Name: ex vivo perfusion of the rodent placenta
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for miljø sundhed videnskaber (r00-ES024783), Rutgers Center for miljø eksponeringer og sygdom (P30-ES005022), og Rutgers joint Graduate program i toksikologi (T32-ES007148). Vi vil også gerne takke DRs. Michael Goedken, Marianne Polunas, og Pedro Louro for deres tekniske ekspertise og Dr. Adam goodwill for hans hjælp til at designe vores perfusion skematisk (figur 5).

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug på Rutgers University.
1. forberedelse før forsøget
Bemærk: disse trin kan udføres inden for få dage/uger før eksperimentet.
<ol><li>Ændre fartøjets kammer. Bemærk: figur 1a, B viser det modificerede enkelt fartøjs kammer.<ol>
<li>Bevæg termistor sensoren fra under clipsen, og bøj den, så den hænger frit i perfusionbadet (figur 1b).</li>
		<li>Installer to 4-tommers stumpe nåle i rustfrit stål med standard luer tilslutnings hubs, 1 25 g og 1 23 g sikret under termistor clipsen og tilsæt en 3-vejs stophanen for at tillade kanylering af navle karbilical (figur 1b). Bemærk: luer-tilslutningerne i forskellige måler størrelser er farvekodede. Dette letter kortlægningen af fartøjerne under og efter forsøget.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installer to 70 − 100 μm glas Mikropipetter. For yderligere oplysninger om disse procedurer, se venligst følgende henvisninger10,11. Bemærk: den spids diameter, der almindeligvis anvendes i disse eksperimenter, ligger i intervallet 70 − 100 μm. spids diametre større end dette område kan tilføje problemer til kanyle processen, mens spids diametre mindre end 60 μm kan punktere den vaskulære væg under kanylering.</li>
	<li>Forbered bindebånd fra steril nylon sutur (til proximale og distale ender af uterin arterie) og fra sort flettet silke ikke-steril sutur (for navle Karle). Gør enkelt slips ved looping sutur som at indlede en firkantet knude eller binde en sko, som beskrevet tidligere11. Bemærk: enkeltbindinger er almindeligt lavet og opbevares i en Petri skål fyldt med et lille lag silikone gummi for at hjælpe med at arbejde på en klæbrig baggrund.</li>
	<li>Forbered 2 L fysiologisk saltopløsning (PSS), der indeholder, i mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2po4, 0,83 mgso4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2og 5,5 glucose. PH justeres til 7,40 ± 0,02 ved langsomt at tilsætte et par dråber syre (1 M saltsyre) eller base (1 N natriumhydroxid) til opløsningen og vente mindst 20 s, før man læser den justerede pH-måling. Opbevar PSS indtil den er klar til brug i køleskabet for at reducere kontaminering, men må ikke opbevares i mere end 2 uger.</li>
	<li>Mærke mikrocentrifuge rør til opsamling af "maternel" og "føtal" spildevand på hvert tidspunkt, dvs., "Mbase line, M10, M20,..." op til 180 minutters tidspunkt. Forbered det samme for føtale spildevand (Fbase, M10, M20,....).</li>
	<li>Kalibrer alt udstyr, der anvendes i systemet, herunder den cirkulerende bade temperatur og blodtryksmonitorer forbundet med opretholdelse af uterin (80 mmHg) og navlestrengen (50 mmHg) perfusattryk.</li>
	<li>Forbered et dissektions kammer (4 "diameter x 1" dyb) eller en cirkulerende varmer skål ved at fylde et lag (< 0,25 ") af silikone gummi. Denne modifikation skal ske på forhånd, og da det vil tage 12 − 24 timer for gummi til tørre. Bemærk: brug af et recirkulations varmer/kølende fad anbefales til nybegyndere kirurger, da skålen ikke vil bevæge sig, og vævet vil opretholde en ensartet temperatur.</li>
</ol>2. klargøring af Operations stationen og ækvilibrering af udstyr
<ol><li>Tænd alt udstyr, der understøtter perfusion-systemet, for at kontrollere, om det fungerer korrekt. Fjern PSS fra køling og varm til stuetemperatur. PSS vil blive brugt både som en perfusatet og en superfusate.</li>
