Name: ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
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著者は、彼女のアドバイスやコラボレーションありがとう博士 Tsafi ダニエリ (応用構造生物学、ヘブライ大学ウォルフソン センター)。著者らはまた、支援と本研究で利用されている分析 FPLC MALS システムの確立のためかたさバイオ株式会社 (イギリス) を感謝します。

1. システムの準備
<ol><li>制御、データ集録、およびメーカーの分析のため、各ソフトウェア パッケージと共にタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムと MALS/屈折のインデックス (RI) 検出器 (材料の表を参照) をインストールします。指示に従います。</li>
	<li>MALS と RI 検出器下流 FPLC の UV と電気伝導度検出器を接続します。紫外線と MALS 検出器間 interdetector の容積を最小限に抑えるための pH 勾配のため絶対に必要がある場合は、pH 検出器をバイパスします。0.25-0.5 のキャピラリー チューブを使用して、列と検出器廃棄物や一部のコレクターに RI 検出器の出力の 0.75 mm 内径キャピラリー チューブの径 (内径) mm。</li>
	<li>MALS Aux 入力に FPLC 検出器から UV アナログ出力、MALS Autoinject に、I/O ボックスを介して、FPLC からデジタル出力を含む FPLC と検出器の間に必要な信号接続が確立されていることを確認します。</li>
</ol>2. サンプルとバッファーの準備
<ol><li>0.1 μ m のフィルターで洗浄と溶出バッファーを含むすべての試薬をフィルター処理します。廃瓶の中に乾燥フィルターから微粒子を除去するために最初の 50-100 mL のバッファーをフィルター、ろ過された水で徹底的に洗浄されており、入力からほこりを防ぐためにおおわれて清潔で滅菌ボトルでバッファーの残りの部分を保ちます。</li>
	<li>BSA サンプルの pH とイオン強度を調整する (例えば、pH = 8、50 mM NaCl) 希釈、限外ろ過、またはバッファー交換の手順中に IEX 列へのバインドを許可します。 注: 目的の素材は削除されません最小孔径に蛋白質のサンプルをプレフィルターにお勧め (0.02-0.1 μ m)。また、サンプルは、大粒子の沈殿物を有効にする 10 分間高速 (13,000-16,000 x g) で遠心できます。</li>
	<li>少なくとも 0.3 – 0.5 を準備 BSA の mg (材料の表を参照) 良質 MALS 分析を達成するため 1 mL 列 (5/50 mm) で注入します。注入量、限定されないことに注意してください。</li>
</ol>3. 選択とタンパク質 IEX 法の開発
<ol><li>ExPASy にProtparam ツールなどのサーバーの場合は、ウェブサイトに使用される15をすることができます、一次配列に基づくタンパク質の等電点 (pI) を計算します。BSA の pI が 5.8 であることに注意してください。</li>
	<li>列のタイプとバッファーのパラメーターを選択します。<ol>
<li>PK、バッファーのと、バッファーのイオンの性質によって AIEX と CIEX、別のバッファーを使用します。小さなポリマーと CIEX 列の実行時 AIEX 列とアニオン性バッファーを実行するときは、カチオン性のバッファーを使用します。この例では、AIEX 列の BSA の解析のための pH 8、20 mM トリス塩酸バッファーを使用します。</li>
		<li>Pi が 7、BSA などより低い蛋白質のための少なくとも 2 つのユニットによる pI より高い pH AIEX 列とバッファーを使用します。Pi が 7 より高い蛋白質のための少なくとも 2 つのユニットによる蛋白質の pI より低い pH CIEX 列とバッファーを使用します。</li>
		<li>タンパク質と列のマトリックスの結合の強さに応じてバッファー pH を最適化します。タンパク質は列にはバインドされない場合、は、pI の遠くから pH を使用します。タンパク質は使用 pH で安定していることを確認します。</li>
		<li>バインドで低塩分濃度を使用し、蛋白質の結合は、ロードされたサンプルのイオン強度に依存するため, 行列に蛋白質の結合を許可するバッファーを洗ってください。蛋白質は通常彼らの安定性のいくつかの塩を必要とします。したがって、タンパク質の読み込みと列洗濯の手順中に 50 mM NaCl (または代替塩) を使用します。</li>
		<li>溶出バッファー列からの蛋白質をデタッチするのには 0.5 M の NaCl の最大値を使用します。 注: 器械の範囲の制限により標準モデル RI 糖度計を使用する場合より高い塩濃度は推奨されません。しかし、高濃度モデルは使用することができます、2 M の NaCl を収容します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最初のメソッドを次のように実行します。<ol>
