Name: performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy at JoVE.com

Dr. Anthony S. Stender deseja reconhecer o apoio técnico através do nanoscale e Quantum fenômenos Institute (NQPI) na Universidade de Ohio. Este artigo foi tornado possível com o financiamento do start-up fornecido ao Dr. Stender pela Universidade de Ohio.

1. preparação da amostra com lâminas de microscopia de vidro padrão
<ol><li>Prepare lâminas de microscópio de vidro para deposição de amostras. Nota: em algumas circunstâncias, pode ser mais apropriado para armazenar o vidro em água ultrapura em vez de etanol. No entanto, armazenar em água ou ar faz com que o vidro hidrofóbico ao longo do tempo.<ol>
<li>Para melhores resultados, compre o vidro ou o microscópio de quartzo desliza e cubra o vidro.</li>
		<li>Usando uma pena de scribing, coloc uma marca ra...

<ol>
	<li>Pluta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+7:+Differential+Interference+Contrast+in.">Ch 7: Differential Interference Contrast in.</a> Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).</li><li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response.">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li><li>Stender, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Optical+Imaging+and+Spectroscopy.">Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).</li><li>Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+coherent+image+formation+in+differential+interference+contrast+(DIC)+microscope.">Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope.</a> Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).</li><li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+1:+Fundamentals+of+Light+Microscopy.">Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , 1-20 (2012).</li><li>Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Polarization+Setting+on+Gold+Nanorod+Signal+at+Nonplasmonic+Wavelengths+Under+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).</li><li>Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+Rotational+Motions+of+Nano-objects+in+Engineered+Environments+and+Live+Cells+with+Gold+Nanorods+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).</li><li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Properties+of+Metal+Nanoparticles:+The+Influence+of+Size,+Shape,+and+Dielectric+Environment.">The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li><li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+That's+Gold+Does+Glitter.">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li><li>Maier, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmonics: Fundamentals and Applications. , (2007).</li><li>Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Microscopy:+Selectively+Imaging+Nanoparticle+Probes+in+Live+Cells.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells.</a> Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).</li><li>Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization.">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).</li><li>Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Stimulated+Uncapping+Process+of+Gold-Capped+Mesoporous+Silica+Nanoparticles.">Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).</li><li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2:+Light+and+Color.">Ch 2: Light and Color.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).</li><li>Wayne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3:+The+Dependence+of+Image+Formation+on+the+Nature+of+Light.">Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light.</a> Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).</li><li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries.">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li><li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles:+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance.">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li><li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li><li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries.">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li></ol>

Quando a imagem latente com microscopia de DIC, é crítico aperfeiçoar os componentes óticos antes de coletar dados. Mesmo pequenos ajustes para o polarizador no meio de um experimento podem resultar em impactos significativos para os dados finais6. Além disso, os materiais diferentes exigem ajustes diferentes do polarizador. Embora os tamanhos grandes da etapa fossem utilizados aqui para demonstrar o efeito do ângulo da polarização, em um experimento real, é imperativo aperfeiçoar o ajus...

