Name: performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00
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El Dr. Anthony S. STENDER desea reconocer el apoyo técnico a través de la Nanoscale y el Instituto de fenómenos cuánticos (NQPI) en la Universidad de Ohio. Este artículo fue posible gracias a la financiación inicial proporcionada al Dr. STENDER por la Universidad de Ohio.

1. preparación de muestras con diapositivas de microscopía de vidrio estándar
<ol><li>Prepare diapositivas de microscopio de vidrio para la deposición de muestras. Nota: en algunas circunstancias, puede ser más apropiado almacenar el vidrio en agua ultrapura en lugar de etanol. Sin embargo, el almacenamiento en agua o aire hace que el vidrio hidrófobo con el tiempo.<ol>
<li>Para obtener los mejores resultados, compre portaobjetos de vidrio o cuarzo y vidrio de cubierta.</li>
		<li>Usando una pluma de trazado, ...

<ol>
	<li>Pluta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+7:+Differential+Interference+Contrast+in.">Ch 7: Differential Interference Contrast in.</a> Advanced Light Microscopy. 2, 146-197 (1989).</li><li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response.">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li><li>Stender, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Optical+Imaging+and+Spectroscopy.">Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).</li><li>Mehta, S. B., Sheppard, C. J. 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E., Wang, G., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Polarization+Setting+on+Gold+Nanorod+Signal+at+Nonplasmonic+Wavelengths+Under+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).</li><li>Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+Rotational+Motions+of+Nano-objects+in+Engineered+Environments+and+Live+Cells+with+Gold+Nanorods+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).</li><li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Properties+of+Metal+Nanoparticles:+The+Influence+of+Size,+Shape,+and+Dielectric+Environment.">The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li><li>Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+That's+Gold+Does+Glitter.">Not All That's Gold Does Glitter.</a> MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).</li><li>Maier, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization.">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).</li><li>Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+Stimulated+Uncapping+Process+of+Gold-Capped+Mesoporous+Silica+Nanoparticles.">Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).</li><li>Murphy, D. B., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2:+Light+and+Color.">Ch 2: Light and Color.</a> Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , 21-33 (2012).</li><li>Wayne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3:+The+Dependence+of+Image+Formation+on+the+Nature+of+Light.">Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light.</a> Light and Video Microscopy (Second Edition). , 43-78 (2014).</li><li>Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmonic+Behavior+of+Single+Gold+Dumbbells+and+Simple+Dumbbell+Geometries.">Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).</li><li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark-field+microscopy+studies+of+single+metal+nanoparticles:+understanding+the+factors+that+influence+the+linewidth+of+the+localized+surface+plasmon+resonance.">Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance.</a> Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).</li><li>Choo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength-Dependent+Differential+Interference+Contrast+Inversion+of+Anisotropic+Gold+Nanoparticles.">Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).</li><li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries.">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li></ol>

Cuando se toma imágenes con microscopía DIC, es fundamental optimizar los componentes ópticos antes de recopilar datos. Incluso ajustes menores en el polarizador en medio de un experimento pueden resultar en impactos significativos en los datos finales6. Además, diferentes materiales requieren diferentes ajustes polarizadores. Aunque aquí se utilizaron grandes tamaños de paso para demostrar el efecto del ángulo de polarización, en un experimento real, es imprescindible optimizar el ajuste ...