	<li>Anbring en lille boblende sten for at levere en gasblanding til superfusatreservoiret. Almindeligt anvendte blandinger omfatter 21%o 2,8% o2, 3% o2og 0% o2. Tænd for gassen for at give små bobler til superfusate løsning. Juster levering af gas for at undgå sprøjt.</li>
	<li>Arranger dyret dissekere Station ved at kontrollere bedøvelsesmiddel, arrangere kirurgisk udstyr, og forberede sutur slips. Forbered det dissekende kammer ved at indsamle dissekere stifter, tænde for køleren (eller hente is) og fylde det dissekerede kammer (foret med gummi silikone) med koldt PSS.</li>
	<li>Fyld forsigtigt alle kamre, nåle, glas-Mikropipetter, slanger og reservoirer med varmet PSS, og se omhyggeligt efter og Eliminer luftbobler ved at udsuge dem med en pipette med fin spids overførsel. Drej alle 3-vejs Stophaner med "off" vendt mod pipettens retning for at sikre væsken i pipetten.</li>
	<li>Anbring et enkelt slips på hver af de to glas Mikropipetter, der er forberedt til livmoderkræft, og på de to stumpe spids nåle, der er beregnet til navle kanyler. Fastgør båndene til pipetterne og stumpe spids nåle for at undgå tab under kammer bevægelser (figur 1c).</li>
</ol>3. Placental høst
<ol><li>Anæstetize en gravid kvindelig rotte på gestationsdag 20 med 5% isofluran i ca 4 min eller indtil dyret udviser besværet vejrtrækning. Flyt dyret til næse keglen og Administrer 2,5% − 3% isofluran for at opretholde anæstesi. Bekræft bevidstløshed ved en mangel på tå pinch refleks. Bemærk: brugen af en rotte på gestationsdag 20 er præsenteret i denne protokol. Protokollen er dog den samme, hvis forsøgsbetingelserne kræver, at der foretages en placenta vurdering tidligere i gestationen.</li>
	<li>Identificere og isolere livmoder horn (højre eller venstre) af valg ved at løfte ud og sprede ud lang-måder uden for rotte slagtekroppen. Ved hjælp af en flettet silke sutur, binde livmoder pulsåre på æggestokkene ende og vaginal ende af Hornet. Inkluder æggestokkene indvendigt i suturen med livmoder Hornet.</li>
	<li>Ved hjælp af kirurgisk saks, punktafgifter væk livmoder horn ved at gøre nedskæringer på den proximale side af æggestokkene slips og distale side af vaginal slips, forlader livmoder horn bundet med suturer på begge ender. Livmoder Hornet overføres til den dissekerede skål foret med silikone gummi og fyldes med koldt (4 °C) PSS. Uanset om højre eller venstre horn er valgt, opretholde den samme side for udvælgelse i hvert forsøg for konsistens. Bemærk: ved føtale anæstesi holdes unger i iskold PSS. Derfor vedligeholdes PSS-temperaturen i det dissekerede kammer ved nedkølet cirkulations badet eller ved at dissekere kammeret holdes på is. Bemærk: på dette tidspunkt bedøvet dæmning kan være aflives pr laboratorium iacuc protokol godkendelse. I dette tilfælde sker eutanasi via pneumothorax (ved at skære diafragma) og fjernelse af moder hjertet.</li>
	<li>Skub forsigtigt en dissekat pind gennem livmoder Hornet ind i silikone gummi, med æggestokken til venstre og vaginal side til højre for at visualisere uterin Vaskulaturen. Dette vil stabilisere livmoderen og forhindre bevægelse af vævet under dissektion af fostrets rum. Vælg en moder-placenta-føtale enhed centralt til Hornet og fast livmoder arterie og vene med kirurgisk saks. Skær livmoder musklen proksimal og distale til den valgte placenta og foster. Livmoder musklen kan trækkes tilbage ved at trække den til siden; Det er vigtigt at efterlade det intakt, men trække det væk fra at dække fosteret pup. Bemærk: udvælgelsen af moder-placenta-føtale enheden bør baseres på længden af livmoder arterie segmentet på begge sider af arcuatarterie. Længere segmenter vil tillade en mere vellykket kanylering.</li>
	<li>Ved hjælp af fine pincetter og sakse fjernes Foster membranen fra moderkagen, idet man sørger for at undgå navlestrengen.</li>
	<li>Trævle og fast navlestrengen til at adskille fostrets hvalp.</li>
	<li>Identifikation af navle pulsåren (tykkere beholder) og vene (tyndere beholder). Marker navlestrengen for nem identifikation ved at skære den lidt kortere end navle pulsåren.</li>
	<li>Forsigtigt adskille navle pulsåre og vene fra hinanden.</li>