<li>BSA の 1 mg を読み込む (6 mg/mL の 170 μ L) pH 8、20 mM トリス塩酸バッファーの読み込みバッファーの ~0.5 ml 50 mM NaCl を含みます。光散乱 (LS)、UV、まで非連結分子および粒子システムからの完全な溶出を許可する 10-15 列ボリューム (CV) に同じバッファーを洗い流すし、RI 信号が完全に安定化します。</li>
		<li>20-30 CV、20 mM トリス-HCl、pH 8 の溶出バッファーを使用して、列からの蛋白質をデタッチするのには 0.5 M の NaCl を含むの短い、線形塩グラデーションを実行します。溶出バッファーの 0-100% (または代替の広範なグラデーション) のグラデーションを実行または 2 つのグラデーションに分割: 溶出バッファーの 0-50% の追加勾配溶出バッファー、各グラデーション 10-20 CV のための 50%-100% の順。BSA の 30 の広範な勾配 15%-70% を使用して、最初のメソッドの CV。 注: いくつかのインスタンスで最初のメソッドがあります信頼性の高い MALS 分析のための分離、追加は必要ありません。多くのケースでは、初期のメソッドは、メソッド最適化を行うためのガイダンスだけを提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解像度を上げるし、さまざまなパラメーターを変更することによってピークの分離を改善する IEX メソッドを最適化します。<ol>
<li>グラデーションの傾斜と長さを変更します。穏やかな斜面で長い勾配を提供よりよい分離の低いピーク高斜面ショート グラデーションと少ない分離強烈なピークを提供します。最適な MALS 分析ピーク解像度と信号強度の間のバランスを見つけます。 注意: LS、UV を増やすことができます蛋白質のより高い量の読み込みと RI 信号は、解像度を犠牲にして 。</li>
		<li>溶出は、段階的な塩分濃度プロファイルを使用します。手順と線形グラデーションの組み合わせを用いを覚えています。</li>
		<li>ピークの分離を改善するために流量を減少させます。 注: 非常に小さな粒子とマトリックスのためこれは非常に重要です。</li>
		<li>サンプルのタンパク質集団間でバリエーションを増やすし、それらの変形の間の分離を強化するためにバッファー pH を変更します。メモ異なる pH で正しく 1 つの pH で分離されていない蛋白質を分けることができます。</li>
		<li>IEX 列からの蛋白質をデタッチするのに勾配、線形、段階的、pH を使用します。PH や塩濃度の変動に応じて組み合わせる溶出グラデーションを使用します。</li>
		<li>MgCl2、または酢酸ナトリウムなどの弱い塩などの強い塩を使用して、感度と分解能16を増やします。</li>
		<li>小さい粒子の分離能力を向上させる長い IEX 列または異なる列マトリックスを使用します。</li>
		<li>(AIEX/CIEX) 分離の別パターンを提供する列の型を変更します。強い、弱い、または結合された (混在モード) の配位子と行列もあり、いくつかのサンプルの解像度を向上させることができることに注意してください。</li>
		<li>別のマトリックス樹脂に接続されている同じ配位子を持つ別のサプライヤーからの列を使用します。リガンドは、独立ガレージ自体は異なる蛋白質と相互に作用でき、分離特性に影響を与えます。</li>
		<li>タンパク質の安定性を改善し、IEX 実験を改善するために蛋白質の集合を防ぐバッファー、添加物 (溶液中のタンパク質の安定化分子) があります。 注: このような添加物の例としては、糖アルコール、尿素、非イオン性、両性イオン洗剤、塩17,18カオトロ ピックと kosmotropic。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. IEX MALS 実験
<ol><li>MALS ソフトウェアのメソッドから New\Experiment を開き、光散乱法システムフォルダーからオンラインの方法を選択します。DLS モジュールが DLS データが取得する場合は、光 Scattering\With QELSサブフォルダーからオンラインのメソッドを選択します。</li>
	<li>構成セクションの下の実行のパラメーターを設定します。<ol>
<li>FPLC (1.5 mL/分) で使用される流量汎用ポンプセクションで実行の流量を設定し、入力または溶媒] セクションの [バッファー パラメーターを確認します。</li>
		<li>タンパク質名 (BSA)、屈折率増分を入力 (dn/dc; 標準タンパク質の値は 0.185 mL/g)、280 の波長に紫外線吸光係数の蛋白質のサンプル (6 mg/mL) の濃度と nm (0.66 g/L-1·cm-1)、インジェクター ] セクションの [サンプル] タブの。インジェクション (170 μ L) 同じセクションの下で同様のサンプル ボリュームを挿入します。</li>
		<li>基本的なコレクション] タブの [手順] セクションでAutoinject のトリガーチェック ボックスをオンし、グラデーションが達した後、少なくとも 5 分間継続するデータ コレクションの実行期間を設定、最終的な値。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FPLC ソフトウェアでテストのパラメーターを設定します。<ol>
