Name: ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization
Uploaded: 2019-04-05T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization at JoVE.com

Авторы благодарят доктор Tsafi Danieli (Wolfson центр применяется структурной биологии, Еврейский университет) за ее советы и сотрудничество. Авторы также поблагодарить Danyel Biotech Ltd. (Реховот, Израиль) за помощь и создание аналитической системы ПСОК-МЭЛС, используемые в данном исследовании.

<ol>
	<li>Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trip+Adviser+guide+to+the+protein+science+world:+a+proposal+to+improve+the+awareness+concerning+the+quality+of+recombinant+proteins.">The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins.</a> BMC Research Notes. 7, 585 (2014).</li><li>Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+and+optimization+of+purified+protein+samples:+why+and+how.">Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how.</a> Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).</li><li>Oliveira, C., Domingues, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+to+reach+high-quality+purified+recombinant+proteins.">Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).</li><li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products.">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+light+scattering+measurement+in+the+biological+and+biopharmaceutical+sciences.">Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences.</a> Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).</li><li>Sahin, E., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-angle+Light+Scattering+for+Elucidating+Protein+Aggregation+Mechanisms.">Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).</li><li>Ogawa, T., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+analyses+of+protein+dynamics+in+solution.">Multiple analyses of protein dynamics in solution.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).</li><li>Rebolj, K., Pahovnik, D., &#381;agar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Protein+Conjugate+Using+an+Asymmetrical-Flow+Field-Flow+Fractionation+and+a+Size-Exclusion+Chromatography+with+Multi-Detection+System.">Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System.</a> Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Monoclonal+Antibodies.">Heterogeneity of Monoclonal Antibodies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Hintersteiner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+heterogeneity:+Basic+antibody+charge+variants+with+increased+binding+to+Fc+receptors.">Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors.</a> mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).</li><li>Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+antibodies:+Modification,+methods+and+potential+effects+on+biological+functions.">Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions.</a> mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).</li><li>Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Multi+Angle+Light+Scattering+to+Ion+Exchange+chromatography+(IEX-MALS)+for+protein+characterization.">Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).</li><li>Goyon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+size+exclusion+chromatography+columns+packed+with+sub-3&#956;m+particles+for+the+analysis+of+biopharmaceutical+proteins.">Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3&#956;m particles for the analysis of biopharmaceutical proteins.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).</li><li>Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -. L., Guillarme, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography+for+the+characterization+of+biopharmaceuticals.">Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+the+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+phase+selection+for+the+high-performance+ion-exchange+chromatography+of+proteins.">Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins.</a> Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).</li><li>Lebendiker, M., Danieli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+prone-to-aggregate+proteins.">Production of prone-to-aggregate proteins.</a> FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).</li><li>Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening+methodology+for+purifying+proteins+with+aggregation+problems.">A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems.</a> Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).</li><li>Fu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+refractometry+using+field-based+light+scattering+spectroscopy.">Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy.</a> Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).</li><li>Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+Light+Scattering+Studies+on+Ribosome+Particles.">Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles.</a> Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).</li><li>Berthaud, A., Manzi, J., P&#233;rez, J., Mangenot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Detergent+Organization+around+Aquaporin-0+Using+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).</li><li>Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+analytical+method+for+evaluating+bovine+serum+albumin+concentrations+in+pharmaceutical+polymeric+formulations.">Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).</li><li>Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+arginine+on+multimodal+anion+exchange+chromatography.">Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).</li><li>Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+afifavidin+reveals+common+features+of+molecular+assemblage+in+the+bacterial+dimeric+avidins.">Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins.</a> The FEBS Journal. , (2018).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Particle+Content+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Serotype+8+Vectors+by+Ion-Exchange+Chromatography.">Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).</li><li>Patel, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-angle+light+scattering+as+a+process+analytical+technology+measuring+real-time+molecular+weight+for+downstream+process+control.">Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control.</a> mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).</li></ol>

D.S. является сотрудником корпорации Уайат технологии, продукты которых используются в настоящем Протоколе. А.т. является сотрудником Danyel Biotech, дистрибьютор Уайатт и ÄKTA документов.

