי לשפר את השיא ההפרדה. הערה: עבור מטריצות עם חלקיקים קטנים מאוד, זה לא מאוד משמעותי.</li>
		<li>לשנות את ה-pH המאגר כדי להגדיל את הווריאציה תשלום בין האוכלוסיות חלבון במדגם ולשפר את ההפרדה בין משתנים אלה. שימו לב כי ניתן להפריד חלבונים שאינם מופרדים כראוי ב- pH אחד ב- pH שונים.</li>
		<li>השתמש pH הדרגתיות, ליניארי או stepwise, כדי לנתק חלבונים מן העמודה IEX. • תנאי שימוש הדרגתיים המשלבות pH והן וריאציות ריכוז מלח במידת הצורך.</li>
		<li>השתמש מלחים חזקים יותר, כגון MgCl2או מלחי חלש יותר, כמו סודיום אצטט, כדי להגדיל את הרגישות ואת הרזולוציה16.</li>
		<li>להשתמש יותר IEX עמודות או טורים שונה מטריצה עם חלקיקים קטנים יותר כדי לשפר את היכולות ההפרדה.</li>
		<li>לשנות את סוג עמודה (AIEX/CIEX) כדי לספק דפוס שונה של הפרדה. שים לב מטריצות עם חזק, חלש או משולב ליגנדים (מצב מעורב) זמינים גם, יכול לשפר את הרזולוציה של דגימות.</li>
		<li>להשתמש בעמודת מן הספק שונים עם ליגנד באותו שאליו מחובר שרפים מטריקס שונים. שרף עצמו, ללא תלות ליגנד, ניתן לקיים אינטראקציה באופן שונה עם החלבונים, להשפיע על הפרופיל ההפרדה.</li>
		<li>כוללים תוספות (מולקולות לייצב את החלבון של הפתרון) במאגרי כדי לשפר את יציבות החלבון ולהימנע מצבור חלבון, כדי לשפר את הניסוי IEX. הערה: דוגמאות של תוספים כאלה הם סוכרים, כהלים, שתנן, חומרי ניקוי nonionic או zwitterionic, chaotropic ו- kosmotropic מלחי17,18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניסוי IEX-MALS
<ol><li>פתח New\Experiment של שיטת בתוכנה MALS ובחר את השיטה המקוונת מתיקיית שיטות מערכת פיזור אור . אם המודול DLS זמין והם DLS נתונים כדי לרכוש, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה אור Scattering\With QELS .</li>
	<li>להגדיר את הפרמטרים של ההפעלה תחת מקטע התצורה .<ol>
<li>להגדיר את קצב הזרימה המרוץ במקטע משאבה כלליים את קצב הזרימה המשמשים את FPLC (1.5 mL/min), הזן או לאמת את הפרמטרים מאגר תחת המקטע הממס .</li>
		<li>הזן את השם חלבון (BSA), מקדם שבירה קבועה (dn/dc; התקן ערך עבור חלבונים הוא 0.185 mL/g), UV מקדם הכחדה-אורך הגל של 280 ננומטר (0.66 g/L-1·cm-1), הריכוז של המדגם חלבון (6 מ"ג/מ"ל) ב- הכרטיסיה הדגימה תחת המקטע מזרק . הכנס את אמצעי האחסון מדגם להזרקה (170 µL) כמו גם תחת אותו סעיף.</li>
		<li>בכרטיסיה בייסיק , תחת המקטע הליך , בחר בתיבת הסימון הדק על Autoinject , להגדיר את משך ההפעלה כך איסוף נתונים תימשך לפחות 5 דקות לאחר המילוי ההדרגתי הגיעה שלה הערך הסופי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להגדיר את הפרמטרים ניסוי בתוכנה FPLC.<ol>
<li>ליצור התנסות חדשה בכרטיסיה עורך שיטות . הניסוי הראשוני יהיה הדרגתי ליניארי של מלח או pH (ראה שלב 3.3). שיטת אופטימיזציה, צור הדרגתי יותר ספציפי או תוכנית stepwise לפי התוצאות • תנאי במהלך שיטת הראשונית (ראה צעד 3.4 ו איור 1). לכלול אות הדופק השיטה שיפעילו איסוף נתונים בתוכנת MALS.</li>
		<li>לשטוף את העמודה ואת שסתומים עם המאגרים הרלוונטיים: 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, עם 50 מ"מ NaCl המאגר כביסה (שסתום), המאגר אותו עם 500 מ מ NaCl עבור המאגר • תנאי (B שסתום). ודא כי לשטוף את העמודה האחרונה משתמשת המאגר מחייב, המכילים ריכוז מלח נמוך, כדי לאפשר את הכריכה של החלבון אל המטריקס עמודה. לרחיצה מסיבית של זיהומים חריפה מאוגד, להשתמש 0.5 M NaOH לפני כביסה עם המאגרים הרלוונטיים, ולאחריה שטיפה מאגר ניטרול.</li>
		<li>מקם את הדגימה חלבון בתמונה באמצעות מזרק. אם יותר מ 10 מ"ל של המדגם נטען, להשתמש superloop או את משאבת השסתום של המכשיר FPLC בעת שעקף מסנן המשאבה ואת המיקסר של FPLC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתחיל את הניסוי קודם בתוכנה MALS על-ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן גם את התוכנה FPLC. נתונים ייאספו לאחר קבלת האות הדופק של המכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.</li>
	<li>החל באותם הפרמטרים של במנוסה, ההוראות המתוארות צעדים 4.1-4.4 אם IEX-MALS מתבצע באופן ידני עם מצב זרימה רציפה במקום שיטה עצמאי.</li>
	<li>ברגע השיטה הסופי מאומתים, לרוץ, לבצע בדיוק באותה שיטה באמצעות זריקה ריק (טעינת מאגר במקום המדגם). חשוב כי התזמון בין הדופק autoinject ה גרדיאנט הפעלה ריק הוא זהה לזה של הדגימה להפעיל.</li>
</ol>5. ניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS
<ol><li>ביצוע הניתוח של צעד אחר צעד תחת המקטע הליך התוכנה MALS. התצוגה בייסיק מציגה אוסף נתונים גולמיים של הניסוי.<ol>
<li>השתמש בכרטיסיה ' Despiking ' כדי להחליק את chromatograms אם הם מציגים הרבה רעש. בדרך כלל, השתמש ברמה נורמלית .</li>
		<li>להגדיר את התוכנית הבסיסית עבור כל הסימנים (כל LS, UV ו רי גלאי) תצוגה בסיסית .</li>
		<li>להגדיר את הפסגות לניתוח בתצוגה פסגות . בדוק את הערכים הנכונים של dn/dc, המקדם הכחדה UV עבור החלבון תחת כל שיא. הערה: חלבונים, נהוג להשתמש RI סטנדרטי תוספת הערך 0.185 mL/g, אך עבור מקרומולקולות אחרות, ערכים שונים dn/dc יש להשתמש, על-פי האופי של המולקולה. Dn/dc הממוצע של polynucleotides (DNA/RNA) הוא 0.17 מ"ל/g19, בעוד saccharides, כגון סוכרוז, יש ערך ממוצע dn/dc של g/0.145 mL20 ואת הערכים dn/dc של ליפידים ודטרגנטים נע בין 0.1-0.16 g21.</li>
