Name: performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00
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Le Dr Anthony S. Stender tient à remercier l’Institut Nanoscale et Quantum phénomènes Institute (NQPI) de l’Université de l’Ohio. Cet article a été rendu possible grâce au financement de démarrage fourni à Dr Stender par l’Université de l’Ohio.

1. préparation des échantillons avec des lames de microscopie en verre standard
<ol><li>Préparez des lames de microscope en verre pour le dépôt d’échantillons. Remarque: dans certaines circonstances, il peut être plus approprié de stocker le verre dans de l’eau ultrapure au lieu de l’éthanol. Cependant, le stockage dans l’eau ou l’air rend le verre hydrophobe au fil du temps.<ol>
<li>Pour de meilleurs résultats, achetez des lames de microscope de verre ou de quartz et le verre de couverture.</li>...

<ol>
	<li>Pluta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+7:+Differential+Interference+Contrast+in.">Ch 7: Differential Interference Contrast in.</a> Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).</li><li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response.">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li><li>Stender, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Optical+Imaging+and+Spectroscopy.">Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).</li><li>Mehta, S. B., Sheppard, C. J. 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E., Wang, G., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Polarization+Setting+on+Gold+Nanorod+Signal+at+Nonplasmonic+Wavelengths+Under+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).</li><li>Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+Rotational+Motions+of+Nano-objects+in+Engineered+Environments+and+Live+Cells+with+Gold+Nanorods+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).</li><li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Properties+of+Metal+Nanoparticles:+The+Influence+of+Size,+Shape,+and+Dielectric+Environment.">The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li><li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+That's+Gold+Does+Glitter.">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li><li>Maier, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2:+Light+and+Color.">Ch 2: Light and Color.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).</li><li>Wayne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3:+The+Dependence+of+Image+Formation+on+the+Nature+of+Light.">Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light.</a> Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).</li><li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries.">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li><li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles:+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance.">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li><li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li><li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries.">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li></ol>

Lors de l’imagerie avec la microscopie DIC, il est essentiel d’optimiser les composants optiques avant de collecter des données. Même des ajustements mineurs au polariseur au milieu d’une expérience peuvent entraîner des impacts significatifs sur les données finales6. En outre, différents matériaux nécessitent différents paramètres de polariseur. Bien que de grandes tailles de pas ont été utilisées ici pour démontrer l’effet de l’angle de polarisation, dans une expérience ...