<li>[メソッド エディター ] タブで新しいテストを作成します。最初の実験は、塩や pH の線形グラデーションになります (手順 3.3 参照)。最適化されたメソッドの最初のメソッド中により特定のグラデーションまたは溶出結果に応じて段階的なプログラムを作成 (手順 3.4 と図 1を参照)。MALS ソフトウェアでのデータ収集をトリガーするメソッドにパルス信号を含めます。</li>
		<li>列と関連するバッファーを持つバルブを洗う: 20 mM トリス-HCl、pH 8、50 mM NaCl 洗浄バッファー (弁) および溶出バッファー (B バルブ) の 500 mM の NaCl と同じバッファーの。最後のカラム洗浄が列行列に蛋白質の結合を有効にする低塩分濃度を含む結合バッファーを使用することを確認します。厳密にバインドされた不純物の大規模な洗浄、中和バッファー洗浄に続いて、関連するバッファーを洗浄する前に 0.5 M NaOH を使用します。</li>
		<li>注射器を使用してループに蛋白質のサンプルを置きます。10 mL 以上のサンプルをロードすると、フィルターのポンプおよび FPLC のミキサーをバイパスしながら、superloop または FPLC 楽器のポンプ バルブを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FPLC ソフトウェアを実行] ボタンをクリックしをクリックして、MALS ソフトウェアの最初実験を開始します。MALS 検出器を経由して FPLC 楽器からパルス信号を受信した後データが収集されます。</li>
	<li>実行と IEX MALS がスタンドアロンのメソッドの代わりに連続的な流れモードで手動で実行された場合、手順 4.1-4.4 で説明の同じパラメーターを適用します。</li>
	<li>Final メソッドを確認して実行して、空白の挿入 (サンプルではなく読み込みバッファー) を使用して同じ方法正確を実行します。Autoinject パルスと空白の実行のグラデーションのタイミング、実行サンプルを同一であることが重要です。</li>
</ol>5. IEX MALS 実験データの分析
<ol><li>MALS ソフトウェアで解析手順」セクション手順を実行します。基本的なコレクションビューには、実験の生データ コレクションが表示されます。<ol>
<li>彼らは多くのノイズを示す場合のクロマト グラムを滑らかにするのに [ Despiking ] タブを使用します。通常、正常なレベルを使用します。</li>
		<li>すべての信号のベースラインを定義 (LS、UV、RI 検出器)ベースラインビューで。</li>
		<li>ピークビューの分析のためのピークを定義します。Dn/dc と各ピークの下の蛋白質のための UV 吸光係数の正確な値を確認します。 注意: 蛋白質のためそれは 0.185 mL/g の標準 RI インクリメント値を使用する一般的なが他の高分子の分子の性質によると異なる dn/dc 値を使用する必要があります。ショ糖などの糖類が 0.145 mL/g20 dn/dc 平均値と脂質と洗剤の範囲 0.1-0.16 の間の dn/dc 値、ポリヌクレオチド (DNA ・ RNA) の平均 dn/dc は 0.17 mL/g19mL/g21。</li>
		<li>モル質量と半径の継ぎ手パラメーターとモル質量と LS から半径、 Rh QELS からビューの相関関数を使用して分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>塩濃度の増加に伴い IEX MALS の間に大きな RI 信号の変更を実行します。したがって、RI データを必要とする大量の計算に空白の注入からの基準信号を減算します。<ol>
<li>タンパク質と空白 IEX MALS 実験の両方を開きます。蛋白質テスト名を右クリックし、 Apply メソッドを選択し、ファイル ダイアログ ボックスから基線の減算フォルダーを選択します。標準的なモル質量分析法 (例えば、オンライン) の適切な型を選択します。新しい開いているメソッドのパラメーターとタンパク質の実験用に定義された設定が保存されることに注意してください。</li>
		<li>基線の減算表示インポート空白空白の実行の信号をインポートするをクリックします。楽器(インポート空白のボタン) の横にある、[減算する検出器のすべてをチェックします。</li>
		<li>ピークビューでソリューションの RI が実行12時に変更されたのでタンパク質のピーク面積で溶液の伝導率による dn/dc 値 (必要な場合) を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BSA モノマー IEX MALS システムを校正します。 注: 通常、IEX MALS システムは、定期的に校正されてピーク配置、バンドの広がり、および正規化の旋回 (Rg) の半径を持つ単分散タンパク質を用いた 90 ° 検出器の角度検出器の < 10 nm、BSA モノマーなど。この例では、BSA は校正分子としての両方を提供しています、自体モル質量分析の対象であります。<ol>
<li>プロシージャの下のピークを揃える >構成ビュー。</li>
		<li>3.0 を入力正規化ビューの下の正規化を実行Rg値として nm。</li>
