Name: ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization at JoVE.com

लेखक उसकी सलाह और सहयोग के लिए डॉ Tsafi डैनियल (Wolfson सेंटर फॉर एप्लाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी, हिब्रू विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखकों की सहायता और विश्लेषणात्मक FPLC-मलों इस अध्ययन में उपयोग प्रणाली की स्थापना के लिए Danyel बायोटेक लिमिटेड (Rehovot, इसराइल) भी धंयवाद ।

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डी एस Wyatt प्रौद्योगिकी निगम, जिसके उत्पादों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है के एक कर्मचारी है । एटी Danyel बायोटेक, Wyatt और ÄKTA उपकरणों के एक वितरक के एक कर्मचारी है ।

Iex-मलों प्रोटीन जुदाई और लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है कि शुद्ध मोलर द्रव्यमान का दृढ़ संकल्प के रूप में अच्छी तरह के रूप में विषम नमूनों की अनुमति देता है, देशी oligomers, गैर देशी समुच्चय, सहसंयोजक और noncovalent विशेषता परिसरों, और संयुग्मित प्रोटीन । एक रेखीय ढाल या नमक एकाग्रता चरणों की एक श्रृंखला से मिलकर एक कार्यक्रम प्रोटीन की आबादी का एक अच्छा जुदाई को प्राप्त करने और मलों द्वारा प्रत्येक व्यक्ति चोटी के उचित विश्लेषण की अनुमति कर सकते हैं । इसके अलावा अनुकूलन विभिन्न मापदंडों, जैसे ग्रेडिएंट ढलान (चरण ३.४ प्रोटोकॉल के देखें) द्वारा, एक बेहतर समाधान की आवश्यकता है, तो किया जा सकता है । IEX-मलों एक मूल्यवान प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण परख हो सकता है के बाद से यह प्रोटीन लक्षण वर्णन के एक अतिरिक्त, महत्वपूर्ण स्तर प्रदान करता है, ऐसे सेकंड के रूप में अंय विधियों के पूरक-मलों ।
जबकि सेकंड-मलों प्रोटीन दाढ़ जन संकल्प के लिए एक मानक और आम तकनीक है, मानक विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम के अपेक्षाकृत कम संकल्प सटीक दाढ़ मास माप की सीमा हो सकता है12मलों द्वारा प्राप्त किया । SEC-मलों की सीमाओं के कुछ उदाहरणों में ऐसे समाधानों को शामिल किया गया है जिनमें क्रमिक रूप से oligomers, एकत्रीकरण के उच्च स्तर जो मोनोमर पीक से पूरी तरह अलग नहीं हैं, और समान मोलर द्रव्यमान वाली विषम जनसंख्या, जैसे संशोधित प्रोटीन.
Iex एक और अधिक जटिल क्रोमैटोग्राफी विधि के लिए डिजाइन और सेक से बाहर ले जाता है, लेकिन एक iex-मलों प्रयोग से प्राप्त जानकारी पूरक कर सकते है और कभी भी अधिक सेकंड से जानकारीपूर्ण-मलों विश्लेषण हो सकता है । Iex-मलों सफलतापूर्वक एंटीबॉडी वेरिएंट है कि एक ही मोलर मास, oligomers है कि पूरी तरह से सेकंड पर अलग नहीं कर रहे हैं, और छोटे पेप्टाइड्स कि धारा12,24द्वारा विश्लेषण करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं का हिस्सा विशेषता है । इसके अलावा, macromolecular विधानसभाओं कि भी सेकंड से अलग होने के लिए बड़े हैं, जैसे पूर्ण (वायरल डीएनए युक्त) और adeno के खाली कणों से जुड़े वायरस (AAV), IEX द्वारा हल किया जा सकता है25 से पहले मलों विश्लेषण. एसईसी की तुलना में, आईईएक्स अधिक विविध पृथक्करण क्षमताएं प्रदान करता है और इसमें कई मापदंडों को समायोजित करने का लचीलापन होता है, जैसे बफर पीएच, नमक के प्रकार, कॉलम की लंबाई और अन्य । सेकंड के विपरीत, वहां IEX में नमूना इंजेक्शन के लिए कोई मात्रा सीमा है, और किसी भी अणु अपने आकार के स्वतंत्र विश्लेषण किया जा सकता है (Amartely एट अल.12में तालिका 1 देखें) । यह IEX-मलों का एक बड़ा लाभ है, मुख्य रूप से एक कम रास तीव्रता के साथ नमूनों के लिए, जैसे बहुत छोटे प्रोटीन या पतला प्रोटीन एकाग्रता पर एकत्रीकरण के लिए एक प्रवृत्ति के साथ. चूंकि विश्लेषणात्मक iex कॉलम और अधिक स्थिर है और सेकंड कॉलम से कम कणों जारी करते हैं, iex-मलों बहुत कम साम्यन समय की आवश्यकता है, और रास सिग्नल बहुत तेजी से स्थिर हैं । यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में व्यक्तिगत प्रयोगों के चलने और आवश्यक के रूप में चलाने की रोक की अनुमति देता है ।
