Name: ex vivo perfusion of the rodent placenta
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Environmental Health Sciences (r00-ES024783), Rutgers Center for miljømessige eksponeringer og sykdom (P30-ES005022), og Rutgers joint Graduate program i toksikologiske (T32-ES007148). Vi vil også gjerne takke DRS. Michael Goedken, Marianne Polunas, og Pedro Louro for deres tekniske ekspertise og Dr. Adam goodwill for hans hjelp i å designe vårt skjematisk (figur 5).

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee of Rutgers University.
1. forberedelser før eksperimentet
Merk: disse trinnene kan utføres i løpet av dager/uker før eksperimentet.
<ol><li>Endre fartøy kammeret. Merk: figur 1a, B viser det modifiserte enkelt fartøy kammeret.<ol>
<li>Beveg termistor sensoren under klemmen og bøy den slik at den henger fritt i et badekar (figur 1B).</li>
		<li>Installer to 4-tommers Butt-tip rustfritt stål nåler med standard luer tilkobling huber, 1 25 G og 1 23 G sikret under termistor klippet og tilsett en 3-veis stopcock for å muliggjøre kanyleringen av navle blodkar (figur 1B). Merk: de luer tilkoblingene til forskjellige måle størrelser er fargekodet. Dette gjør det enklere å identifisere fartøy under og etter eksperimentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter to Mikropipetter med 70 − 100 μm glass. Hvis du vil ha mer informasjon om disse prosedyrene, kan du lese følgende referanser10,11. Merk: diameteren på tuppen som vanligvis brukes i disse eksperimentene er i området 70 − 100 μm. tip-diametre som er større enn dette området, kan føre til vanskeligheter i kanyleringen prosessen, mens spissdiameter som er mindre enn 60 μm kan punktering av vaskulær veggen under kanyleringen.</li>
	<li>Forbered bånd fra steril nylon Sutur (for proksimale og klare endene av livmor arterien) og fra svart flettet silke ikke-sterile Sutur (for navle rene). Lag enkelt bånd ved looping Sutur som å starte en firkantet knute eller knytte en sko, som beskrevet tidligere11. Merk: single bånd er vanligvis laget og oppbevares i en Petri parabol fylt med et lite lag av silikon gummi for å hjelpearbeidet med en klebrig bakgrunn.</li>
	<li>Forbered 2 L av fysiologisk saltløsning (PSS) som inneholder, i mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2og 5,5 glukose. Juster pH til 7,40 ± 0,02 ved langsomt å tilsette noen dråper syre (1 M saltsyre) eller Base (1 N natriumhydroksid) til løsningen og vent minst 20 s før du leser den justerte pH-målingen. Oppbevar PSS til klar for bruk i kjøleskapet for å redusere forurensning, men ikke Oppbevar i mer enn 2 uker.</li>
	<li>Label mikrosentrifugen rør for innsamling av "mødre" og "Foster" utslipp på hvert tidspunkt, dvs., "MBaseline, M10, M20,..." opp til 180 min timepoint. Forbered det samme for Foster utslipp (FBaseline, M10, M20,....).</li>
	<li>Kalibrer alt utstyr som brukes i systemet, inkludert sirkulerende bad temperatur og blodtrykksmålere forbundet med å opprettholde livmor (80 mmHg) og navle (50 mmHg) perfusate press.</li>
	<li>Forbered et disseksjon kammer (4 "diameter x 1" dyp) eller en sirkulerende varmekilde parabolen ved å fylle et lag (< 0,25 ") av silikon gummi. Denne endringen må gjøres på forhånd og som det vil ta 12 − 24 t for gummi til tørk. Merk: bruk av en resirkulering Varmeapparat/Chilling parabolen er anbefalt for uerfarne kirurger, som parabolen ikke vil flytte og vevet vil opprettholde en konsistent temperatur.</li>
</ol>2. utarbeidelse av kirurgisk stasjon og likevekts av utstyr
<ol><li>Slå på alt utstyr som støtter systemet for å kontrollere om det er riktig funksjon. Fjern PSS fra kjøling og varm til romtemperatur. PSS vil bli brukt både som perfusate og superfusate.</li>
	<li>Plasser en liten boblende stein for å levere en gassblanding inn i superfusate reservoaret. Ofte brukte blandinger inkluderer 21% O2, 8% o2, 3% O2, og 0% o2. Slå på gassen for å gi små bobler til superfusate løsning. Juster leveringen av gass for å unngå sprut.</li>