		<li>לנתח את המסה טוחנת ואת הרדיוס באמצעות הפרמטרים התאמה והפונקציה המתאם מתחת לתצוגות המסה טוחנת & רדיוס של LS ו Rh מ QELS .</li>
	</ol>
</li>
	<li>השינויים אות רי באופן משמעותי במהלך IEX-MALS לפעול עקב העלייה בריכוז המלח. לכן, להחסיר את האות הבסיסית של הזריקה ריק לחישובי המוני הדורשים RI נתונים.<ol>
<li>פתח גם חלבון וגם ניסויים IEX-MALS ריק. לחץ לחיצה ימנית על שם הניסוי חלבון בחר להחיל את השיטה, בחר את תיקיית הבסיס חיסור מתיבת דו-שיח קובץ. בחר בסוג הנכון של השיטה (למשל, באינטרנט) לניתוח המוני טוחנת סטנדרטי. שימו הפרמטרים ואת ההגדרות שהוגדרו עבור הניסוי חלבון יישמרו על שיטת נפתח חדש.</li>
		<li>תחת התצוגה חיסור בסיסית , לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות המרוץ ריק. תחת כלי נגינה (לצד לחצן ייבוא ריק ), לבדוק את כולם גלאי כדי לחסר.</li>
		<li>בתצוגה ' פסגות ', התאם את הערכים dn/dc (במקרה הצורך) בשל מוליכות הפתרון באזור שיא חלבון, מאז המהלכים הנכונים של הפתרון הוא השתנה במהלך ריצה12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכייל את המערכת IEX-MALS עם מונומר BSA. הערה: בדרך כלל, מערכת IEX-MALS מעת לעת מכויל שיא יישור, הלהקה הרחבה של נורמליזציה של גלאי זוויתי. הגלאי 90° באמצעות חלבון monodisperse עם רדיוס של רגע (Rg) של < 10 ננומטר, כמו BSA מונומר. בדוגמה זו, BSA מגישה גם מולקולת כיול, הוא עצמו הנושא של הניתוח המוני טוחנת.<ol>
<li>יישר את הפסגות, תחת נהלים > תצורת תצוגה.</li>
		<li>לבצע נרמול תחת התצוגה נורמליזציה , הזנת 3.0 nm כערךg R.</li>
		<li>תחת הלהקה הרחבת בכרטיסייה תצורה זהה, לבחור הפסגה, להתאים את האותות UV ו LS לאות רי, באמצעות הלחצן בצע להתאים .</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגרף של התוצאות מוצג בתצוגה תוצאות התאמה . לשנות את המאזניים ציר ופרמטרים אחרים של גרף על-ידי לחיצה ימנית על הגרף, בחירת לערוךולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם . דמות גרף עם יותר אפשרויות התצוגה זמינה גם בכרטיסיה EASI גרף : בחר המסה טוחנת מתוך התפריט הנפתח להציג בחלק העליון של החלון.</li>
	<li>שים לב כי כל התוצאות, כולל המסה טוחנת, רדיוס, דרגת טוהר של אחרים, זמינים בתצוגת דוח (סיכום או מפורט) תחת המקטע תוצאות . השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף עוד תוצאות או פרמטרים, כמו גם דמויות, לדוח.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trip+Adviser+guide+to+the+protein+science+world:+a+proposal+to+improve+the+awareness+concerning+the+quality+of+recombinant+proteins.">The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins.</a> BMC Research Notes. 7, 585 (2014).</li><li>Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+and+optimization+of+purified+protein+samples:+why+and+how.">Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how.</a> Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).</li><li>Oliveira, C., Domingues, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+to+reach+high-quality+purified+recombinant+proteins.">Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).</li><li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products.">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+light+scattering+measurement+in+the+biological+and+biopharmaceutical+sciences.">Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences.</a> Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).</li><li>Sahin, E., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-angle+Light+Scattering+for+Elucidating+Protein+Aggregation+Mechanisms.">Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).</li><li>Ogawa, T., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+analyses+of+protein+dynamics+in+solution.">Multiple analyses of protein dynamics in solution.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).</li><li>Rebolj, K., Pahovnik, D., &#381;agar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Protein+Conjugate+Using+an+Asymmetrical-Flow+Field-Flow+Fractionation+and+a+Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-Detection+System.">Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System.</a> Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Monoclonal+Antibodies.">Heterogeneity of Monoclonal Antibodies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Hintersteiner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+heterogeneity:+Basic+antibody+charge+variants+with+increased+binding+to+Fc+receptors.">Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors.</a> mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).</li><li>Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+antibodies:+Modification,+methods+and+potential+effects+on+biological+functions.">Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions.</a> mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).</li><li>Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Multi+Angle+Light+Scattering+to+Ion+Exchange+chromatography+(IEX-MALS)+for+protein+characterization.">Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).</li><li>Goyon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+size+exclusion+chromatography+columns+packed+with+sub-3&#956;m+particles+for+the+analysis+of+biopharmaceutical+proteins.">Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3&#956;m particles for the analysis of biopharmaceutical proteins.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).</li><li>Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -. L., Guillarme, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography+for+the+characterization+of+biopharmaceuticals.">Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+the+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+phase+selection+for+the+high-performance+ion-exchange+chromatography+of+proteins.">Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins.</a> Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).</li><li>Lebendiker, M., Danieli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+prone-to-aggregate+proteins.">Production of prone-to-aggregate proteins.</a> FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).</li><li>Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening+methodology+for+purifying+proteins+with+aggregation+problems.">A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems.</a> Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+refractometry+using+field-based+light+scattering+spectroscopy.">Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy.</a> Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).</li><li>Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+Light+Scattering+Studies+on+Ribosome+Particles.">Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles.</a> Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).</li><li>Berthaud, A., Manzi, J., P&#233;rez, J., Mangenot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Detergent+Organization+around+Aquaporin-0+Using+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).</li><li>Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+analytical+method+for+evaluating+bovine+serum+albumin+concentrations+in+pharmaceutical+polymeric+formulations.">Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).</li><li>Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+arginine+on+multimodal+anion+exchange+chromatography.">Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).</li><li>Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+afifavidin+reveals+common+features+of+molecular+assemblage+in+the+bacterial+dimeric+avidins.">Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins.</a> The FEBS Journal. , (2018).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Particle+Content+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Serotype+8+Vectors+by+Ion-Exchange+Chromatography.">Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).</li><li>Patel, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-angle+light+scattering+as+a+process+analytical+technology+measuring+real-time+molecular+weight+for+downstream+process+control.">Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control.</a> mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).</li></ol>

ד. ש. הוא עובד של תאגיד הטכנולוגיה וויאט, שאת מוצריו מנוצלים של פרוטוקול זה. ש א הוא מועסק ע י דניאל ביוטק, מפיץ של מכשירים וויאט ואת ÄKTA.

IEX-MALS היא שיטת רב עוצמה חלבון הפרדה ואפיון המאפשרת קביעת המוני טוחנת מדויק טהור חלבונים כמו גם החל מדגמים הטרוגנית, אפיון oligomers מקורית, אגרגטים לא מקוריים, קוולנטיות, noncovalent מתחמי ולאחר conjugated חלבונים. תוכנית בהיקף של מעבר צבע ליניארי או סדרה של צעדים ריכוז המלחים ניתן להשיג הפרדה טובה של אוכלוסיות חלבון ולאפשר ניתוח נכון של כל שיא בודדים על-ידי MALS. נוספים מיטוב על ידי שינוי פרמטרים שונים, כגון שיפוע המדרון (ראה שלב 3.4 לפרוטוקול), יכול להתבצע אם נדרשת רזולוציה טובה יותר. IEX-MALS יכול להיות assay בקרת איכות חלבון בעל ערך מאז שהיא מספקת רמה נוספים, קריטי של חלבון אפיון, משלים בשיטות אחרות כגון שניה-MALS.
בעוד שניה-MALS היא טכניקה סטנדרטי, נפוץ לקביעת מסה טוחנת חלבון, ברזולוציה נמוכה יחסית של הטורים התקניים שניה אנליטי עלולה להגביל מדידות מדויקות טוחנת המוני מושגת על ידי MALS12. כמה דוגמאות של המגבלות של שניה-MALS כוללים פתרונות המכילים oligomers רצופים, רמות גבוהות של צבירת שאינם מופרדים לחלוטין מתוך מונומר שיא ולאחר אוכלוסיות הטרוגניות עם ההמונים טוחנת דומים, כגון חלבונים ששונה.