	<li>Hele placenta enheden, herunder livmoder Vaskulaturen, livmoder musklen, moderkagen og navlestrengen, kan skæres og fjernes.</li>
</ol>4. placenta perfusion
<ol><li>Bevar den anatomiske blodgennemstrømning, der bevarer den korrekte distale-til-proximale orientering af livmoder arterien, Anbring placenta enheden (bestående af livmoder Vaskulaturen, livmoder musklen, placenta og navlestrengen) i det modificerede isolerede beholder kammer fyldt med varmt, iltet PSS.</li>
	<li>Ved hjælp af et par fine pincet i hver hånd, kanylere de proximale og distale ender af uterin arterien på glas Mikropipetter.</li>
	<li>Fastgør livmoder pulsåren ved hjælp af det sterile sutur slips, der tidligere er sikret på mikropipetten. Bemærk: to-tie sløjfer (knude) kan være nødvendigt; men en enkelt slips loop giver mulighed for større justering.</li>
	<li>Kanylere navle pulsåren (føtal-til-maternel blodgennemstrømning) på den 23 G (større) nål og fastgør den med sort flettet silke sutur.</li>
	<li>Kanyler navlestrengen (maternel-til-føtalt blodgennemstrømning) på den 25 G (mindre) stump nål og fastgør den med sort flettet silke sutur.</li>
	<li>Flyt til placenta perfusion Station og Udfyld alle Stophaner og slanger for at forhindre luftbobler. Forbind alle slanger i henhold til figur 2.</li>
	<li>Anbring små veje både under den distale kanylering af maternel livmoder og kanylehætten af føtale navlestrengen for at fange det spildevand, der vil dukke op under proceduren.</li>
	<li>Tænd for den peristaltiske pumpe, trykregulator og tryk Monitor og Åbn stophanen for at tillade væske strømning gennem slangen mod tryk transduceren, men endnu ikke til placenta. Øg langsomt trykket til 80 mm Hg.</li>
	<li>Drej langsomt stophanen til placenta for at åbne og se for lækager inde i kammeret og omkring båndene. Bemærk: Hvis den peristaltiske pumpe kører ved høj hastighed, skal du revurdere den proksimale livmoder kanyle og bindebånd til væske lækager. Hvis de identificeres, skal der rettes op på lækager. Bemærk også, at mens det gennemsnitlige livmoder arterietryk forbliver konstant (indstillet til 80 mmHg), kan væske gennemstrømningen variere afhængigt af de vaskulære og placentale fysiologiske reaktioner. Kvantificering af væskestrømmen kan identificeres som en eksperimentel variabel som respons på xenobiotisk eksponering.</li>
	<li>Drej stophanen for at tillade væske strømning ind i navle pulsåren. Indstil trykket til ca. 50 mmHg, som kan implementeres med en peristaltisk pumpe (figur 3) eller en hydrostatisk kolonne.</li>
	<li>Genfyld alle reservoirer (livmoder, navle og superfusat) for at opretholde væskevolumen gennem hele eksperimentet. Bemærk: når perfusion er initieret og eksperimentet er i gang, kan bedøvelses unger, der er tilbage i den dissekterende skål, vurderes for levedygtighed ved at røre hvalpene med pincet for at fremkalde en neurologisk respons. Exsanguination af hvalpene vil ske gennem hysterektomi af uterin horn; yderligere eutanasi kan suppleres med godkendte IACUC-protokoller. I dette tilfælde, åbning af Foster sækken i den kolde PSS og skabe en pneumothorax ved at skære ribbenene.</li>
</ol>5. mock eksperiment
<ol><li>Efter kanylering og initiering af PSS perfusion skal vævene ækvilibrere i 30 minutter, så Vaskulaturen kan justeres til den nye væskestrøm. Opsug spildevandet med en pipette, og Gem det i et tilsvarende mærket mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>Efter ækvilibrering etableres baseline perfusion ved opsamling af spildevand i 10 min fra begge veje både i mikrocentrifugerør og ved måling af den væskemængde, der opstår gennem livmoder pulsåren og navlestrengen.</li>