	<li>Ordne dyret dissekere stasjonen ved å sjekke bedøvelse, arrangere kirurgisk utstyr, og forbereder Sutur bånd. Forbered dissekere kammeret ved å samle dissekere pinner, slå på chiller (eller henting av is), og fylle dissekere kammeret (foret med gummi silikon) med kaldt PSS.</li>
	<li>Forsiktig fylle alle kamre, nåler, glass Mikropipetter, slange, og reservoarer med varmet PSS, nøye ser for og eliminerer luftbobler ved å utsuging dem ut med en fin spiss overføring pipette. Slå alle 3-veis manifoldventiler med "av" mot retningen av pipette for å sikre væsken i pipette.</li>
	<li>Plasser et enkelt slips på hver av de to glass Mikropipetter forberedt for livmor kanyleringen og på de to Butt spissen nåler utpekt for navle kanyleringen. Sikre bånd til Pipetter og stumpe spisser for å hindre tap under kammer bevegelser (figur 1C).</li>
</ol>3. høsting av placenta
<ol><li>Bedøve en gravid kvinnelig rotte på svangerskaps dag 20 med 5% isoflurane i ca 4 min eller til dyret utstillinger anstrengt pust. Flytt dyret til nese membranen og administrer 2,5% − 3% isoflurane for å opprettholde anestesi. Bekreft bevisstløshet ved en mangel på tå klype refleks. Merk: bruk av en rotte på svangerskaps dag 20 er presentert i denne protokollen. Men protokollen forblir den samme hvis eksperimentelle forhold krever placenta for å finne sted tidligere i svangerskapet.</li>
	<li>Identifiser og Isoler livmor Hornet (høyre eller venstre) av valget ved å løfte ut og spre ut lange veier utenfor rotte stammen. Ved hjelp av en flettet silke Sutur, tie av livmor arterien ved eggstokken slutten og vaginal enden av hornet. Inkluder eggstokken inne i Sutur med livmor Hornet.</li>
	<li>Ved hjelp av kirurgisk saks, avgiftsdirektoratet bort livmor horn ved å gjøre kutt på den proksimale siden av eggstokken slips og den fjerne siden av vaginal slips, forlater livmor Hornet bundet av med sting i begge ender. Overfør livmor Hornet inn i dissekere rett foret med silikon gummi og fylt med kaldt (4 ° c) PSS. Uansett om høyre eller venstre horn er valgt, opprettholde den samme siden for valg i hvert eksperiment for konsistens. Merk: for fosterets anestesi, valper holdes i iskaldt PSS. Derfor er PSS temperatur innenfor dissekere kammeret opprettholdes av kjølt sirkulerende bad eller dissekere kammer bør holdes på isen. Merk: på dette punktet anesthetized demningen kan være euthanized per laboratorium IACUC protokollen godkjenning. I dette tilfellet skjer dødshjelp via pneumotoraks (ved å kutte membranen) og fjerning av mors hjerte.</li>
	<li>Skyv forsiktig en dissekere PIN gjennom livmor Hornet i silikon gummi, med eggstokken side til venstre og vaginal side til høyre for å visualisere livmor blodkar. Dette vil stabilisere livmoren og hindre bevegelse av vevet under Disseksjon av fosterets kupé. Velg en mors-placenta-fosterets enhet sentralt i Hornet og ombinde livmor arterien og vene med kirurgisk saks. Skjær livmor muskel proksimale og til den valgte morkaken og fosteret. Livmor muskelen kan trekkes tilbake ved å trekke den til siden; Det er viktig å la den intakt, men trekke den bort fra dekker fosterets valp. Merk: valg av mors-morkaken-fosterets enhet bør være basert på lengden av livmor arterien segmentet på hver side av arcuate arterien. Lengre segmenter vil tillate mer vellykket kanyleringen.</li>
	<li>Ved hjelp av fin tang og saks, fjerne fostervann membran fra fosterets overflate av morkaken, ta vare for å unngå navlestrengen.</li>
	<li>Løse og ombinde navlestrengen for å skille den fosterets valp.</li>
	<li>Identifiser navle arterien (tykkere fartøy) og vene (tynnere fartøy). Merk navlestrengen for enkel identifisering ved å kutte den litt kortere enn navle arterien.</li>
	<li>Forsiktig skille navle arterien og vene fra hverandre.</li>
	<li>Hele placenta enhet inkludert livmor blodkar, livmor muskel, morkaken, og navlestreng, kan kuttes og fjernes.</li>
</ol>4.