IEX-МЭЛС-это мощный метод для разделения белков и характеристика, которая позволяет точное молярной массы определение чистого белков, а также гетерогенных образцы, характеризующие родной олигомеров, неродном агрегатов, ковалентных и нековалентных комплексы и сложные белки. Программа, состоящая из линейного градиента или серию шагов, концентрация соли может обеспечить хорошее разделение белков населения и позволяют надлежащего анализа каждого индивидуального пика МЭЛС. Дальнейшая оптимизация путем изменения различных параметров, таких как градиент склона (см. шаг 3.4 протокола), может быть выполнена, если лучшее разрешение не требуется. IEX-МЭЛС может быть пробирного контроля качества полноценного белка, так как он обеспечивает дополнительные, критический уровень характеристика белков, дополняет другие методы, такие как SEC-МЭЛС.
Хотя SEC-МЭЛС стандартные и традиционные техники для молярной массы определения белка, относительно низкое разрешение стандартного аналитического SEC столбцов может ограничить Точная Молярная измерений массы, достигнутый MALS12. Некоторые примеры ограничений SEC-МЭЛС решения, которые содержат последовательных олигомеров, высокий уровень агрегирования, которые полностью не отделены от мономера пик и разнородных популяций с аналогичные молярной массы, такие как изменение белки.
IEX-это более сложный метод хроматографии для проектирования и выполнения чем сек, однако информация, полученная из эксперимента IEX-МЭЛС может дополнять и иногда быть еще более информативным, чем анализ SEC-МЭЛС. IEX-МЭЛС успешно характеризуется варианты антитела, которые разделяют же молярной массы, олигомеры, которые не разделяются полностью на SEC и короткие пептиды, которые трудно анализировать SEC12,24. Кроме того макромолекулярных сборки, которые слишком велики, чтобы быть разделены SEC, таких как полный (содержащий вирусной ДНК) и пустой частицы аденоассоциированный вирус (AAV), может быть решена IEX25 до MALS анализа. По сравнению с SEC, IEX предлагает более разнообразные возможности разделения14 , и она имеет гибкость корректировки нескольких параметров, чтобы увеличить разрешение пик, например буфер рН, типы соли, типы и длины столбца, и др. В отличие от SEC, существует ограничение громкости для образца инъекций в IEX, и любой молекулы могут быть проанализированы независимо от его размера (см. таблицу 1 в Amartely et al.12). Это большое преимущество IEX-МЭЛС, главным образом для образцов с низкой интенсивностью LS, например очень маленькие белки или разбавленных белки с тенденцией для агрегирования по концентрации. Так как аналитические колонки IEX являются более стабильными и выпустить меньше частиц, чем SEC колонны, как правило, IEX-МЭЛС требует уравновешивания очень короткое время, и LS сигналы стабилизируются очень быстро. Это позволяет запуск отдельных экспериментов, как описано в настоящем Протоколе и остановка выполнения при необходимости.
В отличие от SEC, которая обычно обеспечивает прекрасные результаты с только один эксперимент (с помощью столбца с правой фракционирование диапазон), IEX может потребовать несколько экспериментов для достижения оптимального разрешения путем настройки параметров метода. В экспериментах IEX-МЭЛС выполняются с градиентом соли, буфер проводимость и, следовательно, Ри резко изменить во время выполнения, с последующими изменениями на ри сигнал. Это требует дополнительное пустое, запускать для каждого IEX-МЭЛС эксперимента и анализ с вычитание (как описано в шаге 5.2 протокола), если анализ концентрации ограничивается УФ обнаружения (требует априорного знания вымирания коэффициенты для каждого пика). Анализ с вычитание надежными для линейных градиентов, несмотря на то, что дальнейшее развитие метода все еще требуется для успешного вычитание соли ступенчатой программ. Dn/dc значения каждого пика должны корректироваться согласно конкретных буфера проводимости на eluted пик (вычисления можно найти в литературе12). Если белок этого eluted при концентрации NaCl, ниже, чем 200 мм (как в примере BSA), эта корректировка является незначительным.