	<li>Start prøveindsamlingen med 10 minutters intervaller ved at indsamle spildevand fra den distale livmoder arterie og navle blod vene. For eksempel, administrere en 900 μl bolt dosis af 20 Nm rhodamine-mærkede polystyren nanopartikler (8 x 1014 partikler/ml) suspenderet i 0,01% overfladeaktivt stof til linjen perfusing livmoder arterien til at identificere tidsforløbet passage af xenobiotiske nanopartikler på tværs af placentabarrieren. Bemærk: disse spildevands prøver vil gøre det muligt at måle kontaminanter i væsken (enten xenobiotisk, farmakologisk eller metabolitten) og angive hastigheden af væske strømme gennem livmoder pulsåren eller på tværs af placenta og ind i fostrets rum ( Figur 4).</li>
	<li>Efter infusion med bolte udtages prøver fra den distale livmoder arterie og føtale navlestrengen vene spildevand hver 10 min i alt 180 min efter infusion.</li>
</ol>6. rengøring af udstyret
<ol><li>Efter hvert eksperiment fjernes placenta enheden fra pipetterne. Alle suturer kan gemmes til genbrug i fremtidige eksperimenter. Placenta vævet kan gemmes til yderligere histologiske eller Mekanistiske undersøgelser.</li>
	<li>Rengør alle slanger og kanyle fra perfusions systemet med 70% ethanol efterfulgt af destilleret vand og vakuum tørrer. Bemærk: Hvis du begynder at misfarve eller synes at være beskadiget, skal du udskifte det inden næste forsøg. Yderligere, efter en eksperimentel kohorte er færdig (f. eks alle undersøgelser vedrørende en enkelt forurenende stof), erstatte alle slanger i kammeret for at forhindre krydskontaminering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism.">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li><li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta.">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li><li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+studies+with+radioactive+sugar.">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li><li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique.">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li><li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig.">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li><li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat.">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li><li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy.">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li><li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta:+methodology+and+validation.">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, (2006).</li><li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion.">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li><li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated,+Perfused+Microvessels.">Isolated, Perfused Microvessels.</a> Clinically Applied Microcirculation Research. , 435-456 (1995).</li><li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity.">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne perfusion metode giver mulighed for hurtig vurdering af placenta barriere og fysiologiske funktion af uterin Vaskulaturen og trofoblast lag. Kanylering og perfusion af de proximale til distale ender af moderen livmoder arterie simulerer fysiologi af mødres blodgennemstrømning gennem dette store fartøj er ansvarlig for at sende blod til det udviklende foster. Denne metode giver mulighed for fysiologisk vurdering af den isolerede maternel, placenta og navle karbilical vaskulatur, og derfor kan ændringer i fysiologi identificeres som vaskulær patologi; immun-og neurale innervationer fjernes i ex vivo-proceduren. For at sikre en korrekt evaluering er det derfor vigtigt at kanyle disse fartøjer omhyggeligt for ikke at skabe tårer eller punkteringer i fartøjs væggene og for at fjerne luftbobler. Gas emboli kan forårsage skade på endotel lag af Vaskulaturen eller blokere blodkar. Ved at opretholde de vaskulære forbindelser mellem livmoderen, placenta og foster under Dissection, evaluering af væske og translokation til fosteret kan observeres. Ved administration af en xenobiotisk, i dette tilfælde 20 Nm polystyren, kinetik til den distale ende af livmoder pulsåren og gennem placenta til fostrets rum kan evalueres ved analyse af spildevand over et tidsforløb på 180 minutter.