Desde la década de 1980, la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) se ha visto en gran medida como un importante método de imagen reservado para los objetos de microescala dentro de las ciencias biológicas. Sin embargo, durante su desarrollo en los años 1950 y 1960, fue concebido como una técnica para la ciencia de los materiales1. Con los recientes avances en las Ciencias materiales relacionados con las nanopartículas plasmónicas, se ha realizado un mayor interés en la caracterización de materiales con microscopía óptica.
Muchas técnicas ópticas están sin duda disponibles para la caracterización de nanomateriales (por ejemplo, campo oscuro, campo claro, luz polarizada, fluorescencia, etc.). El campo oscuro es muy popular en la investigación de nanopartículas, pero se basa únicamente en la colección de dispersión y proporciona información limitada sobre muestras complejas2. La fluorescencia puede ser útil, pero sólo con muestras que luminesce o que pueden ser debidamente teñidas. La microscopía DIC tiene varios rasgos que la convierten en una herramienta valiosa para el análisis de nanopartículas. Las ventajas más frecuentemente indicadas de la DIC en comparación con otros métodos y en lo que respecta a las nanopartículas plasmónicas son: no se requiere tinción de muestras, no hay efectos de Halo, profundidad de campo superficial y alta resolución lateral3. El DIC tiene fortalezas adicionales que son valiosas para la investigación de nanopartículas plasmónicas. En primer lugar, dos campos de polarización inherentes y ortogonales están presentes, y se pueden medir simultáneamente para fines de espectroscopía2. En segundo lugar, la señal depolarizada de las nanopartículas no se captura en la imagen final2, que puede ser una causa de grave preocupación en las mediciones de espectroscopía de campo oscuro.
El propósito de este artículo es proporcionar una metodología clara para la utilización de microscopía de Nomarski de luz transmitida para realizar espectroscopía en nanopartículas plasmónicas. Aunque la DIC es una técnica poderosa que se puede aplicar a materiales muy diversos, también es una técnica que requiere una gran habilidad y comprensión para operarla correctamente cuando se imaginan nanopartículas. La microscopía de la transmisión Nomarski con base en transmisiones tiene un camino ligero complejo1 que solo se revisará brevemente aquí. El tren óptico de DIC se visualiza en la figura 1. La luz se transmite a través del microscopio, primero se pasa a través de un polarizador y un prisma de Nomarski que divide el haz antes de ser centrado por el condensador en el plano de la muestra. Después de pasar por el objetivo, la luz se encuentra con un Haz que combina el prisma Nomarski y un analizador antes de salir al detector. Los dos polarizadores y prismas de Nomarski son críticos para la formación de la imagen de DIC y son responsables de producir los dos campos de polarización ortogonal1de Dic. Para el lector interesado en saber más sobre los principios de trabajo y la trayectoria óptica de los microscopios de Nomarski DIC, o las diferencias entre Nomarski DIC y otros estilos de DIC, por favor refiérase a otras cuentas bien escritas sobre estos temas1, 4 , 5 , 6 , 7.
Es igualmente importante entender la naturaleza básica de las nanopartículas plasmónicas antes de intentar realizar espectroscopía en ellas, ya sea con Nomarski DIC, campo oscuro, o cualquier otra técnica de microscopía. En el campo de los plasmónicos, las nanopartículas se definen como partículas con dimensiones en la escala de 10-100 nm8,9. Las nanopartículas pueden adoptar muchas formas (por ejemplo, esferas, varillas, estrellas, mancuernas, etc.), y la mayoría de sus propiedades importantes surgen de las interacciones con la luz en el rango infrarrojo ultravioleta-visible-cercano del espectro electromagnético. El término "plasmónico" no se restringe a las nanopartículas10; sin embargo, cuando se discuten las nanopartículas, se utiliza en referencia a la resonancia de Plasmon superficial localizada (LSPR). LSPR es un fenómeno en el que los electrones de conducción en una nanopartícula oscilan debido a una interacción Coulombic con la radiación electromagnética de una banda de frecuencias8muy específica y relativamente estrecha. A estas mismas frecuencias, las nanopartículas plasmónicas exhiben una mayor absorción y dispersión de la luz, haciéndolos observables con microscopía óptica. En muchos casos, se prefiere observar las nanopartículas mientras se colocan filtros de paso de banda antes del condensador2, para mejorar el contraste de imagen y para eliminar la luz que no induce el efecto LSPR. El uso de filtros también hace posible realizar experimentos de espectroscopía de partículas individuales.
El comportamiento óptico relacionado con LSPR depende en gran medida del tamaño y la forma de las nanopartículas, y se puede investigar con muchas técnicas de microscopía óptica. Sin embargo, con el fin de descifrar la información de orientación de las nanopartículas plasmónicas con una forma anisotrópico (es decir, no esférica), es necesario utilizar la polarización del campo de luz. Al rotar cuidadosamente el campo de polarización o el sustrato de la muestra en pequeños incrementos, es posible monitorear las propiedades espectroscópicas dependientes de la orientación de las nanopartículas individuales. La rotación y la polarización también pueden ayudar a determinar si una característica espectral se debe a una oscilación de orden dipolares o superior de los electrones superficiales de la nanopartícula. Sin embargo, en el caso de nanopartículas isotrópicas (es decir, esféricas), el perfil espectral permanece esencialmente sin cambios al rotar la muestra bajo luz polarizada.