सेकंड के विपरीत, जो आम तौर पर केवल एक ही प्रयोग के साथ ठीक परिणाम प्रदान करता है (सही प्रभाजन रेंज के साथ एक स्तंभ का उपयोग), iex कई प्रयोगों के लिए विधि पैरामीटर ट्यूनिंग द्वारा इष्टतम संकल्प प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है । आईईएक्स-मलों में प्रयोग किया जाता है कि एक नमक ढाल के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, बफर चालकता और, इस प्रकार, RI नाटकीय रूप से चलाने के दौरान परिवर्तन, आरआई संकेत के परिणामस्वरूप परिवर्तन के साथ. यह प्रत्येक IEX-मलों प्रयोग के लिए एक अतिरिक्त रिक्त रन की आवश्यकता है और आधार रेखा घटाव के साथ एक विश्लेषण (के रूप में प्रोटोकॉल के चरण ५.२ में वर्णित) जब तक एकाग्रता विश्लेषण यूवी का पता लगाने के लिए सीमित है (विलुप्त होने के एक प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता प्रत्येक चोटी के लिए गुणांक) । आधार रेखा घटाव के साथ विश्लेषण रैखिक gradients के लिए मजबूत है, भले ही विधि के आगे विकास अभी भी नमक पदश: कार्यक्रमों के सफल आधारभूत घटाव के लिए आवश्यक है । प्रत्येक चोटी के dn/dc मान eluted चोटी पर विशिष्ट बफर चालकता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (गणना में पाया जा सकता है साहित्य12) । यदि एक प्रोटीन एक NaCl एकाग्रता से कम २०० मिमी (BSA उदाहरण में की तरह) पर eluted, यह समायोजन नगण्य है ।
आईईईईएक्स-मलों में प्रयुक्त प्रोटीन की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण २.३ में विस्तृत है) सेकंड-मलों की तुलना में नमक प्रवणता और आरआई के अपूर्ण मिश्रण के कारण होने वाले उतार चढ़ाव की वजह से री सिग्नल के नाटकीय परिवर्तन को दूर करना महत्वपूर्ण है ग्रैडिएंट बफ़र्स । यदि केवल यूवी का पता लगाने बड़े पैमाने पर माप के लिए प्रयोग किया जाता है, छोटी मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है । इंजेक्शन प्रोटीन की मात्रा प्रोटीन, एकरूपता, शुद्धता, और यूवी विलोपन गुणांक के मोलर द्रव्यमान पर निर्भर करता है । आवश्यक इंजेक्शन बड़े पैमाने पर छोटे प्रोटीन के लिए अधिक होना चाहिए और बड़ा प्रोटीन के लिए कम (~ 1 एक 20 केडीए प्रोटीन के लिए मिलीग्राम और ~ ०.२ एक १५० केडीए प्रोटीन के लिए मिलीग्राम). विषम नमूनों की मात्रा कई आबादी के बीच विभाजित है के बाद से अधिक नमूने के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है । विश्लेषणात्मक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) एक FPLC प्रणाली से कम सामग्री की आवश्यकता हो सकती है ।
हाल ही में, में लाइन विश्लेषण शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के दौरान मलों का उपयोग कर रिपोर्ट किया गया है । इस तरह के एक वास्तविक समय विश्लेषण एकत्रीकरण उत्पादों है कि शुद्धिकरण के दौरान होने का पता लगाने के लिए बहुत कुशल है और26शुद्धि के बाद प्रोटीन के किसी भी आगे विश्लेषण की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं । Iex क्रोमैटोग्राफी अक्सर एक मध्यवर्ती शुद्धि कदम के रूप में प्रयोग किया जाता है; इस प्रकार, मलों के साथ preparative IEX कॉलम के संयोजन न केवल एक विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन विधि के रूप में उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी बड़े पैमाने पर शोधन प्रक्रियाओं के एक वास्तविक समय विश्लेषण के रूप में । Nonanalytical IEX कॉलम भी स्थिर कण के साथ एक कम डिग्री जारी कर रहे हैं, और इसलिए, मलों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय जुदाई तकनीकों, जैसे संबध क्रोमैटोग्राफी या जलविरागी विनिमय क्रोटोग्राफी, भी जब अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों के अधीन मलों के साथ संयुक्त किया जा सकता है (मलों और आरआई डिटेक्टरों के संदूषण से बचने के लिए) । यह अनुकूलन और विधि के अनुकूलन के लिए न केवल अच्छा पीक जुदाई लेकिन यह भी पर्याप्त रूप से साफ रास और आरआई एक सफल मलों के विश्लेषण के लिए संकेतों को प्राप्त करने की आवश्यकता होगी ।