Depuis les années 1980, la microscopie de contraste de brouillage différentiel (DIC) a été largement considérée comme une méthode d’imagerie importante réservée aux objets à microéchelle dans les sciences biologiques. Cependant, au cours de son développement dans les années 1950 et 1960, il a été conçu comme une technique pour la science des matériaux1. Avec les récentes avancées dans les sciences matérielles liées aux nanoparticules plasmoniques, un intérêt accru dans la caractérisation des matériaux avec la microscopie optique a eu lieu.
De nombreuses techniques optiques sont certainement disponibles pour la caractérisation des nanomatériaux (par exemple, champ sombre, champ clair, lumière polarisée, fluorescence, etc.). Champ sombre est largement populaire dans la recherche de nanoparticles, mais il repose uniquement sur la collecte de dispersion et fournit des informations limitées sur les échantillons complexes2. La fluorescence peut être utile, mais seulement avec des échantillons qui luminesce ou qui peuvent être correctement colorés. La microscopie DIC a plusieurs traits qui en font un outil précieux pour l’analyse des nanoparticules. Les avantages les plus fréquemment énoncés de DIC par rapport à d’autres méthodes et en ce qui concerne les nanoparticules plasmiques sont: aucune coloration d’échantillon requise, aucun effet de Halo, profondeur de champ peu profonde, et haute résolution latérale3. DIC a des atouts supplémentaires qui sont précieux pour la recherche de nanoparticles plasmoniques. Tout d’abord, deux champs de polarisation inhérente et orthogonale sont présents, et ils peuvent être mesurés simultanément à des fins de spectroscopie2. Deuxièmement, le signal dépolarisé des nanoparticules n’est pas capturé dans l’image finale2, ce qui peut être une cause sérieuse de préoccupation dans les mesures de spectroscopie de champ sombre.
Le but de cet article est de fournir une méthodologie claire pour l’utilisation de la microscopie à lumière transmise Nomarski DIC pour effectuer la spectroscopie sur les nanoparticules plasmoniques. Bien que DIC soit une technique puissante qui peut être appliquée à des matériaux très variés, c’est aussi une technique qui nécessite une grande habileté et la compréhension pour l’utiliser correctement lors de l’imagerie des nanoparticules. La microscopie de Nomarski DIC basée sur la transmission a une trajectoire lumineuse complexe1 qui ne sera que brièvement examinée ici. Le train optique de DIC est affiché dans la figure 1. La lumière est transmise par le microscope en passant d’abord par un polariseur et un prisme de Nomarski de fractionnement de faisceau avant d’être concentré par le condenseur sur le plan d’échantillonnage. Après avoir traversé l’objectif, la lumière rencontre un prisme de Nomarski combinant faisceau et un analyseur avant de sortir au détecteur. Les deux polariseurs et prismes de Nomarski sont essentiels à la formation de l’image DIC et sont responsables de la production de deux champs de polarisation orthogonale de DIC1. Pour le lecteur intéressé à en savoir plus sur les principes de travail et le chemin optique des microscopes DIC Nomarski, ou les différences entre Nomarski DIC et d’autres styles de DIC, s’il vous plaît se référer à d’autres comptes bien écrits sur ces sujets1, le 4 , 5 la plupart des , le 6 , le 7.
Il est également important de comprendre la nature de base des nanoparticules plasmiques avant d’essayer d’effectuer la spectroscopie sur eux, que ce soit avec Nomarski DIC, champ sombre, ou toute autre technique de microscopie. Dans le domaine des Plasmonics, les nanoparticules sont définies comme des particules avec des dimensions sur l’échellede 10-100 nm8,9. Les nanoparticules peuvent prendre de nombreuses formes (p. ex. sphères, tiges, étoiles, haltères, etc.), et la plupart de leurs propriétés importantes proviennent d’interactions avec la lumière dans la gamme ultraviolette visible-proche infrarouge du spectre électromagnétique. Le terme «plasmonique» n’est pas limité aux nanoparticules10; Cependant, lors de la discussion des nanoparticules, il est utilisé en référence à la résonance localisée de Plasmon de surface (LSPR). LSPR est un phénomène dans lequel les électrons de conduction dans une nanoparticules oscillent en raison d’une interaction coulombique avec le rayonnement électromagnétique d’une bande de fréquences très spécifique et relativement étroite8. À ces mêmes fréquences, les nanoparticules plasmoniques présentent une absorption et une dispersion accrues de la lumière, ce qui les rend observables avec la microscopie optique. Dans de nombreux cas, il est préférable d’observer les nanoparticules tout en plaçant les filtres passe-bande avant le condenseur2, pour améliorer le contraste d’imagerie et d’éliminer la lumière qui ne parvient pas à induire l’effet LSPr. L’utilisation de filtres permet également d’effectuer des expériences de spectroscopie à particules uniques.
Le comportement optique lié à LSPR dépend fortement de la taille et de la forme des nanoparticules, et il peut être étudié avec de nombreuses techniques de microscopie optique. Cependant, afin de déchiffrer les informations d’orientation des nanoparticules plasmoniques avec une forme anisotrope (c.-à-d. non sphérique), il est nécessaire d’utiliser la polarisation du champ lumineux. En tournant soigneusement le champ de polarisation ou le substrat de l’échantillon à petits incréments, il est possible de surveiller les propriétés spectroscopiques dépendantes de l’orientation des nanoparticules individuelles. La rotation et la polarisation peuvent également aider à déterminer si une caractéristique spectrale est due à une oscillation dipolaire ou supérieure des électrons de surface de la nanoparticle. Toutefois, dans le cas des nanoparticules isotropes (c.-à-d. sphériques), le profil spectral reste essentiellement inchangé lors de la rotation de l’échantillon sous lumière polarisée.