Относительно большое количество белка, используемых в IEX-МЭЛС (как описано в шаге 2.3 протокола), по сравнению с SEC-МЭЛС важно преодолеть драматические изменения сигнала ри, вызванные соль градиента и Ри колебания из-за несовершенной смешивания градиент буферов. Если УФ обнаружения используется для измерения массы, только меньшие суммы может быть использован. Количество белка для вставки зависит от Молярная масса белка, однородности, чистоты и коэффициент вымирания УФ. Необходимости вводят масса должна быть выше для более малые протеины и ниже для более крупных белков (~ 1 мг за 20 кДа белками и ~0.2 мг для 150 kDa белок). Гетерогенных образцы требуют введения более образца, так как количество делится между несколькими населения. Аналитические высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может потребоваться меньше материала, чем система ПСОК.
Недавно было сообщено в линии анализ с использованием MALS во время процедуры очистки. Такой анализ в реальном времени является очень эффективным для обнаружения статистической продукции, которые возникают во время очистки и может устранить необходимость для любого дальнейшего анализа белка после очистки26. IEX хроматографии часто используется в качестве промежуточного очистки шага; Таким образом сочетание препаративные IEX столбцов с MALS может быть полезным не только как метод аналитических характеристик, но и как в реальном времени анализ крупномасштабных очистительных процедур. Nonanalytical IEX столбцы также являются стабильными, с низкой степенью выпускать частиц и, таким образом, может быть использован с МЭЛС. Другие методы разделения, например аффинной хроматографии или гидрофобные обмен хроматографии, могут также сочетаться с MALS подвергано к относительно чистой пробы (чтобы избежать загрязнения МЭЛС и Ри детекторов). Это потребует адаптации и оптимизации метода для получения не только хороший пик разделения, но также достаточно чистой LS и Ри сигналы для успешного анализа МЭЛС.

Количественная характеристика белковых продуктов все более важное значение как средство контроля качества (КК), и для целей регулирования в биофармацевтической промышленности и гарантировать надежность и целостность жизни науки исследования1 , 2. как описано на веб-сайтах белка сетей производства белка и очистки партнерство в Европе (P4EU) и объединения ресурсов для биофизических исследований в Европе и молекулярной биофизики в Европе (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs и https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, соответственно), белок КК должны характеризоваться не только чистота конечного продукта, но также его олигомерных государства, однородность, личность, конформации, структура, Посттрансляционная изменения и другие свойства3,4.
Одним из наиболее распространенных методов КК характеристика — SEC-МЭЛС. В этом методе столбец аналитической SEC сочетается МЭЛС и спектрофотометрические и рефрактометрический детекторы, включение точных измерений молярной массы белка каждого пика5. SEC-МЭЛС определяет Молярная масса eluted пиков независимо от громкости элюции и преодолевает неточность аналитических сек, с помощью столбца калибровки. Добавление динамического рассеяния света (DLS) модуля добавляет возможность измерения размера, позволяя определение гидродинамических радиус. В научных исследованиях, SEC-МЭЛС обычно используется для определения состояния олигомерных белок, ее конформации, уровень чистоты, уровень агрегирования и изменение белков, таких как гликопротеины или липидов солюбилизирован мембранных белков (определить Молярная масса белка и сопряженные компоненты отдельно)6,,78.
Во многих случаях окончательный белок процесс очистки не является хорошо ворит молекулярных видов, но скорее включает некоторые неоднородности. Белков в такой смеси могут быть разнообразны с точки зрения структуры (например, различные олигомерных формы), конформации или изоформ белка. Гетерогенность белка также может быть результатом незначительных химических различий, вызванных C-терминала лизин обработки или аспарагин/глютамина дезаминирование, ведущих к взимать вариация9,10. Различия в Посттрансляционная модификации, такие как гликозилирования может также привести к гетерогенных образцы с заряд вариации9. Эти различные типы гетерогенности отражаются в биофизические характеристики белков и может повлиять на стабильность и биологическая активность целевого белка11.