प्रोटीन उत्पादों की मात्रात्मक लक्षण वर्णन तेजी से गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के एक साधन के रूप में आवश्यक है, दोनों biopharmaceutical उद्योग में नियामक प्रयोजनों के लिए और विश्वसनीयता और जीवन विज्ञान अनुसंधान की अखंडता की गारंटी1 , 2. जैसा कि यूरोप में प्रोटीन नेटवर्क प्रोटीन उत्पादन और शोधन भागीदारी की वेबसाइटों पर वर्णित (P4EU) और यूरोप में जैव भौतिकी अनुसंधान के लिए संसाधनों के संघ और यूरोप में आणविक जैव भौतिकी (आरबर्-मोबीयू) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs और https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, क्रमशः), प्रोटीन QC न केवल अंतिम उत्पाद की पवित्रता की विशेषता चाहिए, लेकिन यह भी अपने oligomeric राज्य, एकरूपता, पहचान, conformation, संरचना, posttranslational संशोधनों, और अंय गुण3,4।
सबसे आम QC लक्षण वर्णन विधियों में से एक SEC-मलों है । इस विधि में, एक विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम मलों और स्पेक्ट्रोफोटोमितीय और रिफ्रैक्टोमेट्रिक डिटेक्टरों के लिए युग्मित है, प्रत्येक चोटी5के प्रोटीन दाढ़ द्रव्यमान की सटीक माप को सक्षम करने । सेक-मलों eluted चोटियों के दाढ़ द्रव्यमान का निर्धारण स्वतंत्र रूप से स्फूर्ति की मात्रा से और कॉलम अंशांकन का उपयोग कर विश्लेषणात्मक सेकंड की अशुद्धि काबू । एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (dls) मॉड्यूल के अलावा आकार माप क्षमता द्रवगतिक त्रिज्या दृढ़ संकल्प की अनुमति कहते हैं । अकादमिक अनुसंधान में, सेकंड-मलों आमतौर पर एक प्रोटीन की oligomeric राज्य निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसकी रचना, शुद्धता के स्तर, एकत्रीकरण के स्तर, और संशोधित प्रोटीन, जैसे कि नच या लिपिड-सॉल्बिलाइज्ड झिल्ली प्रोटीन (निर्धारित प्रोटीन का मोलर द्रव्यमान और घटकों को व्यक्तिगत रूप से संयुग्मी करना)6,7,8.
कई मामलों में, एक शुद्धि प्रक्रिया के अंतिम प्रोटीन एक अच्छी तरह से परिभाषित आणविक प्रजातियों नहीं बल्कि कुछ विषमजनन शामिल हैं । इस तरह के मिश्रण में प्रोटीन संरचना (उदाहरण के लिए, विभिंन oligomeric रूपों), conformations, या प्रोटीन isoforms के मामले में अलग किया जा सकता है । प्रोटीन विविधता भी सी-टर्मिनल lysine प्रसंस्करण या asparagine/ग्लूटामिन deamination के कारण मामूली रासायनिक मतभेदों का एक परिणाम हो सकता है, परिवर्तन चार्ज करने के लिए अग्रणी9,10. ऐसे ग्लाइकोसिलेशन के रूप में posttranslational संशोधनों में अंतर भी आरोप विविधताओं9के साथ विषम नमूनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । विविधता के इन विभिंन प्रकार के प्रोटीन जैव भौतिक विशेषताओं में परिलक्षित होते है और स्थिरता और लक्ष्य प्रोटीन11के जैविक गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं ।
इस तरह के विषम नमूनों की विश्वसनीय गुणवत्ता नियंत्रण assays एक अत्यधिक रिज़ॉल्टिव विश्लेषणात्मक पृथक्करण तकनीक की आवश्यकता होती है । वहां मामलों जहां अच्छा जुदाई विश्लेषणात्मक सेकंड कॉलम के साथ प्राप्त करने के लिए चुनौती दी जा सकती हैं, उनके सीमित संकल्प और जुदाई क्षमताओं12के कारण, त्रुटिपूर्ण सेकंड में जिसके परिणामस्वरूप-मलों विश्लेषण । ऐसी मलों के साथ IEX के रूप में एक उच्च विशिष्टता जुदाई तकनीक के संयोजन विषमजातीय नमूनों में सेक की सीमा को दूर कर सकते है और प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए एक पूरक विधि प्रदान (तालिका 1 Amartely एट अल.12में) । सेकंड के विपरीत, जो उनके द्रवगतिक आकार13द्वारा अणुओं अलग करता है, iex उनके सतह चार्ज14द्वारा अणुओं अलग करता है । Anion एक्सचेंज (AIEX) और धनायन एक्सचेंज (CIEX) matrixes नकारात्मक और सकारात्मक आरोप लगाया वेरिएंट, क्रमशः बाँध । एक अपेक्षाकृत करीब द्रव्यमान या आकार का हिस्सा है कि प्रोटीन आबादी के बीच एक ठीक जुदाई के साथ, iex-मलों सफलतापूर्वक एक मिश्रण नमूना12में प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन राज्य के दाढ़ द्रव्यमान निर्धारित करता है ।
यहाँ हम एक IEX-एक ही नमूना में मौजूद है कि BSA oligomeric रूपों के विभाजन और विश्लेषण के लिए प्रयोग-मलों चलाने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. एक विशिष्ट प्रोटीन के लिए एक IEX कॉलम के चुनाव महत्वपूर्ण है और चर्चा की, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पीएच और बफ़र्स की चालकता की स्थिति । IEX-मलों के प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण भी कदम दर कदम बताया जाता है । हालांकि BSA oligomers के जुदाई अच्छा है और सेकंड में पर्याप्त-मलों, BSA एक अच्छा उदाहरण के लिए IEX-मलों क्षमताओं को दिखाने के लिए और एक प्रयोग के अनुकूलन का प्रदर्शन है । सेकंड-मलों द्वारा प्राप्त खराब पृथक्करण और आईईएक्स-मलों द्वारा सक्षम उचित पृथक्करण और विश्लेषण के उदाहरण पिछले अध्ययन12में चर्चा में हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#196;KTA pure</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:236px;">FPLC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.02 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1002</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1012</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 25 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-2012</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">BSA (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">miniDAWN TREOS&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREOS</td>
			<td>MALS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mono Q HR 5/50 GL</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td>Anion exchange analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optilab T-rEX</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREX</td>
			<td>Refractometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.1 mm PES 1000 mL Stericup</td>
			<td style="width:136px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCVPU11RE</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TRISMA base</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>TRIS buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization

आयन-मल्टी कोण प्रकाश बिखरने के साथ विनिमय क्रोटोग्राफी (IEX-मलों) प्रोटीन जुदाई और लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । सटीक दाढ़ मास विश्लेषण के साथ उच्च विशिष्टता जुदाई तकनीक iex के संयोजन से प्राप्त विषमजातीय प्रोटीन नमूनों के लक्षण वर्णन, oligomeric रूपों या प्रोटीन की आबादी के मिश्रण सहित, यहां तक कि बहुत से इसी तरह की मोलर जनता । इसलिए, IEX-मलों एक अतिरिक्त स्तर के प्रोटीन लक्षण वर्णन प्रदान करता है और मानक आकार-बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी के साथ बहु-कोण प्रकाश बिखरने (सेक-मलों) तकनीक के पूरक है ।
यहां हम एक बुनियादी iex-मलों प्रयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (bsa) पर इस विधि का प्रदर्शन । Iex अपने oligomeric रूपों के लिए bsa अलग प्रत्येक व्यक्ति के फार्म की मलों द्वारा एक दाढ़ व्यापक विश्लेषण की अनुमति । एक iex-मलों के अनुकूलन प्रयोग भी प्रस्तुत किया है और bsa पर प्रदर्शन, bsa मोनोमर और बड़ा oligomers के बीच उत्कृष्ट जुदाई को प्राप्त करने । Iex-मलों प्रोटीन गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान तकनीक है क्योंकि यह दोनों ठीक जुदाई और एक नमूना में मौजूद है कि कई प्रोटीन प्रजातियों के दाढ़ सामूहिक संकल्प प्रदान करता है ।