Mens en dual-perfusion model blev beskrevet, og overførslen af partikler og væske fra moderen til fostrets rum blev overvåget i denne artikel, kan vurderinger også foretages i omvendt fra fosteret til mødres rum. En af metoderne, der er beskrevet her, er, at den distale livmoder vene ikke blev kanyleret eller udtaget. I fremtidige undersøgelser, især dem fokuseret på føtal-til-moderen overførsel, det vil være vigtigt at kanyle og prøve det distale livmoder fartøj. De spildevand, der tages fra dette mock-eksperiment, blev anvendt til at vurdere xenobiotisk overførsel. der kan dog udføres en bred vifte af vurderinger vedrørende endokrine og molekylære placenta funktioner eller føtale ernæring.
Styrkerne i denne protokol opvejer langt de mindre begrænsninger. Præparatet opretholder den fysiologiske struktur og integriteten af et helt organ til at vurdere eksperimentelle forhold. Ex vivo placenta perfusion er en videnskabelig progression fra cellulær baseret in vitro til hele dyrs udsættelse for korrekt at bestemme reproduktiv risikovurdering. Dette kan anses for at være en værdifuld teknik til undersøgelser, der evaluerer placenta farmakologisk narkotika disposition, farmakokinetik, toksikologi, fysiologi, og maternel-føtale medicin.

Ved at opretholde morfologiske struktur og fysiologiske reaktionsevne har organ perfusion været en accepteret system-eller vævs baseret tilgang til analyse af metabolisk funktion. Disse perfusions teknikker giver mulighed for ex vivo undersøgelse af intakte vævsreaktioner på en række farmakologiske og mekaniske stimuli. Perfusion af human placenta blev oprindeligt beskrevet i 1958 for at identificere de hormonelle virkninger på den metaboliske aktivitet af citronsyrecyklus; tidligere er blevet identificeret i væv homogenater, har troen og Gordon erkendt behovet for at afklare endokrine aktivitet ved hjælp af en ny fysiologisk tilgang1. I samme æra, enkelt-perfusion (maternel-til-føtale eller føtale-til-Moder) strategier blev beskrevet i store2,3 og små4 dyremodeller til at forstå placentaoverførsel af sukker, salte, og antipyrin narkotika. In vivo og ex vivo Dual perfusion (koordineret maternel og føtal perfusion) teknikker blev beskrevet for yderligere at karakterisere placentaoverførsel ved hjælp af in vivo5 og ex vivo6,7,8 metodologier. Teknologiske fremskridt inden for transmission og scanning elektronmikroskopi tillod forskerne at verificere den strukturelle og funktionelle integritet af humane placenta væv efter perfusion9.
Mens perfusion af humane placenta væv og individuelle cotyledonarter er mest relevant, kræver den hurtige udvikling af farmakologiske agenser og miljøforurenende stoffer, at der anvendes en dyre perfusions model til tidlig screening af xenobiotiske over placentabarrieren. Denne placenta perfusion metode giver mulighed for evaluering af overførsel over placenta barriere ved hjælp af lettere opnåelige og fysiologisk relevant rotte placenta. Desuden kan væske strømme over placentabarrieren over en periode efter en eksponering evalueres ved at måle mængden af perfusat kommer fra navle pulsåren. I kraft af at tillade placenta perfusion fra både moder-og føtale cirkulationer, kan denne Dual-flow hele organ tilgang være fordelagtig i forhold til nuværende in vitro og in vivo tilgange. Denne metode gør det muligt at måle en xenobiotisk gennem det maternelle aspekt fra perfusat, som opstår over placenta gennem navlestrengen, eller omvendt. Den protokol, der præsenteres her, vil beskrive overførslen af 20 Nm polystyren (en almindelig nanoplastisk, der anvendes i fødevarer og medicinske produkter) fra moderen livmoder arterien til fostrets rum og et associeret fald i væske strømme over placenta for at illustrere anvendelsen af denne metode i flere fysiologiske, farmakologiske og toksikologiske indstillinger til at vurdere placentaoverførsel, metabolisme og fysiologiske ændringer, der påvirker maternel og/eller føtal flow.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile</td>
			<td>Surgical Specialties Look</td>
			<td>AACO805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cannula pack</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>GCP-75-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-serrated fine curved micro serrefine clamps</td>
			<td>InterFocus</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusate pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM795C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Mode PM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-heating single vessel chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>CH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>ModelPS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 23 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>04651-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 25 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>07116-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERILE Nylon Suture</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>T04A00N07-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Sedation Resource</td>
			<td>6-205-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Model TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo perfusion of the rodent placenta

Placenta er et centralt organ under graviditet, der fungerer som en barriere for føtalt xenobiotisk eksponering og formidler udveksling af næringsstoffer til affald. En analyse er beskrevet her for at perfuse en isoleret rotte placenta og vurdere den maternel-til-føtale translokation af xenobiotika ex vivo. Desuden kan vurderingen af fysiologiske processer såsom væske strømning til fosteret og placenta metabolisme udføres med denne metode. Denne teknik er velegnet til evaluering af maternel-til-føtale kinetik hos farmaceutiske kandidater eller miljøforurenende stoffer. I modsætning til de nuværende alternative tilgange gør denne metode det muligt at evaluere den isolerede maternel Foster vaskulatur, idet den systemiske neurale eller immun involvering fjernes, således at eventuelle observerede ændringer i fysiologisk funktion kan skyldes lokale faktorer i det isolerede væv.