Надежный контроль качества анализов образцов таких разнородных требуют весьма резолютивной аналитическое разделение техника. Бывают случаи, когда хорошее разделение может быть оспорено достичь с Аналитические колонки SEC, ввиду их ограниченной резолюции и разделения способности12, привело недостатки SEC-МЭЛС анализа. Сочетание высокой специфика разделения техника например IEX с MALS может преодолеть ограничение SEC-МЭЛС в гетерогенных образцов и обеспечивают дополнительный метод для белка характеристика (таблица 1 в Amartely et al.12). В отличие от SEC, который отделяет макромолекул, их гидродинамические размер13, IEX отделяет макромолекул, их поверхности бесплатно14. Анион обмен (AIEX) и катионного обмена (CIEX) матриц bind негативно и позитивно взимается варианты, соответственно. С тонкой разделения между населением белков, которые имеют относительно близко массы или форму IEX-МЭЛС успешно определяет Молярная масса каждого государства индивидуальных белков в смеси образца12.
Здесь мы представляем стандартный протокол для запуска эксперимента IEX-МЭЛС для разделения и анализа BSA олигомерных форм, которые существуют в той же пробы. Выбор IEX колонку для определенного белка является важным и обсуждены, а также pH и проводимости условия буферов. Анализ экспериментальных данных IEX-МЭЛС также описаны шаг за шагом. Хотя разделение BSA олигомеров, хороший и достаточно в SEC-МЭЛС, BSA является хорошим примером показать возможности IEX-МЭЛС и продемонстрировать оптимизацию эксперимента. В предыдущем исследовании12рассматриваются примеры достигнутых SEC-МЭЛС и надлежащего разделения и анализа, активизируемые IEX-МЭЛС бедных разделения.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:749px;" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#196;KTA pure</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-26</td>
			<td style="width:236px;">FPLC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.02 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1002</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 10 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-1012</td>
			<td>Sample Filter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">0.1 &#181;m Anotop Whatman Filter 25 mm</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">6809-2012</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">BSA (purity &#62;97%)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A1900</td>
			<td>Bovine serum albumin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">miniDAWN TREOS&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREOS</td>
			<td>MALS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mono Q HR 5/50 GL</td>
			<td style="width:136px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5166-01</td>
			<td>Anion exchange analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optilab T-rEX</td>
			<td style="width:136px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:119px;">WTREX</td>
			<td>Refractometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.1 mm PES 1000 mL Stericup</td>
			<td style="width:136px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCVPU11RE</td>
			<td>Mobile phase filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">71382</td>
			<td>HPLC grade NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TRISMA base</td>
			<td style="width:136px;">Sigma&#160;</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>TRIS buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ion exchange chromatography (iex) coupled to multi-angle light scattering (mals) for protein separation and characterization

Ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света (IEX-МЭЛС) является мощный метод для разделения белков и характеристика. Сочетание высокой специфика разделения методики, которую IEX с точной молярной массы анализа, достигается MALS позволяет характеристика гетерогенных белков образцов, включая смеси олигомерных форм или белка населения, даже с очень Подобные молярной массы. Таким образом IEX-МЭЛС обеспечивает дополнительный уровень белка характеристика и дополняет стандартный размер-гель-проникающей хроматографии с мульти-угол рассеяния света (SEC-МЭЛС) техники.
Здесь мы описываем протокол для основных IEX-МЭЛС экспериментировать и продемонстрировать этот метод на бычьим сывороточным альбумином (БСА). IEX отделяет BSA его олигомерных форм, позволяя молярной массы анализ MALS каждой формы. Оптимизации эксперимента IEX-МЭЛС также представил и продемонстрировал на ЗБТ, достижения отличное разделение между BSA мономеров и больших олигомеров. IEX-МЭЛС является полезен для оценки качества белка, так как он обеспечивает тонкой сепарации и молярной массы определение нескольких видов белков, которые существуют в образце.