Cuando se ve a través de un microscopio DIC (figura 2), las nanopartículas tienen un disco aireado con un aspecto blanco y negro fundido a la sombra contra un fondo gris. Las nanopartículas esféricas mantendrán esta apariencia bajo rotación y con el cambio de filtros de paso de banda; sin embargo, las partículas se desvanecerán gradualmente de la vista a medida que la longitud de onda central del filtro se separa más de la única longitud de onda LSPR de la esfera11. La aparición de nanorods puede cambiar drásticamente a medida que se giran2. Los nanorods tienen dos bandas LSPR con comportamiento dipolares, cuya ubicación se basa en las dimensiones físicas de los nanorods. Cuando el eje longitudinal de un nanorod está orientado paralelo a uno de los campos de polarización DIC, el disco aireado aparecerá todo blanco o negro Si se visualiza con un filtro de paso de banda asociado con esa longitud de onda LSPR. Después de rotar la muestra 90 °, tomará el color opuesto. Alternativamente, dado que el eje transversal de un nanorod es perpendicular al eje longitudinal, la varilla tomará el color opuesto al cambiar entre filtros que coincidan con las longitudes de onda LSPR para los dos ejes. En otras orientaciones y configuraciones de filtro, las nanorods aparecerán más como esferas, presentando una variedad de patrones de disco aireados de sombra. Para nanorods con un eje transversal < 25 nm, puede ser difícil detectar la señal en la longitud de onda de LSPR utilizando la microscopía DIC.
Para realizar la espectroscopía de una sola partícula, es importante utilizar los componentes ópticos correctos y alinearlos correctamente. Se debe utilizar un objetivo capaz de microscopía DIC. Para experimentos de partículas individuales, los objetivos de aceite de 80x o 100x son ideales. Los prismas de Nomarski DIC normalmente vienen en tres variedades: estándar, alto contraste y alta resolución. El tipo ideal depende altamente del propósito del experimento y del tamaño de las nanopartículas. Los prismas estándar están bien para muchos experimentos; pero cuando se trabaja con nanopartículas más pequeñas (< 50 nm), los prismas de alto contraste pueden ser beneficiosos, ya que el contraste de partículas disminuye a medida que las partículas disminuyen en el tamaño11. El ajuste del contraste DIC se consigue girando un polarizador o traduciendo uno de los prismas DIC, dependiendo de la marca del microscopio o del modelo6.
Después de configurar la iluminación de Kohler y los ajustes del polarizador, es fundamental no reajustar estos ajustes mientras se recopilan datos de espectroscopía. Además, se debe mantener una señal de fondo promedio constante en todo momento durante la recopilación de datos, incluso cuando se cambia entre los filtros y los ajustes de ángulo. El valor real de fondo ideal depende del rango dinámico de la cámara científica, pero en general, el fondo debe estar en el rango de 15% – 40% del nivel de detección máximo de la cámara. Esto reduce la probabilidad de saturar el sensor de la cámara al tiempo que permite un contraste de partículas óptimo. Para recopilar datos de espectroscopía, es necesario trabajar con una cámara científica que Capture imágenes en blanco y negro, en contraposición a una cámara a color.
La preparación de muestras es otro aspecto crítico de las nanopartículas plasmónicas por imágenes. Es imperativo que los operadores de la microscopía DIC tengan una comprensión de las propiedades ópticas de la muestra y del sustrato de la muestra. El cristal del microscopio "precaseados" no está suficientemente preparado para las nanopartículas de imagen, y debe volver a limpiarse correctamente antes de la deposición de la muestra para garantizar la observación sin obstrucciones de la muestra. Muchos protocolos de limpieza para las diapositivas de microscopio han sido documentados previamente12, pero no es un paso que se divulga normalmente en estudios experimentales.
Finalmente, los métodos de análisis de datos son el componente final de la espectroscopía de partículas individuales. Se deben medir las intensidades máximas y mínimas para cada nanopartícula, así como la media de fondo local. Las partículas de interés deben estar ubicadas en áreas sin residuos de fondo, defectos de sustrato o iluminación irregular. Un método para determinar el perfil espectral de una nanopartícula es calculando el contraste de las partículas en cada longitud de onda, utilizando la ecuación inferior a11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativamente, el espectro de una sola partícula se puede dividir en sus componentes individuales de señal máxima y mínima, que representan los dos campos de polarización de DIC, mostrando así los dos espectros dependientes direccionalmente que se recogen simultáneamente, a través de las dos ecuaciones:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1117px;" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Contrad 70</td>
			<td style="width:228px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:157px;">1002</td>
			<td style="width:439px;">For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ethanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A962-4</td>
			<td>For cleaning and storing microscope glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope cover slips</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">260148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:228px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:157px;">26007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:228px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:157px;">DIAM-SPR-25-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Gold nanospheres (80 nm)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">742023-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ImageJ</td>
			<td style="width:228px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Free Software availabe for data analysis from NIJ</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:293px;">Nail polish</td>
			<td style="width:228px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:157px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nikon Ti-E microscope</td>
			<td style="width:228px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:228px;">Airgas</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera</td>
			<td style="width:228px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:157px;">77054098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Scribing pen</td>
			<td style="width:228px;">Amazon</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td>Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>18 megaohm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing spectroscopy on plasmonic nanoparticles with transmission-based nomarski-type differential interference contrast microscopy