<ol><li>Opprettholde anatomisk blodstrøm beholde korrekt proksimale orientering av livmor arterien, plasserer placenta enhet (sammensatt av livmor blodkar, livmor muskel, placenta og navlestreng) i den modifiserte isolerte fartøyet kammer fylt med varm, oksygenert PSS.</li>
	<li>Ved hjelp av et par fine tang i hver hånd, kannelerer de proksimale og klare endene av livmor arterien på glass Mikropipetter.</li>
	<li>Tett sikre livmor arterien ved hjelp av steril nylon Sutur tie tidligere sikret på micropipette. Merk: to-tie løkker (knute) kan være nødvendig; men en enkelt tie loop gir større justering.</li>
	<li>Kannelerer navle arterien (fosterets til mors blodstrøm) på den 23 G (større) nål og fest den med svart flettet silke Sutur.</li>
	<li>Kannelerer den navle vene (mors-til-Foster blodstrøm) på 25 G (mindre) Butt nål og fest den med svart flettet silke Sutur.</li>
	<li>Flytt til tilbakefylling og alle manifoldventiler og slanger for å forhindre luftbobler. Koble alle slanger i henhold til figur 2.</li>
	<li>Plasser små veie båter under den kanyleringen av mors livmor arterie og nålen kanyleringen av fosterets navle vene for å fange avløpsvannet som vil dukke opp under inngrepet.</li>
	<li>Slå på peristaltisk pumpe, trykk kontroller, og trykk Monitor og åpne stopcock å tillate væske strømme gjennom slangen mot trykk svingeren, men ennå ikke til morkaken. Øk trykket langsomt til 80 mm HG.</li>
	<li>Sakte slå stopcock til morkaken å åpne og se etter lekkasjer inne i kammeret og rundt båndene. Merk: Hvis peristaltisk pumpen kjører i høy hastighet, revurdere proksimale livmor kanyleringen og bånd for væske lekkasjer. Hvis identifisert, må lekkasjer rettes. Merk også, mens gjennomsnittlig livmor arterien trykket vil forbli konstant (satt til 80 mmHg), kan væske strømningshastigheten være variabel avhengig av vaskulær og placenta fysiologiske reaksjoner. Kvantifisering av væskestrømmen kan identifiseres som en eksperimentell variabel som respons på xenobiotic oval eksponering.</li>
	<li>Drei stopcock for å la væske strømme inn i navle arterien. Sett trykket til ca 50 mmHg, som kan implementeres med en peristaltisk pumpe (Figur 3) eller en hydrostatisk kolonne.</li>
	<li>Fyll på alle reservoarer (livmor, navle og superfusate) for å opprettholde væske volum gjennom hele eksperimentet. Merk: Når har blitt initiert og eksperimentet er i gang, anesthetized valper igjen i dissekere parabolen kan vurderes for levedyktighet ved å berøre valpene med tang for å lokke fram en nevrologisk respons. Exsanguination av det pups ville finnes igjennom hysterektomi av livmor horn; Videre dødshjelp kan gjennomføres gjennom godkjente IACUC protokoller. I dette tilfellet, åpne fostervann sac i kulden PSS og skape en pneumotoraks ved å kutte ribbeina.</li>
</ol>5. mock eksperiment
<ol><li>Etter kanyleringen og initiering av PSS, la vev likevekt i 30 min slik at blodkar kan justeres til den nye væskestrømmen. Sug opp avløpsvannet av en pipette og lagre den i en tilsvarende merket mikrosentrifugen tube.</li>
	<li>Etter likevekts, etablere Baseline, ved å samle utslipp i 10 minutter fra både veie båter i mikrosentrifugen rør og måle volumet av væske som kommer gjennom livmor arterien og navle vene.</li>
	<li>Initiere sample samling på 10-minutters intervaller ved å samle utslipp fra den opp-og navle vene. For eksempel kan du administrere en 900 μL bolus dose på 20 NM rhodamine-merket polystyren nanopartikler (8 x 1014 partikler/ml) suspendert i 0,01% overflateaktivt middel til linjen perfusing livmor arterien å identifisere tid kurs passering av xenobiotic oval nanopartikler over placenta. Merk: disse avløpsvann prøvene vil tillate måling av forurensninger i væsken (enten xenobiotic oval, Pharmacologic, eller metabolitten) og gi hastigheten av væske strømme gjennom livmor arterien eller på tvers av placenta og inn i fosterets kupé ( Figur 4).</li>