Figur 5 viser de proof-of-princip eksperimenter ved hjælp af Evan blå farve, så vi kan teste systemet og visualisere passende væske og placenta barriere funktion og for at forhindre indeslutning overførsel til fostrets rum. Eve's blå farve nåede og fuldbrugte placenta vævet inden for dette system (figur 5a). Efter yderligere undersøgelser, er det klart, at Evans blå farve ikke kom ind i føtalt navlestrengen vene (figur 5b), som forventes som Evan blå farvestof er bundet til albumin.
Figur 6 viser data for det mock-eksperiment, der er beskrevet i denne protokol. Spildevandsprøverne fra den distale ende af livmoder pulsåren og føtale navlestrengen vene blev målt i hvert 10-minutters segment for at vurdere væskestrømmen over tid efter, at den daglige dosis blev administreret til moderen uterin arterien (figur 6). Reduceret væske overførsel til fostrets rum inden for 10 minutter efter infusion af polystyren blev identificeret. For at kvantificere overførslen af polystyren til fostrets rum i løbet af tidsforløbet, når det forekommer, blev 25 μL af den perfbrugte væske fra hvert tidspunkt anbragt i en 96 brønd plade i to eksemplarer for at måleprøve fluorescens. Fluorescens blev bestemt ved spektroskopisk aflæsning ved 546/575 nm (ex/EM) ved hjælp af en fluorescerende mikroplade læser. Polystyren overførsel til fostrets rum forekom inden for 10 minutter og toppede ved 20 minutter og fortsatte i 90 minutter (figur 6b).
Et undersæt af perfatært placenta væv blev gemt til histopatologi og morfologiske vurderinger. Vævene var formalin-faste og hematoxylinlegemer og eosin plettet og revideret af en bestyrelse certificeret veterinær patolog. Disse eksperter identificerede ingen strukturelle abnormiteter i indsamlingerne, som kun blev anvendt af PSS, eller PSS med den bolte-dosis af rhodamine-mærket polystyren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg"> Figur 1: det modificerede enkelt fartøjs kammer. A) en oversigt over det modificerede kammer. B) et nærbillede af de stumpe nåle, der er sikret i fartøjets kammer. Den røde pil angiver den termistor clips, der er blevet ændret for at holde nålene på plads til navle kanyler. C) et repræsentativt billede af de fire kanyler, der er forberedt til vævs kanyler. Røde pile peger på hver af de fire kanyler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg"> Figur 2: et nærmere billede af placenta perfusions kammeret. (A) Dette repræsenterer slangen, der er fastgjort til tryk transduceren, og kanyleret den proximale maternel livmoder arterie eller "tilstrømning". Trykket er indstillet til en konstant 80 mmHg som defineret af litteraturen. B) Dette repræsenterer kammer afløbs porten på superfusatet omkring placenta vævet under perfusion. (C) Dette repræsenterer kammerets tilstrømning af superfusatet til at bade placenta med opvarmet PSS under perfusion. (D) Dette repræsenterer den distale mødreuterine havn, hvor der kan opsamles spildevand fra uterin perfusion. E) Dette repræsenterer temperatur porten, hvor fartøjets kammer kan fastgøres til et termometer og varmelegeme for at opretholde en ensartet temperatur under hele forsøget. (F) Dette repræsenterer den navle arterie-kanylering. Navle pulsåren er under tryk til 50 mmHg for at give mulighed for modstrøms strømning på placenta niveau. (G) Dette repræsenterer navlestrengen vene spildevandsopsamling. Væske, der strømmer mod fostrets rum under perfusion, vil blive indsamlet her. (H) Dette er centrum for perfusions systemet, hvor placenta er kanyleret og vedligeholdt gennem perfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg"> Figur 3: en visning af placenta perfusions systemet. (A og B) det tryk kontrolsystem, der anvendes til at overvåge og vedligeholde 80 mmHg af perfusat gennem livmoder arterien. (C) Dette repræsenterer termo reguleringen af perfusions kammeret. D) mikroskop. E) perfusions kammer. (F) tyngdekraften-fodret med navlestrengen arterie perfusion indstillet til 50 