La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) es una potente herramienta de imagen que se emplea con mayor frecuencia para objetos de microescala de imagen utilizando luz de rango visible. El propósito de este protocolo es detallar un método probado para preparar muestras de nanopartículas plasmónicas y realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía DIC. Varios pasos importantes deben seguirse cuidadosamente para realizar experimentos de espectroscopía repetible. Primero, los hitos pueden ser grabados en el sustrato de la muestra, que ayuda a localizar la superficie de la muestra y en el seguimiento de la región de interés durante los experimentos. A continuación, el sustrato debe limpiarse adecuadamente de escombros y contaminantes que de otro modo pueden obstaculizar u oscurecer el examen de la muestra. Una vez que una muestra se prepara correctamente, la trayectoria óptica del microscopio debe alinearse, utilizando Kohler Illumination. Con un microscopio DIC de estilo Nomarski estándar, la rotación de la muestra puede ser necesaria, especialmente cuando las nanopartículas plasmónicas exhiben propiedades ópticas dependientes de la orientación. Debido a que la microscopía DIC tiene dos campos de polarización ortogonal inherentes, el patrón de contraste DIC dependiente de la longitud de onda revela la orientación de las nanopartículas plasmónicas en forma de varilla. Finalmente, la adquisición de datos y los análisis de datos deben realizarse cuidadosamente. Es común representar datos de espectroscopía basada en DIC como un valor de contraste, pero también es posible presentarlo como datos de intensidad. En esta demostración de la DIC para la espectroscopía de una sola partícula, el foco se centra en las nanopartículas de oro esféricas y en forma de varilla.