	<li>Etter bolus infusjon, samle prøver fra den som kan tas av livmor arterien og fosterets kontrollkabel vene avløpsvann hver 10 min for totalt 180 min etter infusjon.</li>
</ol>6. rengjøring av utstyret
<ol><li>Fjern enheten fra Pipetter etter hvert eksperiment. Alle sting kan lagres å bli gjenbrukt i fremtidige eksperimenter. Placenta kan lagres for ytterligere histologiske eller mekanistisk studier.</li>
	<li>Rengjør alle slanger og kanyler i systemet med 70% etanol etterfulgt av destillert vann og vakuum tørt. Merk: Hvis slanger eller Pipetter begynner å misfarges eller vises skadet, må du bytte før neste eksperiment. Videre, etter at en eksperimentell kohort er fullført (for eksempel alle studier knyttet til en enkelt miljøgifter), erstatte alle slanger i kammeret for å hindre krysskontaminering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism.">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li><li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta.">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li><li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+studies+with+radioactive+sugar.">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li><li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique.">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li><li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig.">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li><li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat.">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li><li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy.">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li><li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta:+methodology+and+validation.">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, (2006).</li><li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion.">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li><li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated,+Perfused+Microvessels.">Isolated, Perfused Microvessels.</a> Clinically Applied Microcirculation Research. , 435-456 (1995).</li><li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity.">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne metoden gir mulighet for rask vurdering av placenta og fysiologisk funksjon av livmor blodkar og trophoblast lag. Kanyleringen og blod av proksimale å ende endene av mors livmor arterien simulerer fysiologi av mors blodstrøm gjennom denne store fartøyet ansvarlig for å sende blod til utviklingsland fosteret. Denne metodikken gjør det mulig for fysiologisk evaluering av den isolerte mors, placenta og navle blodkar, og derfor endringer i fysiologi kan identifiseres som vaskulær patologi; immunforsvaret og nevrale innervations fjernes i ex-vivo-prosedyren. For å sikre riktig vurdering, er det derfor avgjørende å kannelerer disse fartøyene nøye som å ikke lage noen tårer eller punktering i fartøyet vegger, og for å fjerne luftbobler. Gass lungeemboli kan forårsake skade på det endothelial laget i blodkar eller hindre blodkar. Ved å opprettholde den vaskulære forbindelser mellom livmoren, morkaken og fosteret under disseksjon, kan evalueringen av væske og translokasjon til fosteret observeres. Med administrasjonen av en xenobiotic oval, i dette tilfellet 20 NM polystyren, Kinetics til den den andre enden av livmor arterien og gjennom morkaken til fosterets kupé kan evalueres ved analyse av utslipp over en tid løpet av 180 minutter.