IEX היא שיטת כרומטוגרפיה מורכבים יותר לעצב ולבצע יותר שניה, אבל המידע המתקבל ניסוי IEX-MALS יכול להשלים, לפעמים להיות אינפורמטיבי אפילו יותר מאשר ניתוח שניה-MALS. IEX-MALS בהצלחה אפיינו את גרסאות נוגדן המשתפים oligomers אותה מסה, טוחנת שהרווח לא לגמרי שניה ולאחר פפטידים קצרים קשה לנתח שניה12,24. כמו כן, הרכבות macromolecular גדולים מדי כדי להיות מופרדים על-ידי שניה, מלא (המכיל DNA נגיפי) ו ריק חלקיקי וירוס adeno-הקשורים (AAV), יכולים להיפתר על ידי IEX25 לפני ניתוח MALS. בהשוואה ל- SEC, IEX מציע הפרדה יותר מגוונת יכולות14 ויש לו את הגמישות של התאמת מספר פרמטרים כדי להגדיל את הרזולוציה שיא, כגון מאגר pH, סוגי מלח, סוגי ואת האורך של העמודה, ואחרים. בניגוד שניה, יש ללא מגבלה נפח להזרקה מדגם ב IEX, בכל מולקולה ניתן לנתח באופן עצמאי את גודלו (Amartely et al.12, ראה טבלה 1). זהו יתרון גדול של IEX-MALS, בעיקר עבור דגימות בעוצמה נמוכה LS, כגון חלבונים קטנים מאוד או חלבונים מדולל עם נטייה לצורך צבירת על ריכוז. מאז עמודות IEX אנליטי יציבים יותר, נוטים לשחרר חלקיקים פחות מאשר שניה טורים, IEX-MALS דורש זמן קצר מאוד equilibration, האם אותות התייצבו מהר מאוד. דבר זה מאפשר הפעלה של ניסויים בודדים כפי שמתואר פרוטוקול זה, לעצור את המרוץ כנדרש.
בניגוד שניה, אשר בדרך כלל מספק תוצאות בסדר עם היחידה להתנסות (באמצעות עמודה עם הטווח fractionation נכון), IEX עשויים לדרוש מספר ניסויים כדי להשיג רזולוציה מיטבית על-ידי כיוונון הפרמטרים בשיטה. בניסויים IEX-MALS המבוצעים במילוי הדרגתי מלח, מוליכות מאגר ושנה, לפיכך, המהלכים הנכונים באופן דרמטי במהלך הריצה, עם שינויים הסוגר האות רי. פעולה זו דורשת של ריק נוספים להפעיל עבור ניסוי IEX-MALS וניתוח עם חיסור בסיסית (כפי שמתואר בשלב 5.2 לפרוטוקול), אלא אם כן הניתוח ריכוז מוגבלת לזיהוי UV (הדורשים ידע א-פריורי של הכחדה המקדמים עבור כל שיא). הניתוח עם חיסור בסיסית היא חזקה למעברי צבע קוויים, אף-על-פי בהמשך פיתוח של שיטת נדרש עדיין עבור חיסור בסיסית מוצלחת של תוכניות stepwise מלח. הערכים dn/dc של כל שיא צריך להיות מותאם על פי מוליכות מאגר ספציפי על פסגת eluted (חישובים ניתן למצוא ספרות12). אם חלבון eluted-NaCl ריכוז נמוך מ-200 מ מ (כמו בדוגמה של BSA), התאמה זו הוא זניח.
כמות יחסית גדולה של חלבון בשימוש IEX-MALS (כמו שלב ושלב ב 2.3 לפרוטוקול) בהשוואה ל- SEC-MALS חשוב להתגבר על השינוי הדרמטי של האות רי הנגרמת על ידי מעבר הצבע המלח ותנודות רי עקב ערבוב לא מושלם של מאגרי הדרגתיות. אם רק לזיהוי UV משמש למדידה המוני, עשוי לשמש כמויות קטנות יותר. כמות חלבון כדי להזריק תלוי המסה טוחנת של החלבון, הומוגניות, טוהר, המקדם הכחדה UV. המסה מוזרק הכרחי צריך להיות גבוה יותר עבור חלבונים קטנים יותר נמוך יותר עבור חלבונים גדולים יותר (~ 1 מ"ג עבור 20 kDa חלבונים ו ~0.2 מ"ג ל חלבון 150 kDa). דוגמאות הטרוגנית דורשות הזרקה מדגם יותר מאז הכמות מחולק בין מספר אוכלוסיות. ביצועים גבוהים אנליטי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) עשוי לדרוש פחות חומר מאשר מערכת FPLC.
לאחרונה, דווח בשורה ניתוח באמצעות MALS במהלך הליכי טיהור. ניתוח כזה בזמן אמת יעיל מאוד לזיהוי מוצרים צבירת להתרחש במהלך טיהור יכול לבטל את הצורך עבור כל ניתוח נוסף של החלבון לאחר טיהור26. כרומטוגרפיה IEX משמש לעתים קרובות כשלב ביניים טיהור; לפיכך, השילוב של עמודות IEX מפוח עם MALS יכול להיות שימושי לא רק כמו שיטת אפיון האנליטית אלא גם כמו ניתוח בזמן אמת של תהליכי טיהור בקנה מידה גדול. עמודות IEX nonanalytical גם הם יציבים, עם רמה נמוכה של חלקיקים שחרור, לכן, ניתן להשתמש עם MALS. שיטות ההפרדה אחרים, כגון כרומטוגרפיית זיקה או כרומטוגרפיה הידרופובית, יכול גם להיות משולב עם MALS כאשר נתון דגימות יחסית טהורה (כדי למנוע זיהום של גלאי MALS ואת RI). זה ידרוש ההסתגלות, אופטימיזציה של השיטה כדי להשיג לא רק הפרדה שיא טוב אבל האם גם מספיק נקי ואת RI אותות עבור ניתוח מוצלח MALS.