Cuando se trabaja con muestras que son lo suficientemente grandes como para ser vistos a simple vista, no se requiere normalmente colocar puntos de referencia en el sustrato de vidrio. Sin embargo, cuando se trabaja con nanomateriales o cuando se requiere la rotación de la muestra, los puntos de referencia pueden proporcionar un método fácil para ubicar, distinguir y rastrear la orientación de la muestra. Aunque se pueden utilizar técnicas más sofisticadas para dejar puntos de refer...

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Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

El objetivo de este protocolo es detallar un enfoque comprobado para la preparación de muestras de nanopartículas plasmónicas y para realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Realización de espectroscopía en nanopartículas Plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomarski basado en la transmisión

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

La microscopía DIC es superior al campo oscuro en nanopartículas plasmónicas de imagen en entornos complejos. Sin embargo, DIC también requiere un mayor conocimiento y habilidad para obtener resultados reproducibles. La microscopía DIC proporciona alta resolución lateral y poca profundidad de campo.Ambos rasgos son extremadamente importantes al monitorear nanopartículas dentro de las células o en entornos complejos. Para comenzar, utilice un lápiz garabato para colocar una marca de arañazos poco profunda y corta en el centro de cada tapa de vidrio y, a continuación, limpie el vidrio como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, utilice una micropipeta para eliminar 100 microlitros de una solución de nanopartícula de oro de 05 miligramos por mililitro de su contenedor de almacenamiento original, y expulse la solución en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar la muestra durante 10 minutos a 6.000 veces la gravedad. Cuando haya terminado, retire el sobrenadante con una micropipeta para eliminar el exceso de surfactante de la solución de nanopartículas. A continuación, añada 100 microlitros de agua ultrapura al tubo centrífugo.Vórtice brevemente la muestra para romper el pellet, y luego sonicarla durante 20 minutos inmediatamente después para resuspender completamente los agregados de nanopartículas. Usando una micropipeta, lanzar seis microlitros de solución de nanopartículas en el cubreobjetos de vidrio limpio y rayado. A continuación, voltee cuidadosamente el cubreobjetos y colóquelo encima de una segunda pieza más grande de vidrio del microscopio.La gota debe extenderse rápidamente uniformemente entre los dos trozos de vidrio. Tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire queden atrapadas entre los dos trozos de vidrio. Utilice una línea estrecha de esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos para evitar la evaporación del líquido.Coloque la muestra en la etapa del microscopio y alinee el objetivo y el condensador del microscopio. Ajuste el enfoque para encontrar el plano focal con la muestra y localice la marca de rayado creada anteriormente. Concéntrese en él y ajuste el enfoque hasta que las nanopartículas se vean.Para determinar la colocación precisa del condensador, utilice el método de iluminación Kohler comenzando con el objetivo 20x y luego pasando a aumentos altos como 80 o 100x. A continuación, seleccione una región de interés dentro de la muestra para obtener imágenes. Centre la región en el campo de visión de la cámara y ajuste el enfoque según sea necesario.Si el microscopio tiene el diseño de Senarmont, comience con el polarizador establecido cerca de la máxima extinción de fondo y gire gradualmente el polarizador hacia la disminución de la extinción de fondo. La intensidad del fondo aumentará gradualmente. El entorno ideal se logra cuando las nanopartículas alcanzan su mayor diferencia de intensidad en comparación con la media de fondo local.Para las nanopartículas plasmónicas, el mayor contraste se logra típicamente con un fondo relativamente oscuro en o cerca de la extinción de fondo máxima. Apague la iluminación de la habitación para evitar que la iluminación perdida interactúe con el proceso. Poner en su lugar un ancho completo de 10 nanómetros a medio máximo de filtro de paso de banda con su longitud de onda central co-ubicada con la longitud de onda de resonancia de plasmon de superficie localizada principal con el fin de ver la región de interés.A continuación, ajuste la intensidad o el tiempo de exposición de la lámpara hasta que el nivel de fondo esté en el 5% al 40% del nivel de capacidad máxima de la cámara. Ningún objeto dentro de la región de interés debe exhibir intensidades de señal