		<li>バンドを広げる同じ構成] タブ、[ピークを選択し、実行に合わせてボタンを使用して、RI 信号に UV と LS 信号に一致します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>結果のグラフは、フィッティング結果ビューに表示されます。グラフを右クリックし、編集を選択、[詳細設定] ボタンをクリックして軸スケールなどのグラフのパラメーターを変更します。詳細表示オプションのグラフ図もEASI グラフ] タブで利用可能です:モル質量をウィンドウの上部を表示ドロップ ダウン メニューから選択します。</li>
	<li>モル質量、半径、純度、等を含むすべての結果がレポートビュー (要約または詳細) [結果] セクションの下に利用可能なことに注意してください。詳細の結果またはパラメーターとしての数字をレポートに追加するのにレポート デザイナー ] ボタンを使用します。</li>
</ol>

<ol>
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D.S. は、ワイアット テクノロジー株式会社は、その製品がこのプロトコルで利用されているの従業員です。A.T. は、かたさバイオ テクノロジー、ワイアットと ÄKTA 商品の販売代理店の社員です。

IEX MALS は蛋白質の分離とキャラクタリゼーション異種サンプルは、現在も純粋な蛋白質のモル質量測定を可能にするための強力な方法外来集計、共有結合性と非ネイティブ オリゴマーを特徴付ける錯体、および共役蛋白質。線形グラデーションまたは一連の塩濃度ステップから成るプログラム タンパク質個体群の良好な分離を達成でき、MALS で各々 の個々 のピークの適切な分析が。グラデーションなど、さまざまなパラメーターを変化させることによってさらに最適化は斜面 (プロトコルの手順 3.4 参照) より解像度が必要な場合に実行することができます。IEX MALS は、タンパク質解析、秒 MALS など他の方法を補完するものの追加の重要なレベルを提供するので貴重なタンパク質品質管理分析をすることができます。
秒 MALS 蛋白質モル質量決定のための標準および一般的な手法ですが、標準的な分析の SEC カラムの比較的低解像度 MALS12により正確なモル質量測定に制限します。秒 MALS の制限のいくつかの例には、連続したオリゴマー、モノマーのピーク、および変更された蛋白質などと同様のモル質量を持つ異種個体集団から完全に分離されていない高レベルの集計を含むソリューションが含まれます。
IEX 設計および SEC よりも遂行するより複雑なクロマト グラフ法が IEX MALS 実験から得られた情報を補完してあります秒 MALS 分析よりもさらに有益できます。IEX MALS は正常に分離されていない完全に秒、および解析が難しい短いペプチッドで秒12,24で同じモル質量、オリゴマーを共有抗体バリアントを特徴としています。また、大きすぎてフル (含むウイルス DNA)、アデノ随伴ウイルス (AAV) の空の粒子など秒、区切ってある高分子アセンブリは IEX25 MALS 分析の前に解決できます。IEX 秒に比べてより多様な分離機能14を提供、バッファー pH、塩、型および列の長さの種類など、ピークの解像度を増加するいくつかのパラメーターを調整する柔軟性があります。SEC とは異なり IEX, のサンプル注入量制限がないと任意の分子は、そのサイズの独立した分析できる (Amartely ら12のテーブル 1 を参照)。これは LS の低強度、非常に小さなタンパク質など希釈タンパク質濃度に集約する傾向のあるサンプルの主、IEX MALS の大きな利点です。分析 IEX 列はより安定した、SEC 用カラムより少ない粒子を解放する傾向があるので IEX MALS は、非常に短い平衡時間を必要として LS 信号は非常に高速安定化します。これにより、このプロトコルで記述として個々 の実験の実行、必要に応じて、実行の停止。
異なり、秒、通常を提供する素晴らしい結果 1 つだけ実験 (右の分画範囲と列を使用して)、IEX はメソッドのパラメーターをチューニングすることによって最適な解像度を達成するためにいくつかの実験を必要があります。IEX MALS 実験で塩のグラデーション、バッファー伝導度実行され、したがって、RI 劇的に変更して、実行中に RI 信号の変更と。これは、基線の減算 (プロトコルの手順 5.2 で説明) の各 IEX MALS 実験及び解析の実行濃度分析は (絶滅の先験的知識を必要とする UV 検出に限定しない限り、追加の空白が必要です。各ピークの係数)。にもかかわらず、さらに法の開発はまだ塩の段階的なプログラムの成功した基線の減算が必要、基線の減算と分析が線状グラデーションの堅牢です。各ピークの dn/dc 値 (文献12で計算を見つけることができます) 溶出ピーク時に特定のバッファー伝導率により調整してください。タンパク質はこの調整 200 mM (BSA の例のような) より低い、NaCl 濃度で溶出する場合は無視できます。
IEX-MALS (プロトコルの詳細なステップ 2.3) として SEC MALS に比較で使用される蛋白質の比較的大きい量は塩の勾配との不完全な混合による RI の変動によって引き起こされる RI 信号の劇的な変化を克服するために重要なグラデーションのバッファー。質量測定用 UV 検出を使用する場合にのみ少量を使用することがあります。注入するタンパク質の量は、タンパク質、均質性、純度と紫外吸光係数モル質量に依存します。必要な注入量がより小さい蛋白質の高い大きいタンパク質 (150 kDa タンパク質 20 kDa タンパク質と ~0.2 mg 〜 1 mg) に低い必要があります。異種サンプル数量はいくつかの集団に分かれて以来より多くのサンプルの注入が必要です。分析の高速液体クロマトグラフィー (HPLC) は、FPLC システムよりも少ない材料を必要があります。