mmHg. G) en peristaltisk pumpe, der bruges til at fylde og dræne placenta superfusate PSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg"> Figur 4: skematisk af placenta perfusions systemet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg"> Figur 5: repræsentative billeder af proof-of-princip eksperimenter ved hjælp af Evan blå farve. (A og B) proof-of-princip, at Evans blå vil afdramatisere livmoder vaskulatur, livmoder muskel, og placenta, men vil ikke krydse placentabarrieren på grund af albumin binding. Den grønne pil indikerer den blå venøse dræning fra placenta tilbage til moderens cirkulation. Den røde pil angiver navlestrengen vene udløb mod fostrets rum. Bemærk manglen på blåt farvestof. C) et repræsentativt billede af opsamling af spildevand fra navlestrengen. Den røde pil indikerer dråbedannelse før opsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg"> Figur 6: data udledt fra mock-eksperimentet. Fluorescens målinger af rhodamin-mærket polystyren nanomaterialer, normaliseret til baseline fluorescens, gennem indsamling af (a) uterin arterie og (B) føtale navlestrengen vene spildevand. Gennemsnitlig normaliseret til baseline-fluorescens ± standardfejl (SE). *: p < 0,05 og T: p < 0,1 via variansanalyse (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Her præsenteres en protokol af ex vivo maternel føtal vaskulær perfusion for at muliggøre indgift af en test artikel i maternel vaskulatur og for at evaluere placentaoverførsel af xenobiotiske partikler eller farmakologiske agenser ud over ændringer i placenta fysiologi.

Ex vivo perfusion af rodent placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

En vellykket anvendelse af disse teknikker vil gøre det muligt at foretage en kinetisk vurdering af farmakologiske forsøg eller passage af xenobiotiske kontaminanter gennem en morfologisk intakt moderkage. Gnaver placenta perfusion teknik tillader en højere gennemløb af farmakologiske eller toksikologiske undersøgelser, som flere forbindelser kan vurderes ved hjælp af væv af en enkelt dæmning. Demonstration af teknikken vil være Jeanine D'Errico, en ledende kandidat studerende fra mit laboratorium.Før proceduren påbegyndes, skal du forsigtigt fylde alle kamre, nåle, glasmikropipetter, slanger og reservoirer med opvarmet fysiologisk saltopløsning eller PSS, og fjern forsigtigt eventuelle luftbobler med en fin spids overførselspipette efter behov. Drej alle de tre vejs stophaner til off position for at sikre væsken i pipetter. Placer en enkelt slips på hver af de to glas mikropipetter forberedt til uterin cannulation og på de to stumpe spids nåle udpeget til navlestrengsdål.Derefter sikre båndene for at forhindre tab under kammerets bevægelser. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i en bedøvet gestationsdag 20 kvindelige gravide rotte, løft en livmoder horn fra maven og sprede hornet ud longways, uden for dyret. Brug flettet silke suturer til at binde livmoderarterien på vaginal og æggestokkene ender af hornet, herunder æggestokkene inde i suturen med livmoderen horn.Ved hjælp af kirurgisk saks, foretage indsnit på den proksimale side af æggestokkene slips og den distale side af vaginal slips. Overfør livmoderhornet i en dissekerende skål foret med silikonegummi og fyldt med kolde PSS. Med æggestokkene side til venstre og vaginal side til højre, forsigtigt skubbe en dissekerende pin gennem livmoderen horn i silikone gummi til at stabilisere livmoderen.Vælg en moderlig placenta føtal enhed centralt for hornet. Brug fine vicep og saks, fjerne fosterhinden fra fosterhinden af moderkagen passe på at undgå navlestrengen. Optrævle og ligate navlestrengen til at adskille føtal hvalp.Efter at have identificeret navlestrengen arterie og vene, forsigtigt adskille og ligte navlestrengen fartøjer. Skær derefter navlestrengen lidt kortere end navlestrengen arterie for nem identifikation. Og ligate livmoderarterien og venen med kirurgisk saks.Fastholdelse