que excedan el 90% del nivel de intensidad máxima de la cámara. I imagen de la muestra con una serie de filtros de paso de banda que cada uno tiene un ancho completo a medio-máximo de 10 nanómetros, y que en su conjunto permiten la creación de imágenes en todo el rango de longitud de onda de interés.Asegúrese de que la intensidad de fondo en las imágenes se mantenga dentro del 5% de la una de la otra ajustando el tiempo de exposición y no la potencia de la lámpara. Después de cambiar de filtro, vuelva a enfocar la muestra antes de capturar imágenes. Guarde las imágenes como archivos TIFF sin comprimir y/o en el formato de archivo nativo del software para conservar toda la información relevante.Para comenzar el análisis, abra la imagen con ImageJ. Utilice la herramienta rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de la región principal de interés. A continuación, en la barra de herramientas, seleccione la imagen, vaya al zoom y seleccione la selección.La ventana de imágenes ampliará el área seleccionada. A continuación, seleccione la imagen, vaya a ajustar y seleccione brillo/contraste. Para mejorar la vista de la región de muestra, ajuste el mínimo, el máximo, el brillo y el contraste de la imagen.Estos ajustes no alteran los datos científicos, sino que simplemente permiten una mejor visibilidad de la región de la muestra. Ahora, utilice la herramienta rectángulo de nuevo y dibuje un cuadro alrededor de la primera nanopartícula que se va a medir. La caja debe ser sólo un poco más grande que el disco ventilado de la nanopartícula.Una vez seleccionado, vaya a analizar y seleccione medir. Aparece una nueva ventana que informa de las intensidades mínimas, máximas y medias de los píxeles situados dentro del cuadro seleccionado. Conservando el tamaño original del cuadro, arrastre el cuadro a un área inmediatamente adyacente a la partícula donde el contraste de fondo es relativamente uniforme y no hay partículas ni contaminantes presentes.Utilice de nuevo la herramienta de medida para determinar la intensidad media del área de fondo. Repita este proceso para cada partícula en todas las imágenes de la serie. A continuación, exporte los datos a una hoja de cálculo para calcular el contraste o la intensidad de cada partícula en todas las longitudes de onda y ángulos.Introduzca la siguiente ecuación para calcular el contraste de cada partícula. Por último, grafica el perfil espectral en una posición de nanopartícula determinada trazando datos con la longitud de onda a lo largo del eje X y el contraste o intensidad a lo largo del eje Y. Para determinar el ajuste óptimo de la imagen, estas nanoesferas de oro fueron imágenes en varios ajustes del polarizador.En cero grados, las partículas aparecen en su mayoría blancas con una franja oscura que corre a través de su sección media. Esto es indicativo de polarización cruzada para muestras de nanoesfera. Cuando el polarizador se gira a diferentes ángulos, las partículas proyectan sombras oscuras hacia una esquina.Sin embargo, los valores de contraste de partículas cambian drásticamente. Para esta muestra, el ajuste de imagen óptimo es con un desplazamiento polarizador de 10 grados. Aquí la longitud de onda se traza contra el contraste de las nanoesferas de oro.Cada punto de datos representa un promedio de 20 nanoesferas para cada diámetro de partícula. El contraste máximo de cada partícula cambia ligeramente dependiendo de su tamaño. La intensidad y rotación es aún más importante con formas anisotrópicas como esta nanorod de oro.Aquí la longitud de onda se traza contra la intensidad en dos configuraciones de polarizador diferentes. En cada caso, la intensidad del lado brillante es mucho más fuerte que la del lado oscuro. El perfil de intensidad de una sola nanorod de oro en su longitud de onda de resonancia de plasmón de superficie localizada durante la rotación de la etapa muestra una gran diferencia de intensidad entre los lados oscuros y brillantes a medida que la muestra gira a través de 180 grados.La toma de imágenes de muestras es extremadamente importante. Requiere diligencia y paciencia por parte del microscopista. Si está realizando un experimento que requiere reinventar la muestra durante una serie de días, los puntos de referencia, como las marcas de arañazos, son fundamentales para reubicar la región de interés.La microscopía DIC está creciendo en interés por los investigadores que estudian nanopartículas, especialmente en entornos dinámicos y celulares. Porque DIC ofrece una resolución espacial óptima, especialmente en entornos de muestreo complejos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Investigación

Química

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