Desde a década de 1980, a microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) tem sido largamente vista como um importante método de imagem reservado para objetos de microescala dentro das ciências biológicas. No entanto, durante o seu desenvolvimento na década de 1950 e 1960, foi concebido como uma técnica para a ciência dos materiais1. Com os avanços recentes nas ciências materiais relacionadas às nanopartículas plasmônicas, ocorreu um interesse aumentado na caracterização dos materiais com microscopia ótica.
Muitas técnicas ópticas estão certamente disponíveis para a caracterização nanomaterial (por exemplo, campo escuro, brightfield, luz polarizada, fluorescência, etc.). O campo escuro é amplamente popular na pesquisa da nanopartícula, mas confia unicamente na coleção do scatter e fornece a informação limitada sobre amostras complexas2. A fluorescência pode ser útil, mas somente com amostras que luminesce ou que podem corretamente ser manchadas. A microscopia de DIC tem diversos traços que o fazem uma ferramenta valiosa para a análise das nanopartículas. As vantagens mais frequentemente indicadas do DIC em comparação com outros métodos e em relação às nanopartículas plasmonicas são: nenhuma coloração da amostra exigida, nenhuns efeitos do Halo, profundidade de campo rasa, e definição lateral elevada3. DIC tem pontos fortes adicionais que são valiosos para a pesquisa de nanopartículas plasmônicas. Em primeiro lugar, dois campos de polarização inerente e ortogonal estão presentes, podendo ser medidos simultaneamente para fins de espectroscopia2. Em segundo lugar, o sinal depolarizado de nanopartículas não é capturado na imagem final2, que pode ser uma causa para a preocupação séria em medições de espectroscopia de campo escuro.
A finalidade deste artigo é fornecer uma metodologia desobstruída para utilizar a microscopia de Nomarski DIC da luz transmitida para executar a espectroscopia em nanopartículas plasmônicas. Embora DIC é uma técnica poderosa que pode ser aplicada a materiais altamente diversificados, é também uma técnica que requer grande habilidade e compreensão para operá-lo corretamente quando nanopartículas de imagem. A microscopia de Nomarski DIC baseada em transmissão tem um caminho de luz complexo1 que só será brevemente revisto aqui. O trem óptico de DIC é exibido na Figura 1. A luz é transmitida através do microscópio primeiramente sendo passada através de um polarizador e de um prisma de Nomarski da feixe-rachadura antes de ser focalizada pelo condensador no plano da amostra. Depois de passar pelo objetivo, a luz encontra um prisma de Nomarski feixe-combinando e um analisador antes de sair para o detector. Os dois polarizadores e prismas Nomarski são fundamentais para a formação da imagem DIC e são responsáveis pela produção de dois campos de polarização ortogonal do DIC1. Para o leitor interessado em saber mais sobre os princípios de funcionamento e o trajeto ótico de microscópios de Nomarski DIC, ou as diferenças entre Nomarski DIC e outros estilos de DIC, refira por favor outras contas bem escritas nestes tópicos1, 4. º , 5. º , 6 anos de , o 7.
É igualmente importante compreender a natureza básica das nanopartículas plasmonicas antes de tentar realizar espectroscopia neles, seja com Nomarski DIC, campo escuro ou qualquer outra técnica de microscopia. No campo da plasmómica, as nanopartículas são definidas como particulados com dimensões na escala de 10-100 nm8,9. As nanopartículas podem assumir muitas formas (por exemplo, esferas, hastes, estrelas, halteres, etc.), e a maioria de suas propriedades importantes surgem de interações com a luz na faixa infravermelha ultravioleta-visível-próxima do espectro eletromagnético. O termo "plasmonico" não se restringe a nanopartículas10; Entretanto, ao discutir nanopartículas, é usado na referência à ressonância de superfície localizada do Plasmon (LSPR). LSPR é um fenômeno em que os elétrons de condução em uma nanopartícula oscilam devido a uma interação Coulombic com radiação eletromagnética de uma faixa de freqüência altamente específica e relativamente estreita8. Nessas mesmas frequências, as nanopartículas plasmonicas exibem aumento da absorção e dispersão da luz, tornando-as observáveis com microscopia óptica. Em muitos casos, é preferível observar as nanopartículas ao colocar filtros de bandpass antes do condensador2, para melhorar o contraste de imagem e para eliminar a luz que não induz o efeito lspr. Usando filtros também torna possível realizar experimentos de espectroscopia de partícula única.
O comportamento óptico relacionado ao LSPR é altamente dependente do tamanho e da forma das nanopartículas, podendo ser investigado com muitas técnicas de microscopia óptica. No entanto, a fim de decifrar as informações de orientação de nanopartículas plasmonicas com uma forma anisotrópica (i.e., não esférica), é necessário utilizar a polarização do campo de luz. Ao girar cuidadosamente o campo de polarização ou o substrato da amostra em pequenos incrementos, é possível monitorar as propriedades espectroscópicas dependentes da orientação de nanopartículas individuais. A rotação e a polarização podem igualmente ajudar em determinar se uma característica espectral é devido a uma oscilação dipolar ou mais elevada da ordem dos elétrons de superfície da nanopartícula. No entanto, no caso de nanopartículas isotrópicas (i.e., esféricas), o perfil espectral permanece essencialmente inalterado ao girar a amostra luz polarizada.