Mens en dual-modell ble beskrevet og overføring av partikler og væske fra mors til Foster rommet ble overvåket i denne artikkelen, kan vurderinger også gjøres i revers fra fosterets til mors rom. En begrensning av metoden som er beskrevet her er at den opp-og livmor venen ikke ble kanylert eller samplet. I fremtidige studier, spesielt de som fokuserte på Foster-til-mors overføring, vil det være viktig å kannelerer og prøve den Oppgående livmor fartøyet. Utslipp tatt fra dette mock eksperimentet ble brukt til å vurdere xenobiotic oval overføring; Det kan imidlertid utføres et bredt utvalg av vurderinger som gjelder endokrine og molekylære placenta eller Foster ernæring.
Styrkene av denne protokollen langt oppveier sine mindre begrensninger. Forberedelsene opprettholder den fysiologiske strukturen og integriteten til et helt organ for å vurdere eksperimentelle forhold. Ex vivo placenta er en vitenskapelig progresjon fra mobilbasert in vitro til hele dyre eksponering for å bestemme riktig reproduksjons risikovurdering. Dette kan anses å være en verdifull teknikk for studier evaluere placenta Pharmacologic narkotika disposisjon, farmakokinetikken, toksikologiske, fysiologi, og mors-Foster medisin.

Ved å opprettholde morfologiske struktur og fysiologiske respons, har orgel, vært en akseptert system-eller vev-basert tilnærming for å analysere metabolsk funksjon. Disse metoder for å gi ex vivo undersøkelse av intakt vev reaksjoner på en rekke farmakologiske og mekaniske stimuli. Av menneskelig placenta ble opprinnelig beskrevet i 1958 for å identifisere hormonelle effekter på metabolsk aktivitet i sitronsyre syklusen; har tidligere blitt identifisert i vev homogenater, troen og Gordon erkjent behovet for å avklare endokrine aktivitet ved hjelp av en roman fysiologisk tilnærming1. På samme tid, en enkelt-modell (mødre-til-Foster eller Foster-til-mødre) strategier ble beskrevet i store2,3 og små4 dyremodeller å forstå placenta overføring av sukker, salter, og antipyrin narkotika. Teknikker for bruk i vivo og ex vivo (koordinert mors og fosterets) ble beskrevet for ytterligere å karakterisere placenta ved hjelp av in vivo5 og ex vivo6,7,8 -metoder. Teknologiske fremskritt innen overføring og skanning av elektron mikroskopi tillot forskerne å verifisere den strukturelle og funksjonelle integriteten til menneskelig placenta etter å ha fått9.
Mens mengden av humant placenta og individuell cotyledon er mest relevant, nødvendiggjør den raske utviklingen av farmakologiske midler og miljøgifter bruk av en modell for dyremodeller for tidlig screening av xenobiotic oval overføring over placenta barrieren. Denne metoden gir mulighet for evaluering av overføring på tvers av placenta ved hjelp av lettere oppnåelige og fysiologisk relevante rotte placenta. I tillegg væske strømme over placenta barrieren over en periode etter en eksponering kan evalueres ved å måle volumet av perfusate som kommer fra navle arterien. I kraft av å tillate placenta fra både mors og Foster opplag, kan denne tilnærmingen med dobbelt flyt hele organ være en fordel sammenlignet med nåværende in vitro-og in vivo-tilnærminger. Denne metoden gjør det mulig for administrasjonen av en xenobiotic oval gjennom mors aspektet skal måles fra perfusate som fremkommer over morkaken gjennom navle vene, eller vice versa. Protokollen som presenteres her vil beskrive overføring av 20 NM polystyren (en vanlig nanoplastic som brukes i mat og medisinske produkter) fra mors livmor arterien til fosterets kupé og en tilknyttet nedgang i væske strømme over morkaken å illustrere Bruk av denne metoden i flere fysiologiske, farmakologiske og toksikologiske innstillinger for å vurdere overføring av placenta, metabolisme og fysiologiske endringer som påvirker mors-og/eller Foster flyt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile</td>
			<td>Surgical Specialties Look</td>
			<td>AACO805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cannula pack</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>GCP-75-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-serrated fine curved micro serrefine clamps</td>
			<td>InterFocus</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusate pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM795C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Mode PM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-heating single vessel chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>CH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>ModelPS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 23 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>04651-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 25 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>07116-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERILE Nylon Suture</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>T04A00N07-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Sedation Resource</td>
			<td>6-205-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Model TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo perfusion of the rodent placenta

Den morkaken er et sentralt organ under graviditet som fungerer som en barriere for fosterets xenobiotic oval eksponering og formidler utveksling av næringsstoffer for avfall. En analysen er beskrevet her for å perfuse en isolert rotte placenta og evaluere mødre-til-fosterets translokasjon av xenobiotics ex vivo. I tillegg kan evalueringen av fysiologiske prosesser som væskeflyt til fosteret og placenta metabolisme gjennomføres med denne metodikken. Denne teknikken er egnet for å evaluere mødre-til-Foster Kinetics av farmasøytiske kandidater eller miljøgifter. I motsetning til dagens alternative tilnærminger, gjør denne metodikken evalueringen av den isolerte mors-fosterets blodkar, med systemisk nevrale eller immune engasjement fjernet, slik at eventuelle observerte endringer i fysiologisk funksjon skal knyttet til lokale faktorer i det isolerte vevet.