Lorsqu’ils sont vus à l’aide d’un microscope DIC (figure 2), les nanoparticules ont un disque aéré avec un aspect blanc et noir coulé dans l’ombre contre un fond gris. Les nanoparticules sphériques conserveront cette apparence sous rotation et avec le changement des filtres passe-bande; Cependant, les particules disparaîtront graduellement de la vue car la longueur d’onde centrale du filtre se sépare de la seule longueur d’onde dipolaire de la sphère11. L’apparition de nanotiges peut changer tout à fait radicalement car ils sont pivotés2. Les nanorods ont deux bandes LSPR avec un comportement dipolaire, dont l’emplacement est basé sur les dimensions physiques des nanorods. Lorsque l’axe longitudinal d’un nanotige est orienté parallèlement à l’un des champs de polarisation dic, le disque aéré apparaîtra tout blanc ou tout noir s’il est vu avec un filtre passe-bande associé à cette longueur d’onde LSPr. Après la rotation de l’échantillon 90 °, il prendra sur la couleur opposée. Alternativement, puisque l’axe transversal d’un nanotige est perpendiculaire à l’axe longitudinal, la tige prendra sur la couleur opposée lors de la commutation entre les filtres qui correspondent aux longueurs d’onde LSPr pour les deux axes. Dans d’autres orientations et paramètres de filtrage, les nanotiges apparaîtront plus comme des sphères, présentant une variété de motifs de disques aérés en fonte d’ombres. Pour les nanotiges avec un axe transversal < 25 nm, il peut être difficile de détecter le signal à la longueur d’onde de cette LSPr à l’aide de la microscopie dic.
Pour effectuer une spectroscopie à une seule particule, il est important d’utiliser les composants optiques corrects et de les aligner correctement. Un objectif capable de microscopie DIC doit être utilisé. Pour les expériences à particules uniques, les objectifs d’huile 80x ou 100X sont idéaux. Les prismes de Nomarski DIC viennent ordinairement en trois variétés: standard, contraste élevé et haute résolution. Le type idéal dépend fortement du but de l’expérience et de la taille des nanoparticules. Prismes standard sont très bien pour de nombreuses expériences; mais lorsque l’on travaille avec des nanoparticules plus petites (< 50 nm), les prismes à contraste élevé peuvent être bénéfiques, car le contraste des particules diminue à mesure que les particules diminuent en taille11. Le réglage du contraste DIC est réalisé soit en tournant un polariseur, soit en traduisant l’un des prismes DIC, selon la marque du microscope ou le modèle6.
Après avoir réglage de l’éclairage Kohler et des paramètres de polariseur, il est essentiel de ne pas réajuster ces paramètres lors de la collecte des données de spectroscopie. En outre, un signal d’arrière-plan moyen constant doit être maintenu à tout moment pendant la collecte des données, même en cas de commutation entre les filtres et les réglages d’angle. La valeur de fond idéale réelle dépend de la plage dynamique de la caméra scientifique, mais en général, l’arrière-plan doit être dans la plage de 15% – 40% du niveau de détection maximum de la caméra. Cela réduit la probabilité de saturer le capteur de la caméra tout en permettant un contraste optimal des particules. Pour collecter des données de spectroscopie, il est nécessaire de travailler avec une caméra scientifique qui capture des images en noir et blanc, par opposition à une caméra couleur.
La préparation des échantillons est un autre aspect critique de l’imagerie des nanoparticules plasmoniques. Il est impératif que les opérateurs de microscopie DIC comprennent les propriétés optiques de l’échantillon et le substrat de l’échantillon. Le verre de microscope «pré-nettoyé» n’est pas suffisamment préparé pour l’imagerie des nanoparticules, et il doit être correctement nettoyé avant le dépôt de l’échantillon pour assurer une observation dégagée de l’échantillon. De nombreux protocoles de nettoyage pour les diapositives de microscope ont déjà été documentés12, mais ce n’est pas une étape qui est normalement rapportée dans les études expérimentales.
Enfin, les méthodes d’analyse des données sont le composant final de la spectroscopie à particules uniques. Les intensités maximales et minimales pour chaque nanoparticules doivent être mesurées, ainsi que la moyenne de fond locale. Les particules d’intérêt doivent être situées dans des zones sans débris de fond, défauts de substrat ou éclairage irrégulier. Une méthode pour déterminer le profil spectral d’une nanopartine consiste à calculer le contraste des particules à chaque longueur d’onde, en utilisant l’équation ci-dessous11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativement, le spectre d’une seule particule peut être divisé en ses composantes de signal maximales et minimales individuelles, qui représentent les deux champs de polarisation de la DIC, affichant ainsi les deux spectres dépendant de directionnellement collectés simultanément, à travers les deux équations:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1117px;" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Contrad 70</td>
			<td style="width:228px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:157px;">1002</td>
			<td style="width:439px;">For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ethanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A962-4</td>
			<td>For cleaning and storing microscope glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope cover slips</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">26007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:228px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:157px;">DIAM-SPR-25-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanospheres (80 nm)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">742023-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ImageJ</td>
			<td style="width:228px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Free Software availabe for data analysis from NIJ</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:293px;">Nail polish</td>
			<td style="width:228px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:157px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nikon Ti-E microscope</td>
			<td style="width:228px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:228px;">Airgas</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:228px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:157px;">77054098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Scribing pen</td>
			<td style="width:228px;">Amazon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>18 megaohm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy

La microscopie de contraste d’interférence différentiel (DIC) est un outil d’imagerie puissant qui est le plus couramment employé pour l’imagerie des objets Microscale utilisant la lumière de gamme visible. Le but de ce protocole est de détailler une méthode éprouvée pour la préparation des échantillons de nanoparticules plasmiques et la réalisation d’une spectroscopie à une seule particule sur eux avec la microscopie DIC. Plusieurs étapes importantes doivent être suivies avec précaution afin d’effectuer des expériences de spectroscopie reproductibles. Premièrement, les repères peuvent être gravés dans le substrat de l’échantillon, ce qui aide à localiser la surface de l’échantillon et à suivre la région d’intérêt pendant les expériences. Ensuite, le substrat doit être correctement nettoyé des débris et des contaminants qui peuvent autrement entraver ou obscurcir l’examen de l’échantillon. Une fois qu’un échantillon est correctement préparé, le chemin optique du microscope doit être aligné, à l’aide de l’illumination Kohler. Avec un microscope DIC de type Nomarski standard, la rotation de l’échantillon peut être nécessaire, en particulier lorsque les nanoparticules plasmoniques présentent des propriétés optiques dépendantes de l’orientation. Étant donné que la microscopie DIC comporte deux champs de polarisation orthogonale inhérents, le motif de contraste DIC dépendant de la longueur d’onde révèle l’orientation des nanoparticules plasmiques en forme de tige. Enfin, l’acquisition de données et les analyses de données doivent être effectuées avec soin. Il est courant de représenter les données de spectroscopie DIC comme une valeur de contraste, mais il est également possible de les présenter comme des données d’intensité. Dans cette démonstration de DIC pour la spectroscopie à une seule particule, l’accent est mis sur les nanoparticules d’or sphériques et en forme de tige.

