Name: ex vivo perfusion of the rodent placenta
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det nationella institutet för miljö hälso vetenskaper (R00-ES024783), Rutgers centrum för miljö exponeringar och sjukdomar (P30-ES005022), och Rutgers gemensamma Graduate program i toxikologi (T32-ES007148). Vi vill också tacka DRS. Michael Goedken, Marianne Polunas, och Pedro Louro för deras tekniska expertis och Dr. Adam goodwill för hans hjälp med att designa vår per fusion Schematisk (figur 5).

Alla experimentella procedurer godkändes av den institutionella djur omsorg och användning kommittén av Rutgers University.
1. förberedelser inför försöket
Anmärkning: dessa steg kan utföras inom dagar/veckor före experimentet.
<ol><li>Ändra fartygets kammare. Anmärkning: figur 1a, B visar den modifierade enda kärl kammaren.<ol>
<li>Flytta termistorsensorn från under klämman och Böj den så att den hänger fritt i per fusions badet (figur 1b).</li>
		<li>Installera två 4-tums Blunt-tip rostfria nålar med standard Luer anslutningshubbar, 1 25 g och 1 23 g säkras under termistor klippet och tillsätt en 3-vägs kranen för att möjliggöra kanylering av navel Strängs kärl (figur 1b). Obs: lueranslutningarna för olika mätar storlekar är färgkodade. Detta underlättar identifiering av fartyg under och efter experimentet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installera två 70 − 100 μm glasmikropipetter. För ytterligare information om dessa procedurer, se följande hänvisningar10,11. Anmärkning: den spets diameter som vanligen används i dessa experiment är i intervallet 70 − 100 μm. spets dia metrar större än detta intervall kan lägga till svårigheter att kanylering processen medan spets dia metrar mindre än 60 μm kan punktera kärl väggen under kanylering.</li>
	<li>Förbered banden från steril nylon sutur (för proximala och distala ändarna av livmoder artären) och från svart flätad siden icke-steril sutur (för navel Strängs kärl). Gör enstaka band genom looping suturen att initiera en kvadrat Knut eller knyta en sko, som beskrivits tidigare11. Obs: enstaka band är vanligt förekommande och förvaras i en petriskål fylld med ett litet lager av silikon gummi för att hjälpa till att arbeta på en klibbig bakgrund.</li>
	<li>Förbered 2 L av fysiologisk saltlösning (PSS) som innehåller, i mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2Po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2och 5,5 glukos. Justera pH-värdet till 7,40 ± 0,02 genom att sakta tillsätta några droppar syra (1 M saltsyra) eller bas (1 N natriumhydroxid) till lösningen och vänta minst 20 s innan den justerade pH-mätningen läses. Förvara PSS tills den är klar för användning i kyl skåpet för att minska kontaminering men förvara inte i mer än 2 veckor.</li>
	<li>Etikett mikrocentrifugrör för uppsamling av "maternell" och "fetal" utsläpp vid varje tidpunkt, dvs "MBaseline, M10, M20,..." upp till 180 min timepoint. Förbered samma för foster vatten (FBaseline, M10, M20,....).</li>
	<li>Kalibrera all utrustning som används i systemet, inklusive cirkulerande bad temperatur och blod trycks mätare i samband med upprätthållande av livmoder (80 mmHg) och navel strängen (50 mmHg) perfusatet tryck.</li>
	<li>Förbered en dissektion kammare (4 "diameter x 1" djup) eller en cirkulerande värmare skålen genom att fylla ett lager (< 0,25 ") av silikon gummi. Denna modifiering måste göras i förväg och eftersom det kommer att ta 12 − 24 timmar för gummit att torka. Obs: användning av en recirkulerande värmare/kylning skålen rekommenderas för nybörjare kirurger, eftersom skålen inte kommer att röra sig och vävnaden kommer att upprätthålla en jämn temperatur.</li>
</ol>2. beredning av Operations stationen och jämvikt av utrustning
<ol><li>Slå på all utrustning som stödjer per fusions systemet för att kontrol lera att funktionen fungerar korrekt. Ta bort PSS-anläggningen från kylning och varm till rums temperatur. PSS kommer att användas som både ett parfymsat och en superfusate.</li>
	<li>Placera en liten bubblande sten för att leverera en gas blandning i superfusate reservoaren. Vanligen använda blandningar omfattar 21% O2,8% o2, 3% o2och 0% o2. Slå på gasen för att ge små bubblor till superfusatlösningen. Justera gas leveransen för att undvika stänk.</li>