BSA एक आम प्रोटीन है जो प्रयोगात्मक प्रणाली22 के अंशांकन के लिए क्रोमेटोग्राफी में प्रयोग किया जाता है और iex-मलों, साथ ही साथ सेकंड-मलों के अभ्यास के लिए अत्यधिक उपयुक्त है । यह मुख्य रूप से एकलक ६६.७ केडीए के एक सैद्धांतिक एकलक द्रव्यमान के साथ है और आमतौर पर dimers और उच्च oligomers की एक छोटी संख्या23शामिल हैं ।
Bsa iex-एक ऋणायन एक्सचेंज विश्लेषणात्मक कॉलम ( सामग्री की मेजदेखें) का उपयोग कर मलों पर विश्लेषण किया गया । ७५ मिमी से ३५० मिमी nacl तक के 30 CV से मिलकर बना एक विस्तृत रैखिक ढाल उच्च oligomers से bsa मोनोमर अलग । डाउनस्ट्रीम मलों के विश्लेषण के परिणामस्वरूप एक परिकलित मोनोमर मोलर मास में ६६.८ ± ०.७ केडीए और १३० ± 5 केडीए के एक परिकलित डिमर मोलर मास में (चित्रा 1ए) ।
Eluted चोटियों पर बफर चालकता के आधार पर, ढाल एक अलग कार्यक्रम के लिए बदल गया था: १७५ मिमी NaCl का एक लंबा कदम १७५ मिमी से ५०० मिमी NaCl के लिए एक रैखिक ढाल के बाद. नई ढाल बहुत संकल्प और bsa एकलक के बीच उत्कृष्ट जुदाई में सुधार (६६.१ ± ०.७ केडीए की एक परिकलित मोलर द्रव्यमान के साथ) और उसके उच्च oligomeric प्रजातियों (१३२ ± 2 केडीए की एक गणना औसत द्रव्यमान के साथ) (चित्रा 1बी) । आदेश में भी उच्च oligomeric प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और bsa के प्रत्येक व्यक्ति oligomeric फार्म के दाढ़ जनता की गणना करने के लिए, २०० मिमी और २५० mm nacl के एक पदश: कार्यक्रम लागू किया गया था । इस प्रयोग के परिणामस्वरूप bsa एकलक के बीच एक उत्कृष्ट जुदाई (६२.४ ± ०.४ केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ), द्वितय (१३० ± 10 केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ), और त्रितयाणु (१७० ± 10 केडीए की एक गणना द्रव्यमान के साथ) (चित्रा 1सी) । सभी iex-मलों प्रयोगों से पता चलता है कि bsa elutes ज्यादातर ८०% की शुद्धता के साथ एक एकलक के रूप में, सेक के साथ समझौते में-जहां bsa एकलक ८५%12की शुद्धता के साथ elutes परिणाम ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg"> चित्रा 1 : BSA के लिए IEX-मलों प्रयोग का अनुकूलन । (क) 75-350 एमएम एनएसीएल के ग्रैडिएंट कार्यक्रम के साथ बीएसए का आईईएक्स-मलों का प्रयोग । (ख) १७५ मिमी nacl चरण के एक कार्यक्रम के साथ bsa के iex-मलों प्रयोग 175-500 मिमी nacl के एक रैखिक ढाल कार्यक्रम के बाद । (ग) २०० मिमी और २५० मिमी nacl के एक कदम कार्यक्रम के साथ bsa का iex-मलों प्रयोग । Chromatograms २८० एनएम (नीला) पर यूवी प्रदर्शन, एक ९० ° कोण पर प्रकाश बिखरने (लाल), और अपवर्तक सूचकांक (गुलाबी) और चालकता (ग्रे) वक्र प्रत्येक शिखर के मोलर द्रव्यमान के साथ एक साथ मलों द्वारा परिकलित (काला). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

यह प्रोटोकॉल एक विषम नमूना में प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, और पेप्टाइड्स के एक सटीक दाढ़ सामूहिक संकल्प के लिए बहु कोण प्रकाश बिखरने के साथ उच्च विशिष्टता आयन-विनिमय क्रोटोग्राफी के उपयोग का वर्णन करता है । इस विधि गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए मूल्यवान है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में देशी oligomers, प्रभारी वेरिएंट, और मिश्रित प्रोटीन नमूने के लक्षण वर्णन के लिए ।

आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

ऑनलाइन आकार अपवर्जन और एक SAXS Beamline पर आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

रेडियो-लेबल वाली जीटीपी बाइंडिंग के माध्यम से जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग को मापना

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

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जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

अलग आयामों के साथ बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग कर स्वचालित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ युग्मित

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

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इसके विपरीत-झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक विश्लेषण और अटल बिहारी Initio मॉडलिंग के लिए छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर प्रयोगों में डिटर्जेंट मिलान

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

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आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन की विशेषता मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-मेल्स) के लिए जोड़ा गया

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

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सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...