Lorsque vous travaillez avec des échantillons qui sont assez grands pour être vus à l’oeil nu, placer des repères sur le substrat de verre n’est pas normalement nécessaire. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des nanomatériaux ou lorsque la rotation de l’échantillon est nécessaire, les repères peuvent fournir une méthode facile pour localiser, distinguer et suivre l’orientation de l’échantillon. Bien que des techniques plus sophistiquées puissent être utilisées...

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Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Le but de ce protocole est de détailler une approche éprouvée pour la préparation d’échantillons de nanoparticules plasmiques et pour la réalisation d’une spectroscopie à une seule particule sur celles-ci avec la microscopie de contraste interférentiel différentiel (DIC).

Spectroscopie d’exécution de nanoparticules plasmoniques avec microscopie de contraste de type Nomarski à base de transmission

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

La microscopie DIC est supérieure au champ sombre lors de l’imagerie des nanoparticules plasmoniques dans des environnements complexes. Toutefois, DIC exige également plus de connaissances et de compétences pour obtenir des résultats reproductibles. La microscopie DIC fournit à la fois une résolution latérale élevée et une faible profondeur de champ.Ces deux caractères sont extrêmement importants lors de la surveillance des nanoparticules dans les cellules ou dans des environnements complexes. Pour commencer, utilisez un stylo à inscription pour placer une marque de rayures peu profonde et courte sur le centre de chaque couvercle en verre, puis nettoyez le verre tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, utilisez une micropipette pour enlever 100 microlitres d’une solution nanoparticule d’or de 05 milligrammes par millilitre de son récipient de stockage d’origine, et éjecter la solution dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre.Centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à 6000 fois la gravité. Une fois terminé, retirer le supernatant avec une micropipette pour se débarrasser de l’excès de surfactant de la solution nanoparticule. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’eau ultra-pure au tube de centrifugeuse.Vortex brièvement l’échantillon pour briser la pastille, puis soniquer pendant 20 minutes immédiatement après pour résusquer complètement les agrégats de nanoparticules. À l’aide d’une micropipette, dropcast six microlitres de solution nanoparticule sur le coverslip en verre nettoyé et rayé. Ensuite, retournez soigneusement le coverslip et placez-le sur un deuxième plus grand morceau de verre microscope.La goutte doit rapidement s’étaler uniformément entre les deux morceaux de verre. Prenez soin d’éviter d’avoir des bulles d’air coincées entre les deux morceaux de verre. Utilisez une ligne étroite de vernis à ongles pour sceller les bords du coverslip pour empêcher l’évaporation du liquide.Placez l’échantillon au stade du microscope et alignez l’objectif et le condenseur du microscope. Ajustez la mise au point pour trouver le plan focal avec l’échantillon dessus et localisez la marque de rayures créée plus tôt. Concentrez-vous dessus et peaufinez la mise au point jusqu’à ce que les nanoparticules entrent en vue.Pour déterminer le placement précis du condenseur, utilisez la méthode d’éclairage Kohler en commençant par l’objectif 20x, puis en passant à des grossissements élevés tels que 80 ou 100x. Ensuite, sélectionnez une région d’intérêt dans l’échantillon pour l’imagerie. Centrez la région dans le champ de vision de la caméra et ajustez la mise au point au besoin.Si le microscope a la conception de Senarmont, commencez par le polariseur placé près de l’extinction maximale de fond et tournez graduellement le polariseur vers l’extinction décroissante de fond. L’intensité de fond augmentera graduellement. Le réglage idéal est atteint lorsque les nanoparticules atteignent leur plus grande différence d’intensité par rapport à la moyenne locale de fond.Pour les nanoparticules plasmoniques, le plus grand contraste est généralement atteint avec un fond relativement sombre à ou près de l’extinction maximale du fond. Éteignez l’éclairage de la pièce pour empêcher l’éclairage parasite d’interagir avec le processus. Mettre en place un filtre à bande-pass de 10 nanomètres pleine largeur avec sa longueur d’onde centrale co-localisée avec la longueur d’onde principale localisée de résonance de plasmon de surface afin de visualiser la région d’intérêt.Ensuite, ajustez l’intensité de la lampe ou le temps d’exposition jusqu’à ce que le niveau de fond soit de 5 % à 40 % du niveau de capacité maximale de la caméra. Aucun objet de la région d’intérêt ne doit présenter d’intensités de signal qui dépassent 90 % du niveau d’intensité maximale de la caméra. Imagez l’échantillon avec une série de filtres à bande qui ont chacun une largeur totale à un demi-maximum de 10 nanomètres, et qui, dans l’ensemble, permettent l’imagerie sur l’ensemble de la plage d’intérêt de longueur d’onde.Assurez-vous que l’intensité de fond dans les images reste à moins de 5 % l’une de l’autre en ajustant le temps d’exposition et non la puissance de la lampe. Après avoir changé de filtre, recentrer l’échantillon avant de capturer des images. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIFF non compressés et/ou dans le format de fichier natif du logiciel afin de préserver toutes les informations pertinentes.Pour commencer l’analyse, ouvrez l’image avec ImageJ. Utilisez l’outil rectangle pour dessiner un rectangle autour de la principale région d’intérêt. Ensuite, sur la barre d’outils, sélectionnez l’image, allez zoomer et sélectionnez à la sélection.La fenêtre d’imagerie zoome sur la zone sélectionnée. Ensuite, sélectionnez l’image, allez ajuster et sélectionnez luminosité/contraste. Pour améliorer la vue de la région de l’échantillon, ajustez le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste de l’image.Ces ajustements ne modifient pas les données scientifiques, ils permettent simplement une meilleure visibilité de la région échantillonnée. Maintenant, utilisez à nouveau l’outil rectangle et dessinez une boîte autour de la première nanoparticule à mesurer. La boîte ne doit être que légèrement plus grande que le disque aérosé de la nanoparticule.Une fois sélectionné, allez analyser et sélectionnez la mesure. Une nouvelle fenêtre apparaît qui signale les intensités minimales, maximales et moyennes pour les pixels situés à l’intérieur de la boîte sélectionnée. En conservant la taille d’origine de la boîte, faites glisser la boîte dans une zone adjacente immédiatement à la particule où le contraste de fond est relativement faible et où aucune particule ou contaminant n’est présent.Utilisez à nouveau l’outil de mesure pour déterminer l’intensité moyenne de la zone d’arrière-plan. Répétez ce processus pour chaque particule dans toutes les images de la série. Exportez ensuite les données vers une feuille de calcul pour calculer le contraste ou l’intensité de chaque particule sur toutes les longueurs d’onde et tous les angles.Entrez dans l’équation suivante pour calculer le contraste de chaque particule. Enfin, tracez le profil spectral à une position de nanoparticule donnée en traçant des données avec la longueur d’onde le long de l’axe X et le contraste ou l’intensité le long de l’axe Y. Pour déterminer le réglage d’imagerie optimal, ces nanosphères dorées ont été photographiées à plusieurs réglages polariseurs.À zéro degré, les particules apparaissent principalement blanches avec une bande foncée qui traverse leur section médiane. Ceci est révélateur de la polarisation croisée pour les échantillons de nanosphère. Lorsque le polariseur est tourné vers différents angles, les particules projettent des ombres sombres vers un coin.Cependant, les valeurs de contraste des particules changent radicalement. Pour cet échantillon, le réglage d’imagerie optimal est avec un décalage polarisant de 10 degrés. Ici, la longueur d’onde est tracée contre le contraste des nanosphères d’or.Chaque point de données représente une moyenne de 20 nanosphères pour chaque diamètre de particule. Le contraste de pointe pour chaque particule se déplace légèrement en fonction de sa taille. L’intensité et la rotation sont encore plus importantes avec des formes anisotropiques comme cette nanorod d’or.Ici, la longueur d’onde est tracée contre l’intensité à deux paramètres polariseurs différents. Dans chaque cas, l’intensité du côté lumineux est beaucoup plus forte que celle du côté obscur. Le profil d’intensité d’une seule nanorod d’or à sa longueur d’onde localisée de résonance de plasmon de surface pendant la rotation de l’étape montre une grande différence d’intensité entre les côtés foncés et lumineux pendant que l’échantillon est tourné par 180 degrés.L’imagerie par échantillon est extrêmement importante. Il faut à la fois de la diligence et de la patience de la part du microscopiste. Si vous effectuez une expérience qui nécessite de réinventer l’échantillon sur une série de jours, alors des repères tels que les marques de rayures sont essentiels pour déplacer votre région d’intérêt.La microscopie DIC intéresse de plus en plus les chercheurs qui étudient les nanoparticules, en particulier dans les environnements dynamiques et cellulaires. Parce que DIC offre une résolution spatiale optimale, en particulier dans des environnements d’échantillonnage complexes.

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