最近では、精製の手順中に MALS を用いたインライン解析が報告されています。このようなリアルタイム分析は、精製時に発生する、浄化26後蛋白質のそれ以上の分析の必要性を排除することができます集計製品を検出するため非常に効率的です。IEX クロマトグラフィーは中間体精製ステップ; として頻繁に使用されます。したがって、MALS 取 IEX 柱の組み合わせは、大規模な浄化手順のリアルタイム分析としても分析評価法としてだけでなくことができます。Nonanalytical IEX 列も安定度の低い粒子を解放され、したがって、MALS で使用することができます。アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーや疎水性交換クロマトグラフィーなどの他の分離技術は、MALS 比較的純粋なサンプルを受けるとき (MALS と RI 検出器の汚染を避けるため) と組み合わせることもできます。適応が必要になります、だけでなく良好なピークの分離がまた十分にきれいな LS と RI を取得するメソッドの最適化信号 MALS 解析に成功。

タンパク質製品の定量的な特徴づけがますます品質管理 (QC) の手段として不可欠であるバイオ医薬品産業と生命科学の整合性と信頼性を保証するための規制の目的の両方の研究1,2ヨーロッパの生物物理学的研究とヨーロッパ (ARBRE MOBIEU) の分子生物物理学のための蛋白質のウェブサイトで説明されているようネットワーク蛋白質の生産と精製パートナーシップ リソースの協会およびヨーロッパ (P4EU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs、https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control、それぞれ)、タンパク質品質管理だけでなく、最終製品が、そのオリゴマーの状態、均一性、アイデンティティ、純度を特徴付ける必要があります。構造、構造、翻訳後修飾、および他のプロパティ3,4。
最も一般的な品質評価方法の 1 つは、SEC MALS です。この方法では分析の SEC カラムは MALS と吸光光度と差屈折検出器、各ピーク5タンパク質のモル質量の正確な測定を有効にすると結合されます。秒 MALS は、溶出量とは関係なく溶出ピークのモル質量を決定し、列の調整を使用して分析の SEC の不正確さを克服します。動的光散乱 (DL) モジュールの流体力学的半径決定することサイズ計測機能を追加します。学術研究、秒 MALS は通常蛋白質、その構造、純度、集約、および変更された蛋白質、糖蛋白質、脂質可溶化膜タンパク質などのレベルのレベルのオリゴマーの状態を確認する使用 (決定、タンパク質のモル質量とコンポーネントを個別に共役)6,7,8。
多くの場合、浄化プロセスの最終的なタンパク質はよくかわる分子種ではないが、むしろいくつかの不均一性を装備します。そのような混合物の蛋白質は、構造体 (たとえば、異なるオリゴマー フォーム)、立体構造、またはタンパク質アイソ フォームの面で変えることができます。タンパク質の不均一性には C 末端のリジンの処理やバリエーション9,10を充電につながるアスパラギン ・ グルタミンの脱アミノ化によって引き起こされるマイナーな化学物質の違いの結果ことができます。グリコシル化など翻訳後修飾の違いは料金変動9異種サンプルにもつながります。不均一性のこれらの種類は、蛋白質の生物物理学的特性に反映され、安定性と11ターゲット蛋白質の生物学的活性に影響を与えることができます。
このような異種のサンプルの信頼性の高い品質管理試金は、高 resolutive の分析分離技術を必要とします。良好な分離を達成するための限られた解像度と分離能力12、欠陥のある秒 MALS 解析の結果のため、分析 SEC 用カラムに挑戦できることがあります。MALS で IEX など特異性の高い分離技術を組み合わせることで、異種サンプルで秒 MALS の制限を克服し、タンパク質特性 (Amartely et al.12表 1) に対する補完的な方法を提供します。秒のサイズが13で高分子を隔てるとは異なり IEX は彼らの表面電荷14で高分子を分離します。陰イオン交換 (AIEX) と陽イオン交換 (CIEX) マトリックス バインド負は正電荷の亜種、それぞれ。比較的近い質量や形状を共有する蛋白質集団間罰金分離、IEX MALS 正常に混合サンプル12の個々 の蛋白質各州のモル質量を判断します。
ここで同じサンプルの分離に存在する BSA オリゴマー フォームの解析 IEX MALS 実験を実行するための標準プロトコルを提案する.特定のタンパク質の IEX 列の選択が重要と説明したバッファーの pH と電気伝導度の条件だけでなく。IEX MALS 実験データの解析もステップバイ ステップで説明します。BSA オリゴマーの分離は良いと SEC MALS で十分であるが、BSA は IEX MALS 機能を紹介し、実験の最適化を示す良い例です。