Quando visualizado através de um microscópio DIC (Figura 2), as nanopartículas têm um disco arejado com uma aparência branca e preta projetada em sombra contra um fundo cinza. As nanopartículas esféricas conservarão esta aparência a rotação e com a mudança de filtros do bandpass; Entretanto, as partículas desvanecem-se gradualmente da vista porque o comprimento de onda central do filtro torna-se mais separado do comprimento de onda dipolar único11da esfera. A aparência de Nanorods pode mudar muito dramaticamente como eles são girados2. Os Nanorods têm duas bandas LSPR com comportamento dipolar, cuja localização é baseada nas dimensões físicas dos Nanorods. Quando o eixo longitudinal de um diamante é orientado paralelamente a um dos campos de polarização DIC, o disco arejado aparecerá todo branco ou preto, se visualizado com um filtro de passe associado a esse comprimento de onda lspr. Depois de girar a amostra 90 °, ele vai assumir a cor oposta. Alternativamente, uma vez que a linha central transversal de um diamante é perpendicular ao eixo longitudinal, a haste tomará na cor oposta ao comutar entre os filtros que combinam os comprimentos de onda de lspr para os dois machados. Em outras orientações e configurações de filtro, os Nanorods parecerá mais como esferas, apresentando uma variedade de padrões de disco arejados de sombra-Cast. Para Nanorods com um eixo transversal < 25 nanômetro, pode ser difícil detectar o sinal nesse comprimento de onda do LSPR usando a microscopia de DIC.
Para realizar a espectroscopia de partícula única, é importante usar os componentes ópticos corretos e alinhá-los corretamente. Um objetivo capaz da microscopia de DIC deve ser usado. Para experimentos de partículas únicas, os objetivos do óleo 80x ou 100x são ideais. Os prismas de Nomarski DIC ordinariamente vêm em três variedades: padrão, alto contraste, e alta resolução. O tipo ideal depende altamente da finalidade do experimento e do tamanho das nanopartículas. Prismas padrão são bons para muitos experimentos; Mas ao trabalhar com nanopartículas menores (< 50 nm), os prismas de alto contraste podem ser benéficos, pois o contraste de partículas diminui à medida que as partículas diminuem no tamanho11. Ajustar o contraste de DIC é conseguido girando um polarizador ou traduzindo um dos prismas de DIC, dependendo da marca do microscópio ou do modelo6.
Depois de definir a iluminação Kohler e as configurações de polarizador, é fundamental não reajustar essas configurações ao coletar dados de espectroscopia. Além disso, um sinal de fundo médio constante deve ser mantido em todos os momentos durante a coleta de dados, mesmo quando se alterna entre filtros e configurações angulares. O valor de fundo ideal real depende da faixa dinâmica da câmera científica, mas em geral, o fundo deve estar no intervalo de 15% – 40% do nível máximo de detecção da câmera. Isso reduz a probabilidade de saturar o sensor da câmera, permitindo o contraste de partículas ideal. Para coletar dados de espectroscopia, é necessário trabalhar com uma câmera científica que capture imagens em preto e branco, em oposição a uma câmera colorida.
A preparação da amostra é outro aspecto crítico das nanopartículas plasmonicas de imagem. É imperativo que os operadores da microscopia DIC tenham uma compreensão das propriedades ópticas da amostra e do substrato da amostra. O vidro do microscópio "pre-limpado" não é preparado suficientemente para nanopartículas da imagem latente, e deve corretamente ser re-limpada antes da deposição da amostra para assegurar a observação desobstruída da amostra. Muitos protocolos da limpeza para corrediças do microscópio foram documentados previamente12, mas não é uma etapa que seja relatada normalmente em estudos experimentais.
Finalmente, os métodos de análise de dados são o componente final para a espectroscopia de partícula única. As intensidades máximas e mínimas para cada nanopartícula devem ser medidas, bem como a média de fundo local. As partículas de interesse devem estar localizadas em áreas sem detritos de fundo, defeitos de substrato ou iluminação irregular. Um método para determinar o perfil espectral de uma nanopartícula é calcular o contraste de partículas em cada comprimento de onda, utilizando a equação abaixo de11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativamente, o espectro de uma única partícula pode ser dividido em seus componentes máximos e mínimos individuais do sinal, que representam os dois campos da polarização de DIC, assim exibindo os dois espectros direccionalmente-dependentes simultaneamente-recolhidos, através das duas equações:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1117px;" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Contrad 70</td>
			<td style="width:228px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:157px;">1002</td>
			<td style="width:439px;">For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ethanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A962-4</td>
			<td>For cleaning and storing microscope glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope cover slips</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">26007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:228px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:157px;">DIAM-SPR-25-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanospheres (80 nm)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">742023-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ImageJ</td>
			<td style="width:228px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Free Software availabe for data analysis from NIJ</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:293px;">Nail polish</td>
			<td style="width:228px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:157px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nikon Ti-E microscope</td>
			<td style="width:228px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:228px;">Airgas</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:228px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:157px;">77054098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Scribing pen</td>
			<td style="width:228px;">Amazon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>18 megaohm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy

A microscopia do contraste da interferência diferencial (DIC) é uma ferramenta poderosa da imagem latente que seja empregada a mais geralmente para objetos da microescala da imagem latente usando a luz da visível-escala. O objetivo deste protocolo é detalhar um método comprovado para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e realizar espectroscopia de partícula única neles com microscopia DIC. Várias etapas importantes devem ser seguidas cuidadosamente, a fim de realizar experimentos de espectroscopia repetível. Primeiro, os pontos de referência podem ser gravados no substrato da amostra, que auxilia na localização da superfície da amostra e no rastreamento da região de interesse durante os experimentos. Em seguida, o substrato deve ser devidamente limpo de detritos e contaminantes que podem de outra forma dificultar ou obscurecer o exame da amostra. Uma vez que uma amostra é preparada corretamente, o trajeto ótico do microscópio deve ser alinhado, usando a iluminação de Kohler. Com um microscópio padrão do estilo de Nomarski DIC, a rotação da amostra pode ser necessária, particular quando as nanopartículas plasmônicas exibem propriedades óticas orientação-dependentes. Porque a microscopia de DIC tem dois campos ortogonais inerentes da polarização, o padrão comprimento de onda-dependente do contraste de DIC revela a orientação de nanopartículas plasmônicas rod-shaped. Finalmente, a aquisição de dados e análises de dados devem ser cuidadosamente executadas. É comum representar dados de espectroscopia com base em DIC como um valor de contraste, mas também é possível apresentá-lo como dados de intensidade. Nesta demonstração de DIC para espectroscopia de partícula única, o foco está em nanopartículas de ouro esféricas e em forma de haste.