אפיון כמותי של מוצרי חלבון חיוני יותר ויותר כאמצעי בקרת איכות (QC), שניהם למטרות רגולציה בענף ביולוגיות וכדי להבטיח את אמינות ויושרה של מדעי החיים מחקר1 , 2. כפי שמתואר על האתרים של חלבונים רשתות ייצור החלבון ושותפות טיהור ב אירופה (P4EU), איגוד של משאבים עבור מחקר Biophysical באירופה, ביופיסיקה מולקולרית באירופה (ארברה-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ו- https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, בהתאמה), חלבון QC יש לאפיין לא רק את הטוהר של המוצר הסופי, אבל מצבו oligomeric גם, הומוגניות, זהות. קונפורמציה, מבנה, שינויים posttranslational ואחרים מאפיינים3,4.
אחת השיטות הנפוצות ביותר של אפיון QC היא שניה-MALS. בשיטה זו, טור שניה אנליטי רתומה MALS, גלאי spectrophotometric, refractometric, המאפשרים מדידות מדויקות של המסה טוחנת חלבון של כל שיא5 שניה-MALS קובע את המסה טוחנת פסגות eluted ללא תלות • תנאי האחסון, מתגבר על אי-הדיוק של ה-SEC אנליטי באמצעות כיול עמודה. התוספת של מודול דינאמי (DLS) אור-פיזור מוסיף יכולת המדידה בגודל המאפשר קביעת הרדיוס hydrodynamic. במחקר אקדמי, שניה-MALS משמש בדרך כלל כדי לקבוע את מצב oligomeric של חלבון, קונפורמציה שלה, הרמה של טוהר, ברמה של צבירת, וחלבונים שונה, כגון glycoproteins או solubilized-השומנים קרום חלבונים (לקבוע המסה טוחנת של חלבון ו נזווג את הרכיבים בנפרד)6,7,8.
במקרים רבים, החלבון הסופי של תהליך טיהור אינו זן מולקולרית טוב-deﬁned אך מעדיף כוללת כמה הטרוגניות. החלבונים בתערובת כאלה יכולים להיות מגוונים מבחינת מבנה (לדוגמה, oligomeric בצורות שונות), הייצורים החיים, או חלבון איזופורמים. החלבון הזה יכול להיות גם תוצאה של הבדלים משניים כימי הנגרם על ידי עיבוד ליזין C-מסוף או דיאמינציה אספרגין/גלוטמין, מובילים להאשים וריאציה9,10. הבדלים posttranslational שינויים כגון גליקוזילציה יכול גם להוביל דגימות הטרוגנית עם תשלום וריאציות9. אלה סוגים שונים של הטרוגניות משתקפים מאפיינים ביופיזיקלי של החלבון, יכולים להשפיע על יציבות, פעילות ביולוגית של חלבון המטרה11.
בקרת איכות אמינים מבחני דוגמאות כאלה הטרוגנית דורשים טכניקה מאוד resolutive ההפרדה האנליטית. ישנם מקרים שבהם ניתן לערער הפרדה טובה להשיג עם עמודות שניה אנליטית, עקב שלהם מוגבל רזולוציה והפרדה היכולות12, וכתוצאה מכך ניתוח שניה-MALS פגום. שילוב של טכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים כגון IEX עם MALS ניתן להתגבר על המגבלה של שניה-MALS בדגימות הטרוגנית, מספקות שיטה משלימה איפיון חלבונים (טבלה 1 Amartely et al.12). בניגוד שניה, המפריד בין מקרומולקולות מאת שלהם גודל hydrodynamic13, IEX מפריד מקרומולקולות מאת שלהם תשלום משטח14. Exchange אניון (AIEX) ו- bind מטריצות קטיון (CIEX) באופן שלילי ולא חיובי טעונה גרסאות, בהתאמה. עם הפרדה בסדר בין אוכלוסיות חלבון המשתפים מסה יחסית קרוב או צורה, IEX-MALS בהצלחה קובע את המסה טוחנת של כל מדינה חלבונים בודדים גם עם תערובת מדגם12.