前の研究12秒 MALS と適切な分離・分析 IEX MALS により達成貧しい分離の例として、説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#196;KTA pure</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:236px;">FPLC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.02 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1002</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1012</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 25 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-2012</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">BSA (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">miniDAWN TREOS&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREOS</td>
			<td>MALS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mono Q HR 5/50 GL</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td>Anion exchange analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optilab T-rEX</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREX</td>
			<td>Refractometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.1 mm PES 1000 mL Stericup</td>
			<td style="width:136px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCVPU11RE</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TRISMA base</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>TRIS buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization

多角度光散乱 (IEX MALS) とするイオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の分離とキャラクタリゼーションのための強力な方法です。IEX MALS により正確なモル質量分析により、非常にでもオリゴマー フォームまたは蛋白質の人口の混合物を含む異種タンパク質サンプルの評価高特異性分離技術の組み合わせ似たようなモルの固まり。したがって、IEX MALS タンパク質解析の追加レベルを提供します、多角度光散乱 (秒 MALS) を用いた標準サイズ排除クロマトグラフィーに補足であります。
ここでは、基本の IEX MALS 実験し、ウシ血清アルブミン (BSA) でこのメソッドを示すために、プロトコルをについて説明します。IEX は個別のフォームごとの MALS でモル質量分析を許可するそのオリゴマー フォームに BSA を分離します。IEX MALS 実験の最適化も表示、BSA、BSA モノマーとオリゴマーの大きい優秀な分離を達成するために実験を行った。IEX MALS 分離とサンプルに存在する複数の蛋白質種のモル質量の測定を提供するのでタンパク質の品質評価のための貴重な技術であります。

BSA22実験システムの校正のクロマトグラフィーで使用、IEX-MALS として SEC MALS の練習に最適一般的な蛋白質であります。主に理論的なモノマー質量 66.7 kDa の単量体、通常少数の二量体と高いオリゴマー23が組み込まれています。
BSA は IEX MALS の陰イオン交換分析カラムを用いた解析 (材料の表を参照してください)。広い線形グラデーション 30 から成る 75 mM から 350 mM の NaCl の履歴書より高いオリゴマーから BSA モノマーを分離します。下流の MALS 分析は、66.8 ± 0.7 kDa の計算されたモノマーのモル質量、130 ± 5 kda (図 1A) 計算されるダイマー モル質量に起因しました。
溶出ピーク バッファー伝導率に基づいて、グラデーションは、別のプログラムに変更された: 175 mM の NaCl の長いステップが続く線形グラデーション 500 mM の NaCl を 175 mM から。新しいグラデーションは、解像度と BSA モノマー (66.1 ± 0.7 kDa の計算モル質量) と (132 ± 2 kDa の計算された平均固まり) とその高いオリゴマー種の優れた分離を大幅に改善 (図 1B)。高いオリゴマー種にも注力し、BSA のそれぞれのオリゴマー形のモルの固まりを計算するには、200 mM と 250 mM の NaCl の段階的なプログラムが適用されます。この実験の結果、BSA (62.4 ± 0.4 kDa の計算質量) を持つモノマー、ダイマー (計算される質量と 130 ± 10 kda)、三量体 (170 ± 10 kDa の計算質量) での優れた分離 (図 1C)。