Ao trabalhar com amostras que são grandes o suficiente para ser visto a olho nu, colocando pontos de referência sobre o substrato de vidro não é normalmente necessário. No entanto, ao trabalhar com nanomateriais ou quando a rotação da amostra é necessária, os pontos de referência podem fornecer um método fácil para localizar, distinguir e rastrear a orientação da amostra. Apesar de técnicas mais sofisticadas podem ser utilizadas para deixar Marcos em substratos de vidro<sup...

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Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

O objetivo deste protocolo é detalhar uma abordagem comprovada para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e para a realização de espectroscopia de partícula única neles com microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).

Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

A microscopia DIC é superior ao campo escuro em nanopartículas plasmônicas de imagem em ambientes complexos. No entanto, a DIC também requer maior conhecimento e habilidade para obter resultados reprodutíveis. A microscopia DIC fornece alta resolução lateral e profundidade de campo rasa.Ambos os traços são extremamente importantes no monitoramento de nanopartículas dentro das células ou em ambientes complexos. Para começar, use uma caneta de assinatura para colocar uma marca de arranhão rasa e curta no centro de cada mancha de vidro e, em seguida, limpe o vidro conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, use uma micropipette para remover 100 microlitadores de uma solução de nanopartícula de ouro de 05 miligramas por mililitro de seu recipiente de armazenamento original, e ejete a solução em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a amostra por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade. Quando terminar, remova o supernatante com uma micropipette para se livrar do excesso de surfactante da solução de nanopartículas. Em seguida, adicione 100 microliters de água ultra-pura ao tubo centrífuga.Brevemente vórtice a amostra para quebrar a pelota, e depois sonicá-la por 20 minutos imediatamente depois para resususpensar totalmente os agregados de nanopartículas. Usando uma micropipette, dropcast seis microliters de solução de nanopartículas no deslizamento de vidro limpo e arranhado. Em seguida, vire cuidadosamente a tampa e coloque-a em cima de um segundo pedaço maior de vidro microscópio.A queda deve se espalhar rapidamente uniformemente entre os dois pedaços de vidro. Tome cuidado para evitar ficar bolhas de ar presas entre os dois pedaços de vidro. Use uma linha estreita de esmalte para selar as bordas da tampa para evitar a evaporação do líquido.Coloque a amostra no estágio do microscópio e alinhe o objetivo e o condensador do microscópio. Ajuste o foco para encontrar o plano focal com a amostra nele e localize a marca de arranhão criada anteriormente. Concentre-se nele e ajuste o foco até que as nanopartículas entrem em vista.Para determinar a colocação precisa do condensador, utilize o método de iluminação Kohler começando com o objetivo de 20x e, em seguida, movendo-se para altas ampliações como 80 ou 100x. Em seguida, selecione uma região de interesse dentro da amostra para imagem. Centralize a região no campo de visão da câmera e ajuste o foco conforme necessário.Se o microscópio tiver o design de Senarmont, comece com o polarizador perto da extinção máxima do fundo e gire gradualmente o polarizador para diminuir a extinção de fundo. A intensidade de fundo aumentará gradualmente. O cenário ideal é alcançado quando as nanopartículas atingem sua maior diferença de intensidade em comparação com a média de fundo local.Para nanopartículas plasmônicas, o maior contraste é tipicamente alcançado com um fundo relativamente escuro em ou perto da extinção máxima de fundo. Desligue a iluminação da sala para evitar que a iluminação perdida interaja com o processo. Coloque em prática um filtro de largura total de 10 nanômetros a meio máximo de largura com seu comprimento de onda central co-localizado com o comprimento de onda de plasmon de superfície localizado principal, a fim de ver a região de interesse.Em seguida, ajuste a intensidade da lâmpada ou o tempo de exposição até que o nível de fundo esteja em 5% a 40% do nível máximo de capacidade da câmera. Nenhum objeto dentro da região de interesse deve exibir intensidades de sinal que excedam 90% do nível máximo de intensidade da câmera. Imagem a amostra com uma série de filtros de passe de banda que cada um tem uma largura total a meio máximo de 10 nanômetros, e que como um todo permitem a imagem em toda a faixa de comprimento de onda de interesse.Certifique-se de que a intensidade de fundo nas imagens permanece dentro de 5% uma da outra, ajustando o tempo de exposição e não a potência da lâmpada. Depois de trocar filtros, refoco a amostra antes de capturar imagens. Salve as imagens como arquivos TIFF não compactados e/ou no formato de arquivo nativo do software, a fim de preservar todas as informações relevantes.Para começar a análise, abra a imagem com ImageJ. Use a ferramenta retângulo para desenhar um retângulo ao redor da região principal de interesse. Em seguida, na barra de ferramentas, selecione imagem, vá para zoom e selecione para seleção.A janela de imagem aumentará a área selecionada. Em seguida, selecione imagem, vá para ajustar e selecione brilho/contraste. Para melhorar a visão da região da amostra, ajuste o mínimo, máximo, brilho e contraste da imagem.Esses ajustes não alteram os dados científicos, apenas permitem uma melhor visibilidade da região amostral. Agora, use a ferramenta retângulo novamente e desenhe uma caixa em torno da primeira nanopartícula a ser medida. A caixa deve ser apenas um pouco maior do que o disco arejado da nanopartícula.Uma vez selecionado, vá analisar e selecione a medida. Uma nova janela aparece que relata as intensidades mínimas, máximas e médias para os pixels localizados dentro da caixa selecionada. Mantendo o tamanho original da caixa, arraste a caixa para uma área imediatamente adjacente à partícula onde o contraste de fundo é relativamente uniforme, e não há partículas ou contaminantes presentes.Use novamente a ferramenta de medida para determinar a intensidade média da área de fundo. Repita este processo para cada partícula em todas as imagens da série. Em seguida, exporte os dados para uma planilha para calcular o contraste ou intensidade de cada partícula em todos os comprimentos de onda e ângulos.Digite na equação a seguir para calcular o contraste de cada partícula. Finalmente, gráfico o perfil espectral em uma determinada posição de nanopartículas, plotando dados com o comprimento de onda ao longo do eixo X e o contraste ou intensidade ao longo do eixo Y. Para determinar a configuração de imagem ideal, essas nanosferas de ouro foram imagens em várias configurações polarizadoras.A zero graus, as partículas aparecem principalmente brancas com uma faixa escura correndo através de sua seção média. Isso é um indicativo de polarização cruzada para amostras de nanosfera. Quando o polarizador é girado para diferentes ângulos, as partículas lançam sombras escuras em direção a um canto.No entanto, os valores de contraste de partículas mudam drasticamente. Para esta amostra, a configuração de imagem ideal é com uma mudança polarizadora de 10 graus. Aqui o comprimento de onda é traçado contra o contraste das nanosferas de ouro.Cada ponto de dados representa uma média de 20 nanosferas para cada diâmetro de partícula. O contraste de pico para cada partícula muda ligeiramente dependendo do seu tamanho. A intensidade e rotação é ainda mais importante com formas anisotrópicas como este nanorod dourado.Aqui o comprimento de onda é plotado contra a intensidade em duas configurações polarizadoras diferentes. Em cada caso, a intensidade do lado bom é muito mais forte do que a do lado negro. O perfil de intensidade de um único nanorod de ouro em seu comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície localizada durante a rotação do palco mostra uma grande diferença de intensidade entre os lados escuro e brilhante à medida que a amostra é girada através de 180 graus.A imagem da amostra é extremamente importante. Requer diligência e paciência por parte do microscopista. Se você está realizando um experimento que requer reimaginar a amostra durante uma série de dias, então marcos como as marcas de arranhões são fundamentais para realocar sua região de interesse.A microscopia dic está crescendo no interesse de pesquisadores que estudam nanopartículas, especialmente em ambientes dinâmicos e celulares. Porque o DIC oferece uma resolução espacial ideal, especialmente em ambientes de amostragem complexos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Template Directed Synthesis of Plasmonic Gold Nanotubes with Tunable IR Absorbance