כאן אנו מציגים פרוטוקול תקני לביצוע ניסוי IEX-MALS ההפרדה וניתוח של צורות oligomeric BSA הקיימים במדגם זהה. הבחירה של עמודת IEX על חלבון ספציפי היא חשובה ולא נדונה, כמו גם התנאים pH, מוליכות של מאגרי. הניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS גם מתואר צעד אחר צעד. למרות ההפרדה של BSA oligomers טובה ומספקת ב- SEC-MALS, BSA היא דוגמה טובה כדי להראות את היכולות IEX-MALS וכדי להדגים אופטימיזציה של ניסוי. דוגמאות המסכן ההפרדה מושגת על ידי שניה-MALS, הפרדה נכונה וניתוח מופעל על-ידי IEX-MALS הם דנו גם עם המחקר הקודם12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#196;KTA pure</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:236px;">FPLC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.02 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1002</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1012</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 25 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-2012</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">BSA (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">miniDAWN TREOS&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREOS</td>
			<td>MALS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mono Q HR 5/50 GL</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td>Anion exchange analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optilab T-rEX</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREX</td>
			<td>Refractometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.1 mm PES 1000 mL Stericup</td>
			<td style="width:136px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCVPU11RE</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TRISMA base</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>TRIS buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization

כרומטוגרפיה יונים עם פיזור אור רב זווית (IEX-MALS) היא שיטה חזקה בשביל חלבון הפרדה ואפיון. השילוב של הטכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים IEX בניתוח מדויק טוחנת המוני מושגת על-ידי MALS מאפשרת אפיון דגימות חלבון הטרוגנית, כולל תערובות של טפסים oligomeric או חלבון אוכלוסיות, בכלל עם מאוד ההמונים טוחנת דומה. לכן, IEX-MALS מספק רמה נוספת של חלבון אפיון, משלים כרומטוגרפיה הוצאת בגודל סטנדרטי עם טכניקת פיזור אור רב זווית (שניה-MALS).
כאן נתאר פרוטוקול IEX-MALS הבסיסית הניסוי, להדגים בשיטה זו על שור אלבומין (BSA). IEX מפריד BSA כדי צורותיה oligomeric המאפשר ניתוח המוני טוחנת מאת MALS של כל טופס בודדים. אופטימיזציה של ניסוי IEX-MALS הוא גם הציג, הפגינו על BSA, להשגת הפרדה מצוינת בין מונומרים BSA oligomers גדול יותר. IEX-MALS היא טכניקה חשוב להערכת איכות חלבון מאז שהיא מספקת ההפרדה בסדר והן טוחנת המוני קביעה של מספר מינים חלבון קיים במדגם.

BSA הוא חלבון נפוץ אשר משמש הכרומטוגרפיה כיול של מערכת ניסויית22 ומתאים מאוד לתרגול IEX-MALS, כמו גם שניה-MALS. היא בעיקר monomeric עם מסה מונומר תיאורטי של 66.7 kDa, בדרך כלל משלבת מספר קטן של הדימרים ו oligomers גבוהה23.
BSA נותחו על IEX-MALS באמצעות עמודת אנליטית של exchange אניון (ראה טבלה של חומרים). פונקציה קווית רחב הדרגתי בהיקף של 30 CV מן 75 מ"מ עד 350 מ"מ NaCl הופרדו BSA מונומרים oligomers גבוה יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחנת מונומר מחושב של 66.8 kDa ± 0.7, מסה טוחנת דימר מחושב של 130 ± 5 kDa (איור 1א').
על סמך את מוליכות מאגר על הפסגות eluted, מעבר הצבע שונתה תוכנית אחרת: שלב ארוך של 175 מ מ NaCl ואחריו הדרגתי לינארית מ- 175 מ מ עד 500 מ מ NaCl. מעבר הצבע החדש לשפר באופן משמעותי את הרזולוציה ואת ההפרדה מעולה BSA מונומר (עם מסה טוחנת מחושב של 66.1 ± 0.7 kDa) בין המינים oligomeric העליונים שלה (עם מסה הממוצע המחושב של 132 ± 2 kDa) (איור 1B). להתמקד גם המין oligomeric גבוהה וכדי לחשב טוחנת המוני בכל צורה oligomeric אישית של BSA, הוחלה תוכנית stepwise של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. הניסוי הזה, גרמו הפרדה מצוינת בין BSA מונומר (עם מסה מחושב של 62.4 ± 0.4 kDa) דיימר (עם מסה מחושב של 130 ± 10 kDa), trimer (עם מסה מחושב של 170 ± 10 kDa) (איור 1C). כל הניסויים IEX-MALS מראים כי BSA elutes בעיקר בתור מונומר עם טוהר של 80%, מסכים עם תוצאות שניה-MALS שבו מונומרים BSA elute עם טוהר של 85%12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg"> איור 1 : אופטימיזציה של הניסוי IEX-MALS עבור BSA. (א) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית הדרגתי של 75 – 350 מ"מ NaCl. (B) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית של צעד NaCl 175 מ מ, ואחריו תוכנית מעבר צבע ליניארי של 175 – 500 מ מ NaCl. (ג) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית שלב של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. Chromatograms הצג UV באור 280 nm (כחול), מפזרים על זווית 90 מעלות (אדום), ואת את מקדם שבירה (ורוד). את עקומות מוליכות (אפור) יחד עם המסה טוחנת של כל שיא המחושב על-ידי MALS (שחור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization at JoVE.com

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

פרוטוקול זה מתאר השימוש כרומטוגרפיה גבוהה-ירידה לפרטים-יונים עם פיזור אור רב זווית נחישות המוני טוחנת מדויק של חלבונים, חלבונים מתחמי פפטידים במדגם הטרוגנית. שיטה זו היא ערך להערכת איכות, כמו גם באשר אפיון oligomers מקורית, מטען גרסאות ודוגמאות מעורב-חלבון.