	<li>Ordna djuret dissekera stationen genom att kontrol lera bedövnings medel, arrangera kirurgisk utrustning, och förbereda sutur band. Förbered dissekera kammaren genom att samla dissekera stift, slå på kyl aggregatet (eller hämta is), och fylla dissekera kammaren (fodrad med gummi silikon) med kallt PSS.</li>
	<li>Fyll varsamt alla kamrar, nålar, Mikropipetter av glas, slangar och reservoarer med värmda PSS, och titta noga efter och eliminera luft bubblor genom att ge dem en fin översändnings pipett. Vrid alla 3-vägs kranar med "off" vänd mot pipettens riktning för att säkra vätskan i pipetten.</li>
	<li>Placera en enda slips på var och en av de två glasmikropipetter beredd för uterin kanylering och på de två trubbiga spetsen nålar avsedda för navel kanylering. Säkra banden till pipetter och trubbiga spetnålar för att förhindra förlust under kammar rörelserna (figur 1c).</li>
</ol>3. skörd i placenta
<ol><li>Anesthetize en gravid kvinnlig råtta på graviditets diabetes dag 20 med 5% isofluran i ca 4 min eller tills djuret uppvisar ansträngda andning. Flytta djuret till näskonen och administrera 2,5% − 3% isofluran för att bibehålla anestesi. Bekräfta medvetslöshet av en brist på tå nypa reflex. Anmärkning: användning av en råtta vid graviditets dag 20 presenteras i detta protokoll. Emellertid, protokollet förblir densamma om experimentella tillstånd kräver placenta utvärdering att äga rum tidigare i gestation.</li>
	<li>Identifiera och isolera livmoder Hornet (höger eller vänster) av val genom att lyfta ut och sprida ut långa vägar utanför rått stommen. Med hjälp av en flätad siden sutur, binda av livmoder artären vid äggstockarna slutet och vaginala änden av hornet. Inkludera äggstocken insidan av suturen med livmoder hornet.</li>
	<li>Med hjälp av kirurgisk sax, punkts katter bort livmoder hornet genom att skära på den proximala sidan av äggstocken slips och distala sidan av vaginal slips, lämnar livmoder hornet bunden med suturer i båda ändar. Överför livmoder hornet till dissekering skålen fodrad med silikon gummi och fylld med kallt (4 ° c) PSS. Oavsett om höger eller vänster signal horn väljs, bibehålla samma sida för val i varje experiment för konsistens. Anmärkning: för fetala anestesi, valpar hålls i iskalla PSS. Därför upprätthålls PSS-temperaturen i dissekerande kammaren av kyld cirkulerande bad eller dissekerande kammare bör hållas på is. Obs: vid denna punkt bedövade dammen kan euthanized per laboratorium IACUC protokoll godkännande. I detta fall, eutanasi sker via pneumothorax (genom att skära membranet) och avlägsnande av moderns hjärta.</li>
	<li>Tryck försiktigt en dissekera stift genom livmoder Hornet i silikon gummi, med äggstockarna sidan till vänster och vaginal sida till höger för att visualisera livmoder vaskulaturen. Detta kommer att stabilisera livmodern och förhindra förflyttning av vävnaden under dissektion av foster facket. Välj en maternell-placenta-fetal enhet central till horn och ligera livmodern artär och ven med kirurgisk sax. Skär livmoder muskeln proximalt och distalt om den valda moderkakan och fostret. Livmoder muskeln kan dras tillbaka genom att dra den åt sidan; Det är viktigt att lämna den intakt men dra bort den från att täcka Foster pup. Anmärkning: Val av moderkakan-placenta-fetal enhet bör baseras på längden på livmoder-artären segmentet på vardera sidan av arcuatus artären. Längre segment kommer att möjliggöra mer framgångs rik kanylering.</li>
	<li>Med hjälp av fina pincett och saxar, ta bort Foster membranet från foster ytan av moderkakan, noga med att undvika navel strängen.</li>
	<li>Riva upp och ligera navel strängen att separera Foster pup.</li>
	<li>Identifiera navel strängen (tjockare kärl) och ven (tunnare kärl). Markera navel nerven för enkel identifiering genom att skära den något kortare än navel strängen.</li>
	<li>Separera försiktigt navel strängen och venen från varandra.</li>
	<li>Hela placentaenheten inklusive livmoder vaskulaturen, livmoder muskeln, placenta, och navel strängen, kan skäras och avlägsnas.</li>
</ol>4. placenta per fusion
<ol><li>Upprätthålla anatomiska blod flödet behålla korrekt distala-till-proximala orientering av uterin artär, placera placenta enheten (bestående av livmoder vaskulaturen, livmoder muskeln, placenta, och navel strängen) i den modifierade isolerade kärlet kammare fylld med varm, syrat PSS.</li>