BSA является общий белок, который используется для калибровки экспериментальной системы22 в хроматографии и отлично подходит для практикующих IEX-МЭЛС, а также SEC-МЭЛС. Это главным образом мономерных массой теоретической мономера 66,7 кДа и обычно включает в себя небольшое количество димеры и выше олигомеров23.
BSA была проанализирована на IEX-МЭЛС, используя столбец аналитический обмен анион (см. Таблицу материалы). Широкий линейного градиента, состоящий из 30 CV от 75 мм до 350 мм NaCl отделены BSA мономеров из высших олигомеров. Вниз по течению MALS анализ привел в вычисляемых мономера Молярная масса 66,8 ± 0,7 кДа и вычисляемые димер Молярная масса 130 ± 5 кДа (рис. 1А).
Основываясь на буфер проводимости на вершины eluted, градиент был изменен на другой программы: длинный шаг 175 мм NaCl следуют линейный градиент от 175 мм до 500 мм NaCl. Новый градиент значительно улучшилась резолюции и отличное разделение BSA мономера (с вычисляемого Молярная масса 66.1 ± 0,7 кДа) и его высших олигомерных видов (с расчетная средняя масса 132 ± 2 кДа) (рис. 1Б). Чтобы также сосредоточить внимание на высокой олигомерных видов и расчет молярной массы каждой олигомерных формы БСА, поэтапная программа 200 мм и 250 мм NaCl был применен. Этот эксперимент результате отличное разделение между мономера (с расчетная масса 62,4 ± 0,4 кДа) BSA, димер (с расчетная масса 130 ± 10 кДа) и тример (с расчетная масса 170 ± 10 кДа) (рис. 1C). Все IEX-МЭЛС эксперименты показывают, что BSA elutes главным образом в качестве мономера с чистотой 80%, по согласованию с SEC-МЭЛС результаты, где BSA мономеров элюировать с чистотой 85%12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59408/59408fig1.jpg"> Рисунок 1 : Оптимизация IEX-МЭЛС эксперимента для BSA. (A) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с помощью градиента программы 75 – 350 мм NaCl. (B) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с программой 175 мм NaCl шаг последовал линейного градиента программа 175 – 500 мм NaCl. (C) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с программой шагом 200 мм и 250 мм NaCl. Хроматограммы отображения UV на 280 Нм (синий), свет, рассеяние на угол 90° (красный) и преломления (розовый) и проводимости (серый) кривых вместе с Молярная масса каждого пика, вычисляемая МЭЛС (черный). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59408/59408fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization at JoVE.com

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Этот протокол описывает использование высокой специфичности ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света для точного определения молярной массы белков, белковых комплексов и пептидов в гетерогенной пробе. Этот метод является ценным для оценки качества, а также как характеристика родной олигомеров, заряд вариантов и образцы смешанные протеина.