af den korrekte orientering af livmoderarterien anatomiske blodgennemstrømning, placere placentaenheden i den modificerede isolerede karkammer fyldt med varm iltet PSS under en dissekere mikroskop. Ved hjælp af et par fine kraftafpind i hver hånd, kanyler de proksimale og distale ender af livmoderarterien på glasset mikropipetter. Fastgør arterien tæt med den tidligere placerede sterile nylonsutur.Kanyler og fastgør navlestrengen på den 23 gauge stumpe nål. Derefter kannulate og fastgør navlestrengen vene på 25 gauge stump nål og opfylde alle de stophaner og rør for at forhindre luftbobler. Husk at kontrollere alle de stophaner, kanyler, og slanger for luftbobler, som en luft bolus i systemet vil føre til cellulære nød og fjerne counter strøm flow i moderkagen.Tilslut alle slangen i henhold til figuren. Placer små vejebåde under distal kannulation af moderens livmoderarterie og under nålen kanylenulation af fosterets navlestrengen for at fange det spildevand, der vil opstå i løbet af proceduren. Opsamlingspladen klargørs til senere analyse.Åbn stophanen for at tillade væskestrøm gennem slangen mod moderkagen og tænd for peristaltisk pumpe, trykkontrol og trykmonitor. Langsomt øge trykket til 80 millimeter kviksølv læses på trykmonitoren. Åbn langsomt stophanen for at tillade væskeflow til livmoderarterien.Genopfyld alle reservoirerne for at opretholde væskevolumenet under hele eksperimentet. Når vævene er ækvilibreret i 30 minutter for at gøre det muligt for vaskulaturen at tilpasse sig den nye væskestrøm, etableres baselineperfusionen ved at opsamle spildevand i 10 minutter fra begge vejebådene. Mål mængden af væske, der opstår gennem livmoderarterien og navlestrengen.Ved afslutningen af basisindsamlingsperioden administreres forsøgsbehandlingen i livmoderarterien. Derefter indsamles prøver fra den distale uterusarterie og føtale navlestrengsoprivningsudspænning hver 10. Mål de forurenende stoffer i væskeprøverne.Perfusion med Evans blå farvestof til at teste systemet og til at visualisere den relevante væske og placenta barriere funktion til at forhindre forurenende overførsel til fosterrummet afslører, at farvestoffet nåede og perfunderes placenta væv i dette system. Ved nærmere undersøgelse, er det klart, at Evans blå farvestof ikke ind i føtale navlestrengen, som forventes, da Evans blå farvestof er bundet til albumin. I dette repræsentative eksperiment blev der identificeret en reduceret væskeoverførsel til fosterrummet inden for 10 minutter efter polystyreninfusion.Polystyrenoverførslen til fosterrummet toppede derefter efter 20 minutter og fortsatte i 90 minutter. Det vigtigste at huske under kanylen er at gå langsomt. Pipetter og væv er meget sarte og kan nemt blive brudt eller revet.Ved vejning af spildevandet kan denne metode anvendes til at undersøge placentafysiologi samt materialetranslokation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering af en klinisk relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Model for Undersøgelse Epithelial Wound Reparation i en Native mikromiljø

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Brug<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright dråbedistribution Kulturer af Whole Fetal organer til at studere udviklingsprocesser under Mus Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Kultur Chick cerebellare Skiver og Rumligt Målrettet Elektroporation af granulat celleforstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardial Udvækst Kultur Assay og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Vurdering af Epikardial-afledt cellemigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolation og udvidelse af mesenchymstamceller / stromacellers afledt af humane Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende mærkning af mikrotubuli og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmens væv og 3D In Vitro tarm Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...