	<li>Med hjälp av ett par fina pincetter i varje hand, kanylera den proximala och distala ändarna av livmoder artären på glaset Mikropipetter.</li>
	<li>Tätt säkra livmodern artär med hjälp av sterila nylon suturen slips tidigare säkrade på mikropipetten. Obs: två-tie loopar (Knut) kan behövas; men en enda Tie loop möjliggör större justering.</li>
	<li>Kanylera navel artären (foster-till-moderns blod flöde) på 23 G (större) nål och säkra den med svart flätad siden sutur.</li>
	<li>Kanylera navel nerven (moder-till-foster blod flöde) på 25 G (mindre) trubbig nål och säkra den med svart flätad siden sutur.</li>
	<li>Flytta till placenta per fusion Station och återfyllning alla kranar och slangar för att förhindra luft bubblor. Anslut alla tubningar enligt figur 2.</li>
	<li>Placera små vägning båtar under distala kanylering av moderns uterin artär och nålen kanylering av fostrets navel sträng för att fånga avlopps vattnet som kommer att dyka upp under förfarandet.</li>
	<li>Slå på den peristaltiska pumpen, tryck regulator, och tryck vakt och öppna kranen för att tillåta vätske flöde genom slangen mot tryck givaren, men ännu inte till moderkakan. Öka långsamt trycket till 80 mm Hg.</li>
	<li>Långsamt vända kranen till moderkakan att öppna och titta på läckor inne i kammaren och runt banden. Obs: om den peristaltiska pumpen körs med hög hastighet, omvärdera den proximala uterin kanylering och slipsar för vätske läckor. Om det upptäcks måste läckor åtgärdas. Observera också, medan den genomsnittliga uterin artär trycket kommer att förbli konstant (inställd på 80 mmHg), vätske flödet kan variera beroende på vaskulär och placenta fysiologiska svar. Kvantifiering av vätske flödet kan identifieras som en experimentell variabel som svar på xenobiotisk exponering.</li>
	<li>Vrid kranen att tillåta vätske flöde i navel artären. Ställ in trycket på cirka 50 mmHg, som kan implementeras med en peristaltisk pump (figur 3) eller en hydrostatisk kolonn.</li>
	<li>Fyll på alla reservoarer (livmoder, navel och superfusate) för att bibehålla vätske volymen under hela experimentet. Anmärkning: när per fusion har inletts och experiment pågår, kan bedövade ungar kvar i dissekera skålen bedömas för livsduglighet genom att vidröra ungarna med pincett att framkalla en neurologisk respons. Exsanguination av valparna kommer att ske genom hysterektomi av livmoder horn; ytterligare döds hjälp kan slutföras genom godkända IACUC-protokoll. I detta fall, öppna Foster säcken i den kalla PSS och skapa en pneumothorax genom att skära revbenen.</li>
</ol>5. mock experiment
<ol><li>Efter kanylering och initiering av PSS-perfusion, låt vävnaderna jämställa i 30 minuter så att vaskulaturen kan anpassas till det nya vätske flödet. Sug upp utflödet med en pipett och spara det i ett motsvarande märkt mikrocentrifugrör.</li>
	<li>Efter jämvikt, fastställa bas linjen per fusion genom att samla avlopps vatten för 10 min från både vägning båtar i mikrocentrifug rör och mäta volymen av vätska som framträder genom livmoder artären och navel strängen ven.</li>
	<li>Initiera provtagning med 10 minuters mellanrum genom att samla in spill vatten från den distala uterin artären och navel ven. Till exempel, administrera en 900 μl bolusdos av 20 nm rhodamine-märkta polystyren nanopartiklar (8 x 1014 partiklar/ml) suspenderade i 0,01% tensiden till linjen parfymera livmodern artär att identifiera tiden kurs passage av xenobiotiska nanopartiklar över placentabarriären. Obs: dessa utflödes prov kommer att möjliggöra mätning av föroreningar i vätskan (antingen xenobiotiska, farmakologiska, eller metabolit) och ge den hastighet av vätske flödet genom livmoder artären eller över moderkakan och in i Foster facket ( Figur 4).</li>
	<li>Efter bolus infusion, samla prover från den distala uterin artären och fostrets navel strängen veneffluent var 10 min för totalt 180 min efter infusion.</li>
</ol>6. rengöring av utrustningen
<ol><li>Efter varje experiment, ta bort placenta enheten från pipetter. Alla suturer kan sparas för att återanvändas i framtida experiment. Placenta vävnad kan sparas för ytterligare histologiska eller mekanistiska studier.</li>