すべて IEX MALS 実験により示す BSA が BSA モノマーが 8512純度溶出秒 MALS 結果に一致して、80% の純度を持つモノマーとして主た.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg"> 図 1: IEX MALS 実験 BSA 用の最適化。(A) IEX MALS 75-350 mM の NaCl のグラデーション プログラム BSA の実験します。(B) IEX MALS は、BSA の 175-500 mM の NaCl の線形グラデーション プログラム続く 175 mM NaCl ステップのプログラムを試してください。(C) IEX MALS は、BSA の 200 mM と 250 mM の NaCl のステップのプログラムを試してください。クロマト グラムは、280 nm (青色)、光 (赤)、90 ° の角度と屈折 (ピンク) MALS (黒) によって計算された各ピークのモル質量と導電率 (グレー) 曲線で散乱で紫外線を表示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

このプロトコルでは、蛋白質、蛋白質の複合体、および異種サンプル中のペプチドの正確なモル質量決定の多角度光散乱と特異性の高いイオン交換クロマトグラフィーの使用について説明します。このメソッドは、ネイティブのオリゴマー、電荷変形および混合蛋白質のサンプルの特性、品質評価法に関する貴重なです。

イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

このプロトコルは、生命科学研究および医薬品開発における結果の一貫性と完全性に不可欠な、タンパク質の品質管理と特性評価、品質管理のための新しい方法であるイオン交換CALを提示します。イオン交換MALSは、タンパク質の純度、オリゴマー状態、均質性、同一性、同一性、構造構造、翻訳後修飾、およびその他の特性を決定します。測定は非破壊的であり、ほぼ生理学的緩衝条件下で溶液中で行われる。この方法は、タンパク質またはペプチドのモル質量、オリゴマー状態、および結合の程度、例えば糖タンパク質を正確に決定する。膜タンパク質にも適用できる。IEXは、表面電荷によって高分子を分離します。アニオン交換、AIEX、および陽イオン交換、CIEX、マトリックスは、それぞれ負および正に帯電した変異体に結合する。比較的近い質量または形状を共有するタンパク質集団間の細かい分離により、IEX-MALSは、混合物サンプル中の個々のタンパク質状態のモル質量を決定する。まず、0.1マイクロメートルのフィルターを使用して、洗浄および溶出バッファーを含むすべての試薬をフィルター処理します。乾燥フィルターから微粒子を除去するために、最初の50〜100ミリリットルのバッファーを廃棄物ボトルにフィルターします。水を濾過して十分に洗浄し、ほこりが入るのを防ぐためにキャップされた清潔で無菌のボトルで、残りのバッファーをろ過します。pH-8 Trisバッファーと50ミリモルクロリドナトリウムを使用して、BSAサンプルを1ミリリットル当たり6ミリグラムに希釈し、pHとイオン強度がイオン交換カラムに結合できるようにします。注射器を使用して、良質のMALS分析を達成するために、少なくとも0.3〜0.5ミリグラムのBSAを1ミリリットルのカラムに注入します。イオン交換 MALS 実験を開始するには、MALS ソフトウェアで [新規] を開き、メソッドから実験を行い、光散乱システム メソッド フォルダからオンラインメソッドを選択します。DLS モジュールが使用可能で、DLS データを取得する場合は、光散乱の 「QELS を使用する」サブフォルダーからオンライン方式を選択します。パラメータを設定するには、[設定]セクションで、[汎用ポンプ]セクションの実行の流量を、FPLCで使用される流量を毎分1.5ミリリットルに設定します。[ソルベント]セクションで、バッファ パラメータを入力または確認します。インジェクタセクションの下に、BSA としてタンパク質名を入力し、屈折率増分を 1 グラムあたり 0.185 ミリリットル、波長 280 ナノメートルの UV の絶滅係数を 1 センチメートル当たり 0.66 リットルとして入力します。[サンプル] タブで、タンパク質サンプルの濃度を 1 ミリリットル当たり 6 ミリグラムと入力し、サンプル量を 170 マイクロリットルとして挿入します。[手順] セクションの [基本コレクション] タブで、[自動挿入時にトリガー] チェック ボックスをオンにし、勾配が最終的な値に達した後、データ収集が少なくとも 5 分間継続されるように、実行の継続時間を 70 ミリリットルに設定します。次に、FPLC ソフトウェアで、メソッド エディタ タブで新しい実験を作成します。最初の実験では塩またはpHの線形勾配を作成し、最適化された方法では、原稿に従ってより具体的なグラデーションまたは段階的なプログラムを作成します。MALS ソフトウェアでデータ収集をトリガーする方法にパルス信号を含めます。次いで、ポンプバルブを開き、0.5モルの水酸化ナトリウムで洗浄し、強く結合した不純物を除去し、続いて中和緩衝液洗浄を行う。次いで、TrisバッファpH 8、洗浄バッファ付きのAバルブ、溶出バッファ付きBバルブでカラムを洗浄します。低塩濃度の洗浄バッファーをカラムをすすくう最終洗浄として使用し、カラムマトリックスへのタンパク質の結合を可能にする。