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

פרוטוקול זה מציג MALs חילופי יון, שיטה חדשנית לבקרת איכות חלבון ואפיון, בקרת איכות חיונית עבור עקביות ושלמות של תוצאות במחקר מדעי החיים ופיתוח מוצרים פרמצבטיים. Ion-exchange MALS קובע טוהר חלבון, מצב אוליגומרי, הומוגניות, זהות, קונפורמציה, מבנה, שינויים שלאחר התרגום, ומאפיינים אחרים. המדידות אינן הרסניות והן נעשות בפתרון בתנאי מאגר כמעט פיזיולוגיים.שיטה זו קובעת במדויק מסה טוחנת של חלבונים או פפטידים, המצב האוליגומרי, ואת מידת ההטיה, למשל, גליקופרוטאינים. זה יכול להיות מיושם גם על חלבוני קרום. IEX מפרידה בין מקרומולקולים באמצעות טעינת פני השטח שלהם.חילופי אניון, AIEX וחילופי יון, CIEX, מטריצות נקשרות גרסאות טעונות באופן שלילי וחיובי, בהתאמה. עם הפרדה עדין בין אוכלוסיות חלבון שחולקים מסה או צורה קרובה יחסית, IEX-MALS קובע בהצלחה את המסה הטוסורה של כל מצב חלבון בדגימה של תערובת. כדי להתחיל, השתמש במסנן 0.1 מיקרומטר כדי לסנן את כל הריג'ים, כולל מאגרי הכביסה והאלוטיון.סנן את 50 עד 100 המיליליטרים הראשונים של המאגר לבקבוק פסולת כדי למנוע חלקיקים מהמסנן היבש. בבקבוק נקי וסטרילי שנשטף ביסודיות במים מסוננים וכתר כדי למנוע כניסת אבק, סנן את שאר המאגר. עם חיץ טריס pH-8 ונתרן כלוריד 50 מילימולאר, לדלל מדגם BSA לשישה מיליגרם למיליליטר כך pH וכוח יוני יאפשר מחייב לעמודת חילופי יונים.השתמש במזרק כדי להזריק לפחות 0.3 עד 0.5 מיליגרם של BSA לעמודה של מיליליטר להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. להתחלת ניסוי MALS לחילופי יון, פתחו את New, Experiment from Method בתוכנת MALS ובחרו בשיטה המקוונת מתווית שיטות המערכת של פיזור האור. אם מודול DLS זמין ויש לרכוש נתוני DLS, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה פיזור אור, עם QELS.כדי להגדיר את הפרמטרים, תחת המקטע תצורה, הגדר תחילה את קצב הזרימה של הריצה במקטע משאבה כללית לקצב הזרימה המשמש ב- FPLC כ- 1.5 מיליליטר לדקה. תחת המקטע ממס, הזן או אמת את פרמטרי המאגר. תחת סעיף מזרק, הזן את שם החלבון כמו BSA, מדד שבירה תוספת קבועה כמו 0.185 מיליליטר לגרם, ואת מקדם הכחדת UV באורך הגל של 280 ננומטר כמו 0.66 ליטר לגרם לס"מ.בכרטיסיה דגימה, הזן את הריכוז של דגימת החלבון כמו שישה מיליגרם למיליליטר, ולאחר מכן להכניס את נפח המדגם להזרקה כמו 170 microliters גם כן. תחת המקטע שגרות, בכרטיסיה אוסף בסיסי, בחר בתיבת הסימון גורם מפעיל בהזרקה אוטומטית והגדר את משך הריצה ל- 70 מיליליטר כך שאיסוף הנתונים יימשך לפחות חמש דקות לאחר שהמילוי ההדרגתי יגיע לערך הסופי שלו. לאחר מכן, בתוכנת FPLC, צור ניסוי חדש בכרטיסיה עורך שיטות.לניסוי הראשוני, צור שיפוע ליניארי של מלח או pH, ואילו עבור השיטה האופטימלית ליצור שיפוע ספציפי יותר או תוכנית צעד אחר צעד על פי כתב היד. כלול אות דופק בשיטה שתפעיל איסוף נתונים בתוכנת MALS. לאחר מכן, לפתוח את שסתום המשאבה, ולשטוף עם 0.5-טוחן נתרן הידרוקסיד כדי להסיר זיהומים כבולים בחוזקה, ואחריו לשטוף חיץ נטרול.לאחר מכן, לשטוף את העמודה עם טריס חיץ pH שמונה, שסתום A עם חיץ כביסה, ואת שסתום B עם חיץ אלוטיום. השתמש במאגר הכביסה עם ריכוז המלח הנמוך ככביסה סופית כדי לשטוף את העמודה, כדי לאפשר את כריכת החלבון למטריצת העמודים. לפני הזרקת הדגימה, לאחר הכביסה, ובסוף האלוטיון, יש לייצב את בסיס פיזור האור כדי להבטיח רעש נמוך ודילול טהור לחלוטין.בעזרת מזרק, מניחים את דגימת החלבון בלולאה. התחל את הניסוי תחילה בתוכנת MALS על ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן בתוכנת FPLC. הנתונים ייאספו לאחר קבלת אות הדופק ממכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.