	<li>Rengör alla tubningar och Kanylerna i per fusions systemet med 70% etanol följt av destillerat vatten och vakuum torrt. Anmärkning: om slangar eller pipetter börjar missfärgar eller verkar skadade, Byt ut före nästa experiment. Vidare, efter att en experimentell kohort är avslutad (t. ex. alla studier som rör ett enda förorenings ämne), Ersätt alla tubningar i kammaren för att förhindra korskontaminering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism.">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li><li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta.">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li><li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep:+studies+with+radioactive+sugar.">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li><li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique.">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li><li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig.">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li><li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat.">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li><li>Goeden, N., Bonnin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+perfusion+of+mid-to-late-gestation+mouse+placenta+for+maternal-fetal+interaction+studies+during+pregnancy.">Ex vivo perfusion of mid-to-late-gestation mouse placenta for maternal-fetal interaction studies during pregnancy.</a> Nature Protocols. 8, 66-74 (2013).</li><li>Bond, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+perfusion+of+the+fetal+circulation+of+the+in+situ+mouse+placenta:+methodology+and+validation.">Artificial perfusion of the fetal circulation of the in situ mouse placenta: methodology and validation.</a> Placenta. 27, (2006).</li><li>Illsley, N. P., Fox, H., Van der Veen, F., Chawner, L., Penfold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+placental+ultrastructure+after+in+vitro+dual+perfusion.">Human placental ultrastructure after in vitro dual perfusion.</a> Placenta. 6, 23-32 (1985).</li><li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated,+Perfused+Microvessels.">Isolated, Perfused Microvessels.</a> Clinically Applied Microcirculation Research. , 435-456 (1995).</li><li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity.">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674 (2012).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Denna per fusions metod möjliggör snabb bedömning av placentabarriären och fysiologisk funktion hos livmoder-och trofoblastskiktet. Kanylering och per fusion av den proximala till distala ändarna av moderns uterin artär simulerar fysiologi maternell blod flöde genom detta stora fartyg som ansvarar för att skicka blod till det utvecklande fostret. Denna metod möjliggör fysiologisk utvärdering av isolerade maternell, placenta och navel Strängs kärl, och därför kan förändringar i fysiologi identifieras som vaskulär patologi; immun försvaret och neurala innervationer avlägsnas i ex-vivo-proceduren. För att säkerställa korrekt utvärdering, är det därför viktigt att kanylera dessa fartyg noggrant för att inte skapa några tårar eller punkteringar i kärl väggarna, och att ta bort luft bubblor. Gas embolier kan orsaka skador på endoteliala lagret av kärl eller hindra blod kärlen. Genom att bibehålla den vaskulära kopplingar mellan livmodern, moderkakan och foster under dissektion, utvärdering av vätska och translokation till fostret kan observeras. Med administrationen av en xenobiotic, i detta fall 20 nm polystyren, kinetik till den distala änden av livmoder artären och genom moderkakan till foster facket kan utvärderas genom analys av spill vatten under en tid under 180 minuter.
Medan en dual-perfusion modell beskrevs och överföring av partiklar och vätska från moderns till foster facket övervakades i denna artikel, kan utvärderingar också göras i omvänd från foster till moderns facket. En begränsning av den metod som beskrivs här är att den distala uterin venen inte kanyleras eller provtagning. I framtida studier, särskilt de som fokuserar på foster-till-maternell överföring, det kommer att vara viktigt att kanylera och prov den distala uterin kärlet. De utsläpp som tas från denna mock experiment användes för att bedöma xenobiotiska överföring; emellertid, ett brett spektrum av bedömningar som rör endokrina och molekyl ära placenta funktioner eller Foster näring kan utföras.