Dirigido modelo de síntese de nanotubos de Ouro plasmônicos com Absorbância IR Tunable

A nearly parallel array of pores can be produced by anodizing aluminum foils in acidic environments1, 2. Applications of anodic aluminum oxide (AAO) ...

Química

Synthesis of Immunotargeted Magneto-plasmonic Nanoclusters

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Magnetic and plasmonic properties combined in a single nanoparticle provide a synergy that is advantageous in a number of biomedical applications ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

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We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

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Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Sondagem da Estrutura e Dinâmica da Água Interfacial com Microscopia de Tunelamento de Varredura e Espectroscopia

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Quantitative SERS Detection of Uric Acid via Formation of Precise Plasmonic Nanojunctions within Aggregates of Gold Nanoparticles and Cucurbit[n]uril

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Detecção quantitativa de sers de ácido úrico através da formação de nanojunções plasmônicas precisas dentro de Agregados de Nanopartículas de Ouro e Cucurbit[n]uril

This work describes a rapid and highly sensitive method for the quantitative detection of an important biomarker, uric acid (UA), via surface-enhanced ...

Preparation of Silver-Palladium Alloyed Nanoparticles for Plasmonic Catalysis under Visible-Light Illumination

Preparação de Nanopartículas de Aliga de prata-paládio para catálise plasmônica sob iluminação de luz visível

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Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

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Studying the Effects of Temperature on the Nucleation and Growth of Nanoparticles by Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy

Estudando os efeitos da temperatura na nucleação e crescimento de nanopartículas por microscopia eletrônica de transmissão de células líquidas

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Synthesis of Metal Nanoparticles Supported on Carbon Nanotube with Doped Co and N Atoms and its Catalytic Applications in Hydrogen Production

Síntese de Nanopartículas metálicas suportadas em Nanotubo de Carbono com Doped Co e N Átomos e suas Aplicações Catalíticas na Produção de Hidrogênio

A method for facile synthesis of nanostructured catalysts supported on carbon nanotubes with atomically dispersed cobalt and nitrogen dopant is presented ...