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Этот протокол представляет ионно-обмен MALs, новый метод контроля качества белка и характеристики, контроль качества, который имеет важное значение для согласованности и целостности результатов в исследованиях науки о жизни и разработки фармацевтических продуктов. Ионно-обмен MALS определяет чистоту белка, олигомерное состояние, однородность, идентичность, конформацию, структуру, пост-перевод изменений и другие свойства. Измерения неразрушаются и проводятся в растворе в почти физиологических буферных условиях.Этот метод точно определяет молярную массу белков или пептидов, олигомерное состояние и степень спряжения, например, гликопротеинов. Он также может быть применен к мембранным белкам. IEX отделяет макромолекулы по их поверхности заряда.Обмен анионом, AIEX и катионная биржа, CIEX, матрицы связывают отрицательно и положительно заряженные варианты соответственно. При тонком разделении белковых популяций, которые имеют относительно тесную массу или форму, IEX-MALS успешно определяет молярную массу каждого отдельного состояния белка в образце смеси. Для начала используйте 0,1-микрометровый фильтр для фильтрации всех реагентов, включая буферы для стирки и элауции.Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов для того, чтобы устранить частицы из сухих фильтров. В чистой, стерильной бутылке, которая была тщательно промыта фильтрованной водой и ограничена, чтобы предотвратить проникновение пыли, фильтруем оставшуюся часть буфера. С буфером pH-eight Tris и 50-миллимолярным хлоридом натрия разбавляйте образец BSA до шести миллиграммов на миллилитр, поэтому рН и ионная прочность позволят связываться с ионно-обменной колонкой.Используйте шприц, чтобы ввести по крайней мере от 0,3 до 0,5 миллиграммов BSA в одноми миллилитровую колонку для достижения хорошего качества malS анализа. Для начала эксперимента по обмену ионом MALS откройте New, Experiment from Method в программном обеспечении MALS, а также выберите онлайн-метод из папки методов Light Scattering System. Если модуль DLS доступен и данные DLS должны быть приобретены, выберите онлайн-метод из рассеяния света, с субфолдером QELS.Для настройки параметров в разделе Конфигурация сначала установите скорость потока бега в разделе Generic Pump на скорость потока, используемую в FPLC, как 1,5 миллилитров в минуту. В разделе Solvent введите или пройдите проверку параметров буфера. В разделе Инжектор введите название белка как BSA, рефракционный индекс увеличивается на 0,185 миллилитров на грамм, а коэффициент уф-вымирания на длине волны 280 нанометров составляет 0,66 литра на грамм сантиметра.Во вкладке Пример введите концентрацию образца белка в шесть миллиграммов на миллилитр, а затем вставьте объем образца для инъекций в качестве 170 микролитров. В разделе Процедуры во вкладке «Основная коллекция» выберите триггер флажка на Auto-Inject и установите продолжительность запуска до 70 миллилитров, чтобы сбор данных продолжался в течение по крайней мере пяти минут после того, как градиент достиг своего конечного значения. Затем, в программном обеспечении FPLC, создайте новый эксперимент во вкладке Редактор метода.Для первоначального эксперимента создайте линейный градиент соли или рН, в то время как для оптимизированного метода создайте более специфический градиент или пошаговую программу согласно рукописи. Включите импульсный сигнал в метод, который вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS. Затем откройте насосный клапан и промойте 0,5-молярным гидроксидом натрия, чтобы удалить сильно связанные примеси, а затем нейтрализовать буферную стирку.Затем вымойте столбец буфером Tris pH eight, клапаном A с буфером для мытья и клапаном B с буфером elution. Используйте буфер для мытья с низкой концентрацией соли в качестве окончательной стирки для полоскания колонны, чтобы обеспечить привязку белка к матрице колонки. Перед инъекцией образца, после мытья, и в конце элюции, светоизбрасывающий базовый уровень должен быть стабилизирован, чтобы обеспечить низкий уровень шума и полностью чистое разбавление.Используя шприц, поместите образец белка в петлю. Начните эксперимент сначала в программном обеспечении MALS, нажав на кнопку Run, а затем в программном обеспечении FPLC. Данные будут собираться после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS.Если ионно-обмены MALS выполняются вручную в режиме непрерывного потока вместо автономного метода, примените те же параметры запуска и инструкции, что и ранее описанные. После проверки и запуска окончательного метода выполните точно такой же метод, используя пустую инъекцию, загрузив буфер вместо образца. Важно, чтобы время между импульсом автоматического впрыска и градиентом пустого запуска было идентично времени запуска образца.Для начала анализа, в разделе Процедуры в программном обеспечении MALS, используйте вкладку Despiking и нормальный уровень, чтобы сгладить хроматограммы. Если они проявляют много шума, установить уровень тяжелых. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов, включая детекторы LS, UV и RI.В представлении Пики определите пики для анализа. Прояви правильные значения прироста RI dn/dc и коэффициента уф-вымирания для белка под каждым пиком. Под моларной массой и радиусом от света рассеяния зрения, анализировать молярной массы и радиуса с помощью модели Зимм и подходят степени нуля.Если имеется в наличии еЛС, под видом Rh с точки зрения КУЕЛС, соблюдайте значения Rh и качество соответствия функции корреляции. Сигнал RI значительно меняется во время ионно-обменного MALS запуска из-за увеличения концентрации соли. Чтобы вычесть базовый сигнал из пустой инъекции, откройте как белок, так и пустой ионный обмен MALS экспериментов.Нажмите правой кнопкой мыши на название белкового эксперимента, выберите метод применения и выберите папку «Базовое вычитание» из диалога файлов. Выберите онлайн-метод для стандартного анализа молярной массы. В соответствии с базовым представлением вычитания нажмите Import Blank, чтобы импортировать сигналы пустого запуска.В соответствии с инструментами, проверить все детекторы вычесть. Для калибровки ионно-обменной системы MALS с мономером BSA, под процедурами и представлением конфигурации, выравнивайте пики. В представлении о нормализации введите 3,0 нанометров в качестве значения Rg для выполнения нормализации.Затем, под band Broadening в той же вкладке Конфигурация, выберите пик и используйте кнопку Perform Fit, чтобы соответствовать УФ-сигналам и сигналам LS к сигналу RI. График результатов отображается в представлении Results Fitting. Измените весы оси и другие параметры графика, нажав правой кнопкой на графике, выбрав Редактировать, а затем нажав на кнопку Advanced.Чтобы иметь больше вариантов отображения, выберите вкладку EASI Graph, а в верхней части окна в меню высадки дисплея выберите Molar Mass или Rh.Все результаты, включая молярную массу, радиус, уровень чистоты и другие доступны в представлении Отчета в разделе Результаты. Используйте кнопку «Дизайнер отчетов», чтобы добавить в отчет больше результатов или параметров, а также цифры. В этом эксперименте BSA была проанализирована на ионно-обмене MALS с помощью аналитической колонки обмена анионом.Хроматограммы отображали УФ на 280 нанометров, рассеяние света под углом 90 градусов, рефракционный индекс и кривые проводимости вместе с молярной массой каждого пика. Широкий линейный градиент, состоящий из 30 объемов столбца от 75-миллимоляра до 350-миллимолярского хлорида натрия, отделил мономеры BSA от димеров и высших олигомеров. Анализ MALS ниже по течению привел к расчетной мономерной молярной массе 66,8 килодалтонов и рассчитанной более тусклой молярной массе 130 килодальтонов.Основываясь на проводимости буфера на элективных пиках, градиент был изменен на другую программу, длинный шаг 175-миллимолярского хлорида натрия, за которым последовал линейный градиент от 175-миллимолярского до 500-миллимолярского хлорида натрия. Новый градиент значительно улучшил разрешение и произвел отличное разделение между мономером BSA и высшими олигомерными видами. Пошаговая программа 200-миллимолярского и 250-миллимолярского хлорида натрия была применена, чтобы сосредоточиться также на высоких олигомерных видах.Это привело к отличному разделению между мономером BSA, димером и тримером. Следуя этой процедуре, такие методы, как масс-спектрометрия, SDS-PAGE деятельности и стабильности тесты могут быть выполнены на каждом варианте разделены ионный обмен для выявления и дальнейшей характеристики каждого из них. Мы обнаружили, что ионный обмен MALS расширяет полномочия malS-анализа на образцы, которые не могут быть полностью проанализированы SEC-MALS.Разделение по обвинению решить различные виды, которые coelute в SEC.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Интернет эксклюзионной и ионообменной хроматографии на МУРР пучкового

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Контраст соответствия моющего средства в малых угол нейтронного рассеяния экспериментов мембраной протеина структурного анализа и моделирования Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...