Figur 5 viser proof-of-prinsippet eksperimenter med Evan ' s Blue Dye, slik at vi kan teste systemet og visualisere riktig væske og placenta barrierefunksjon og for å hindre forvaring overføring til fosterets kupé. Den Evan ' s blå fargestoff nådd og perfusert vevet i morkaken i dette systemet (figur 5a). Ved nærmere undersøkelse, er det klart at Evan blå fargestoff ikke inn i fosterets navle vene (figur 5B), som er forventet som Evan ' s Blue Dye er bundet til albumin.
Figur 6 viser data for mock eksperimentet beskrevet i denne protokollen. Avløps prøver fra den andre enden av livmor arterien og kontrollkabel vene ble målt ved hvert 10-minutters segment for å evaluere væskestrømmen over tid etter at bolus-dosen ble gitt til livmor arterien på mors fronten (figur 6). Redusert væske overføring til fosterets kupé innen 10 minutter etter polystyren infusjon ble identifisert. Å kvantifisere overføring av polystyren til fosterets kupé i løpet av tiden kurset når det skjer, 25 μL av perfusert væske fra hver gang punktet ble plassert i en 96 brønn plate i duplikat for å måle prøven fluorescens. Fluorescens ble bestemt av spektroskopiske lesing ved 546/575 NM (ex/EM) ved hjelp av en fluorescerende mikroplate leser. Polystyren overføring til Foster rommet skjedde i løpet av 10 minutter og nådde 20 minutter og fortsatte i 90 minutter (figur 6b).
En undergruppe av perfusert placenta ble lagret for histopatologi og morfologiske vurderinger. Vevet var formalin-faste og hematoksylin og eosin beiset og gjennomgått av et styre sertifisert veterinær patologen. Disse ekspertene identifiserte ingen strukturelle misdannelser i placentas perfusert av bare PSS, eller PSS med bolus dose av rhodamine-merket polystyren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg"> Figur 1: den modifiserte enkelt fartøy kammeret. (A) en oversikt over det modifiserte kammeret. (B) et nærbilde av de Butte nålene som er festet i fartøy kammeret. Den røde pilen indikerer termistor klips som har blitt endret for å holde nålene på plass for navle kanyleringen. (C) et representativt bilde av de fire kanyler forberedt for vev kanyleringen. Røde piler peker til hver av de fire kanyler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg"> Figur 2: en nærmere visning av kammer kammeret i placenta. (A) Dette representerer slangen festet til trykkgiveren og kanylert den proksimale mors livmor arterien, eller "tilsig". Trykket er satt til en konstant 80 mmHg som definert av litteraturen. (B) Dette representerer kammer drenerings porten på superfusate rundt placenta. (C) Dette representerer kammeret tilsig av superfusate å bade morkaken med varmet PSS under. (D) Dette representerer den den som er den andre mors livmor porten hvor avløpsvann fra livmor kan samles. (E) Dette representerer temperatur porten, der fartøyets kammer kan festes til et termometer og Varmeapparat for å opprettholde en jevn temperatur gjennom hele eksperimentet. (F) Dette representerer navle arterie kanyleringen. Navle arterien er trykksatt til 50 mmHg å tillate for motstrøm flyt på nivået av morkaken. (G) Dette representerer navle vene avløpsvann samlingen. Væske som strømmer mot Foster rommet under (H) Dette er midten av system systemet, der morkaken kanylert og vedlikeholdes gjennom <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg"> Figur 3: en visning av systemet for placenta. (A og B) Trykk reguleringssystemet som brukes til å overvåke og vedlikeholde 80 mmHg av perfusate gjennom livmor arterien. (C) Dette representerer Termo-reguleringen av (D) mikroskop. (E) kammer. (F) gravitasjon-matet navle arterie sett ved 50 mmHg. (G) en peristaltisk pumpe som brukes til å fylle og drenere PLACENTA superfusate PSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg"> Figur 4: skjematisk fremstilling av et system for placenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg"> Figur 5: representative bilder av bevis-av-prinsippet eksperimenter med Evan ' s Blue Dye. (A og B) proof-of-prinsippet om at Evan ' s blå vil perfuse livmor blodkar, livmor muskel, og morkaken men vil ikke krysse placenta barrieren på grunn av albumin bindende. Den grønne pilen indikerer den blå venøs drenering fra morkaken tilbake til mors sirkulasjon. Den røde pilen indikerer navle vene avløpsvann mot fosterets kupé. Legg merke til mangelen på blått fargestoff. (C) et representativt bilde av å samle avløpsvann drenering fra navle vene. Den røde pilen indikerer dråpe formasjon før oppsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg"> Figur 6: data avledet fra mock eksperimentet. Fluorescens målinger av rhodamine-merket polystyren nanomaterialer, normalisert til Baseline fluorescens, gjennom innsamling av (A) livmor arterien og (B) fosterets navle vene utslipp. Gjennomsnittlig normalisert til Baseline fluorescens ± standard feil (SE). *: p < 0,05 og T: p < 0,1 via analyse av varians (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Her presenteres en protokoll av ex vivo mors-fosterets vaskulær å muliggjøre administrasjon av en test artikkel i mors blodkar og for å evaluere placenta overføring av xenobiotic oval partikler eller farmakologiske midler i tillegg til endringer i placenta.

Ex vivo av den gnager placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

En vellykket anvendelse av disse teknikkene vil tillate kinetisk evaluering av farmakologiske studier eller passering av xenobiotiske forurensninger gjennom en morfologisk intakt placenta. Gnagermorkaken perfusjonsteknikken gir en høyere gjennomstrømning av farmakologiske eller toksikologiske studier, da flere forbindelser kan vurderes ved hjelp av vevet til en enkelt demning. Viser teknikken vil være Jeanine D'Errico, en senior graduate student fra laboratoriet mitt.Før du begynner prosedyren, fyll forsiktig alle kamrene, nålene, glassmikropipetter, rør og reservoarer med oppvarmet fysiologisk saltløsning eller PSS, og fjern forsiktig eventuelle luftbobler med en fin tippet overføringpipette etter behov. Vri alle de treveis stoppekranene til av-posisjon for å feste væsken i pipettene. Plasser et enkelt slips på hver av de to glassmikropipettene forberedt for livmorkanyling og på de to stumpe spissnålene utpekt for navlestrengkanyle.Deretter sikre båndene for å hindre tap under kammeret bevegelser. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme i en bedøvet svangerskapsdag 20 kvinnelig gravid rotte, løft ett livmorhorn fra magen og spre hornet ut langs, utenfor dyret. Bruk flettede silkesuturer for å knytte av livmorarterien på vaginale og ovarieender av hornet, inkludert eggstokken inne i suturen med livmorhornet.Ved hjelp av kirurgisk saks, gjør snitt på den proksimale siden av eggstokkslipset og den distale siden av vaginalslipset. Overfør livmorhornet til en disseksjonsfat foret med silikongummi og fylt med kald PSS. Med eggstokksiden til venstre og vaginalsiden til høyre, skyv forsiktig en dissekeringspinne gjennom livmorhornet inn i silikongummien for å stabilisere livmoren.Velg en mors placenta fosterenhet sentralt til hornet. Ved hjelp av fine tang og saks, fjern fostermembranen fra fosteroverflaten på morkaken som tar vare på å unngå navlestrengen. Rakne og ligate navlestrengen for å skille fostervalpen.Etter å ha identifisert navlestrengen og venen, separer forsiktig og ligat navlestrengkarene. Deretter kutter navlestrengvenen litt kortere enn navlestrengarterien for enkel identifisering. Og ligate livmorarterien og venen med kirurgisk