אם ה- MALS של חילופי היונים מבוצע באופן ידני עם מצב זרימה רציף במקום עם שיטה עצמאית, החל את אותם פרמטרים של הריצה והוראות כפי שתואר קודם לכן. לאחר אימות והפעלה של השיטה הסופית, בצע בדיוק את אותה שיטה באמצעות הזרקה ריקה על-ידי טעינת מאגר במקום הדגימה. חשוב כי התזמון בין הדופק להזרקה אוטומטית לבין שיפוע הריצה הריקה זהה לזה של הריצה לדוגמה.כדי להתחיל בניתוח, תחת המקטע הליכים בתוכנת MALS, השתמש בכרטיסיה Despiking וברמה Normal כדי להחליק את הכרומטוגרמות. אם הם מציגים הרבה רעש, להגדיר את הרמה כבד. בתצוגה בסיסית, הגדר את קו הבסיס עבור כל האותות, כולל גלאי LS, UV ו- RI.בתצוגה פיקס, הגדר את הפסגות לניתוח. ודא את הערכים הנכונים של מקדם ההכחדה של ערך ההפרש הקבוע של RI dn/dc ו- UV עבור החלבון מתחת לכל שיא. תחת המסה והרדיוס Molar מתצוגת פיזור אור, לנתח את המסה הטהבה ואת הרדיוס באמצעות מודל Zimm ו להתאים מידה של אפס.אם QELS זמין, תחת התצוגה Rh מ- QUELS, התבונן בערכי Rh ובאיכות מתאים לפונקציית המתאם. אות RI משתנה באופן משמעותי במהלך ריצת MALS חילופי יון עקב הגידול בריכוז המלח. כדי להחסיר את אות הבסיס מההזרקה הריקה, פתחו הן את ניסויי החלבון והן את ניסויי ה-MALS הריקים של חילופי היונים.לחצו לחיצה ימנית על שם ניסוי החלבון, בחרו 'החל שיטה' ובחרו בתיקייה 'חיסור בסיסי' מ בתיבת הדו-שיח של הקובץ. בחר את השיטה המקוונת לניתוח מסה מוטחנת סטנדרטית. תחת התצוגה חיסור בסיסי, לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות של הריצה הריקה.תחת מכשירים, לבדוק את כל הגלאים כדי לחסר. כדי לכייל את מערכת ה-MALS של חילופי היונים עם מונומר BSA, תחת תצוגת פרוצדורות ותצורה, יישר את הפסגות. תחת תצוגת נורמליזציה, הזן 3.0 ננומטר כערך Rg כדי לבצע נורמליזציה.לאחר מכן, תחת הרחבת Band באותה כרטיסיית תצורה, בחר את השיא ולהשתמש בלחצן בצע התאמה כדי להתאים את אותות UV ו- LS לאות RI. גרף התוצאות מוצג בתצוגה 'התאמת תוצאות'. שנה את סרגלי הציר ופרמטרי תרשים אחרים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הגרף, בחירה באפשרות עריכה ולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם.כדי לקבל אפשרויות תצוגה נוספות, בחר בכרטיסיה גרף EASI, ובחלק העליון של החלון בתפריט הנפתח תצוגה, בחר תוצאות מסה טוחה או Rh Q.All, כולל מסה טוחנת, רדיוס, רמת טוהר ואחרות זמינות בתצוגה דוח תחת המקטע תוצאות. השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף תוצאות או פרמטרים נוספים, כמו גם איורים, לדוח. בניסוי זה, BSA נותח על MALS חילופי יון באמצעות עמודה אנליטית חילופי אניון.הכרומטוגרמות הציגו את ה-UV ב-280 ננומטר, פיזור אור בזווית של 90 מעלות, מדד השחזור ועקומות המוליכות יחד עם המסה הטוחנת של כל שיא. שיפוע ליניארי רחב המורכב מ-30 כרכים של טורים מ-75 מילימולרים עד נתרן כלוריד 350 מ"ל הפריד בין מונומרים של BSA לבין דימרים ואוליגומרים גבוהים יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחן מונומר מחושב של 66.8 קילודלטונים מסה טוחן עמום מחושב של 130 קילודלטון.בהתבסס על מוליכות החיץ בפסגות האלוטות, שיפוע שונה לתוכנית אחרת, צעד ארוך של נתרן כלוריד 175 מילימולר, ואחריו שיפוע ליניארי מ 175-מילימולר ל 500 מילימטר נתרן כלורי. ההדרגה החדשה שיפרה מאוד את הרזולוציה והפיקה הפרדה מצוינת בין מונומר BSA לבין מינים אוליגומריים גבוהים יותר. תוכנית צעד חכם של 200 מילימולר ו 250 מילימולר נתרן כלורי הוחל להתמקד גם על מינים אוליגומריים גבוהים.זה הביא להפרדה מצוינת בין מונומר BSA, עמום, ו trimer. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון ספקטרומטריית מסה, פעילות SDS-PAGE ובדיקות יציבות בכל משתנה המופרד על ידי חילופי יון כדי לזהות ולאפיין עוד יותר כל אחד מהם. מצאנו כי MALS חילופי יון מרחיב את כוחו של ניתוח MALS לדגימות שלא ניתן לנתח באופן מלא על ידי SEC-MALS.הפרדה לפי תשלום פותרת מינים שונים המשתקים ב-SEC.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...