サンプル注入前、洗浄後、溶出終了時に、光散乱基線を安定化して低ノイズと完全に純粋な希釈を保証する必要があります。シリンジを使用して、タンパク質サンプルをループに入れる。まず、実行ボタンをクリックして MALS ソフトウェアで実験を開始し、次に FPLC ソフトウェアで実験を開始します。データは、MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後に収集されます。イオン交換 MALS がスタンドアロン方式ではなく連続フロー モードで手動で実行される場合は、前述のとおり、実行と命令のパラメータを同じに適用します。最終的な方法を検証して実行したら、サンプルではなくバッファをロードして、空白の注入を使用してまったく同じ方法を実行します。自動注入パルスとブランクランの勾配との間のタイミングが、サンプル実行のタイミングと同じである事が重要です。解析を開始するには、MALS ソフトウェアの「手順」セクションで、「脱呼吸」タブと「標準」レベルを使用してクロマトグラムを滑らかにします。ノイズが多い場合は、レベルを[ヘビー]に設定します。ベースラインビューで、LS、UV、RI検出器を含むすべての信号のベースラインを定義します。ピークビューで、解析のピークを定義します。各ピーク下のタンパク質の RI インクリメント値 dn/dc および UV の絶滅係数の正しい値を確認します。[光散乱からのモル質量と半径]ビューで、Zimm モデルと適合度 0 を使用して、モル質量と半径を解析します。QELS が使用可能な場合は、QUELS ビューから Rh の下で、相関関数の Rh 値と適合の質を観察します。塩濃度の上昇により、イオン交換MALSの実行中にRI信号が大きく変化します。ブランクインジェクションからベースラインシグナルを差し引くには、タンパク質とブランクイオン交換MALS実験の両方を開きます。タンパク質実験名を右クリックし、[適用方法]を選択して、ファイルダイアログからベースライン減算フォルダを選択します。標準モル質量分析のオンライン方法を選択します。ベースライン減算ビューで、「空白をインポート」をクリックして、空白の実行のシグナルをインポートします。[インストゥルメント]で、減算する検出器をすべてチェックします。BSA モノマーでイオン交換 MALS システムをキャリブレーションするには、手順と構成ビューでピークを調整します。正規化ビューで、正規化を実行するには Rg 値として 3.0 ナノメートルを入力します。次に、[同じ設定]タブの[帯域の広がり]でピークを選択し、[フィットを実行]ボタンを使用して、UV信号とLS信号をRI信号に一致させます。結果のグラフは、結果フィッティングビューに表示されます。グラフを右クリックし、[編集]を選択して[詳細]ボタンをクリックして、軸スケールやその他のグラフパラメータを変更します。表示オプションを追加するには、[EASI グラフ]タブを選択し、[表示]ドロップダウン メニューのウィンドウの上部で、[モル質量]、[Rh Q.All]の各結果(モル質量、半径、純度レベルなど)を選択し、[結果]セクションの下のレポート ビューで使用できます。[レポート デザイナー] ボタンを使用して、レポートに結果やパラメーターを追加します。本実験では、BSAをイオン交換用MALSで、アニオン交換分析カラムを用いて分析した。クロマトグラムは、280ナノメートルで紫外線を表示し、光散乱を90度の角度で、屈折率、および導電率曲線を各ピークのモル質量と共に表示した。75ミリモルから350ミリモルの塩化ナトリウムまでの30カラムの体積からなる広い線形勾配は、二量体および高いオリゴマーからBSAモノマーを分離した。下流のMALS分析の結果、計算された単量体モル質量は66.8キロダルトン、計算された二量モル質量は130キロダルトンであった。溶出したピークでの緩衝伝導率に基づいて、勾配を別のプログラムに変更し、175ミリモル塩化ナトリウムの長いステップ、続いて175ミリモルから500ミリモル塩化ナトリウムまでの線形勾配を行った。新しい勾配は解像度を大幅に改善し、BSAモノマーと高オリゴマー種との間に優れた分離を生み出した。200ミリモルと250ミリモルの塩化ナトリウムの段階的なプログラムは、高オリゴマー種にも焦点を当てるために適用されました。BSAモノマー、ダイマー、トリマーの間で優れた分離が得られました。この手順に従って、質量分析、SDS-PAGE活性および安定性試験などの方法を、イオン交換によって分離された各バリアントに対して実行して、それぞれを同定し、さらに特徴付けることができる。イオン交換MALSは、SEC-MALSでは完全に分析できないサンプルにMALS分析の力を拡張することを発見しました。電荷による分離は、SECで一貫性を持つ異なる種を解決します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

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Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

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膜蛋白質の構造解析および経験的モデリング中性子小角散乱実験でコントラストに一致する洗剤

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Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...