saks.Opprettholde riktig orientering av livmorarterien anatomisk blodstrøm, plasser placentaenheten i det modifiserte isolerte karkammeret fylt med varmt oksygenert PSS under et dissekeringsmikroskop. Ved hjelp av ett par fine tang i hver hånd, kanylere de proksimale og distale endene av livmorarterien på glassmikropipettene. Fest arterien tett med den tidligere plasserte sterile nylonsugen.Kanylere og fest navlestrengarterien på den 23 gauge stumpe nålen. Deretter kanyle og sikre navlestrengvenen på den 25 gauge stumpe nålen og fyll alle stoppekranene og rørene for å forhindre luftbobler. Husk å sjekke alle stoppekraner, kanyler og rør for luftbobler, da en luftbolus i systemet vil føre til cellulær nød og eliminere motstrømstrømmen i morkaken.Koble til alle slangene i henhold til figuren. Plasser små veiebåter under distale hermetikk av mors livmorarterie og under nålekanyleringen av fosteret navlestrengen for å fange avløpsvannet som vil dukke opp i løpet av prosedyren. Forbered oppsamlingsplaten for avløpsvannet for senere analyse.Åpne stoppekranen for å tillate væskestrøm gjennom slangen mot morkaken og slå på den peristaltiske pumpen, trykkkontrollen og trykkmonitoren. Øk trykket langsomt til 80 millimeter kvikksølv som leses på trykkmonitoren. Åpne langsomt stoppekranen for å tillate væskestrøm til livmorarterien.Påfyll alle reservoarene for å opprettholde væskevolumet gjennom hele eksperimentet. Etter at vevet har likevekt i 30 minutter for å tillate vaskulaturen å tilpasse seg den nye væskestrømmen, etablere baseline perfusjon ved å samle avløpsvann i 10 minutter fra begge veiebåtene. Mål volumet av væske som oppstår gjennom livmorarterien og navlestrengvenen.På slutten av baseline samlingsperioden, administrere eksperimentell behandling i livmorarterien. Deretter samler du prøver fra den distale livmorarterien og foster navlestrengen avløp hvert 10. Mål forurensningene i væskeprøvene.Perfusjon med Evans blå fargestoff for å teste systemet og å visualisere riktig væske og placenta barriere funksjon for å hindre forurensning overføring til fosteret rommet avslører at fargestoffet nådd og perfused placenta vev i dette systemet. Ved nærmere undersøkelse er det klart at Evans blå fargestoff ikke kom inn i foster navlestrengven, som forventes, da Evans blå fargestoff er bundet til albumin. I dette representative eksperimentet ble en redusert væskeoverføring til fosterrommet innen 10 minutter etter polystyreninfusjon identifisert.Polystyren overføring til fosteret rommet deretter toppet på 20 minutter og fortsatte i 90 minutter. Det viktigste å huske under kanylingen er å gå sakte. Pipettene og vevet er veldig delikate og kan lett bli ødelagt eller revet.Ved å veie effluence, denne metodikken kan brukes til å undersøke placenta fysiologi samt materiale translokasjon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Etablering av en klinisk relevant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modell for Gransker Epithelial Wound Reparasjon i Native mikromiljøet

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Bruke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturer av Whole føtale organer å studere utviklingsprosesser i løpet Mouse organogenesen

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiell utvekst Kultur-analysen og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vurdering av Epikardial-avledet celle migrasjon

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolasjon og utvidelse av Mesenchymale Stem / stromal celler avledet fra human placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerende merking av piskehale som henger og Centrosomal proteiner i Ex Vivo tarmen Tissue og 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...