Styrkan i detta protokoll uppväger vida dess mindre begränsningar. Preparatet upprätthåller den fysiologiska strukturen och integriteten hos ett helt organ för att bedöma experimentella förhållanden. Ex vivo placenta per fusion är en vetenskaplig progression från cellulär-baserade in vitro till hela djur exponering för att korrekt fastställa reproduktiv riskbedömning. Detta kan anses vara en värdefull teknik för studier som utvärderar placenta farmakologisk läkemedelsdisposition, farmakokinetik, toxikologi, fysiologi, och maternell-fetal medicin.

Genom att bibehålla morfologisk struktur och fysiologisk reaktionsförmåga har orgel per fusion varit en accepterad system-eller vävnadsbaserad metod för att analysera metabolisk funktion. Dessa per fusions teknik möjliggör ex vivo-undersökning av intakta vävnads reaktioner på en mängd olika farmakologiska och mekaniska stimuli. Per fusion av mänsklig moderkakan beskrevs initialt i 1958 för att identifiera de hormonella effekterna på den metaboliska aktiviteten av citron syra cykeln; efter att tidigare ha identifierats i vävnad homogenater, Troen och Gordon erkänt behovet av att klargöra endokrina aktiviteten med hjälp av en ny fysiologisk metod1. I samma epok, Single-perfusion (maternell-till-fetal eller fetal-till-maternell) strategier beskrevs i stora2,3 och små4 djur modeller för att förstå placenta överföring av socker, salter, och antipyrin droger. Tekniker för in vivo och ex vivo Dual-perfusion (samordnad maternell och fetal per fusion) beskrevs för att ytterligare karakterisera placentaöverföring med metoder för in vivo5 och ex vivo6,7,8 . Tekniska framsteg inom transmission och scanning elektronmikroskopi tillät forskarna att kontrol lera den strukturella och funktionella integriteten hos mänskliga placenta vävnader efter per fusion9.
Medan per fusion av mänskliga placenta vävnader och enskilda Auktor är mest relevant, den snabba utvecklingen av farmakologiska agens och miljömässiga föroreningar nödvändiggör användning av en djur per fusion modell för tidig screening av xenobiotiska överföring över placentabarriären. Denna placenta per fusion metod möjliggör utvärdering av överföring över placentabarriären med hjälp av lättare uppnåeliga och fysiologiskt relevanta råtta placenta. Dessutom kan vätske flödet över placentabarriären under en tids period efter en exponering utvärderas genom att mäta volymen av parfymsat som kommer från navel strängen. I kraft av att tillåta placenta per fusion från både moderns och fostrets cirkulationer, denna Dual-Flow hela organ strategi kan vara fördelaktigt jämfört med nuvarande in vitro-och in vivo-metoder. Denna metod gör det möjligt för administrationen av en xenobiotiska genom moderns aspekt mätas från parfymsat som framträder över moderkakan genom navel venen, eller vice versa. Det protokoll som presenteras här kommer att beskriva överföringen av 20 nm polystyren (en gemensam nanoplast som används i livsmedel och medicintekniska produkter) från moderns livmoder artär till foster facket och en associerad minskning av vätske flödet över moderkakan att illustrera användning av denna metod i flera fysiologiska, farmakologiska och toxikologiska inställningar för att bedöma överföring av placenta, metabolism och fysiologiska förändringar som påverkar moderns och/eller fostrets flöde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black braided silk non-absorbable surgical suture non-sterile</td>
			<td>Surgical Specialties Look</td>
			<td>AACO805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>FST by Dumont Switzerland</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cannula pack</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>GCP-75-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes 2.0mL polypropylene graduated tube with locking lid MIXED</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-serrated fine curved micro serrefine clamps</td>
			<td>InterFocus</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusate pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM795C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Mode PM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-heating single vessel chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>CH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>ModelPS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 23 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>04651-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel blunt needle 25 gauge</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>07116-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERILE Nylon Suture</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>T04A00N07-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Sedation Resource</td>
			<td>6-205-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation (LSI)</td>
			<td>Model TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo perfusion of the rodent placenta

Moderkakan är ett viktigt organ under graviditeten som fungerar som ett hinder för fetal xenobiotiska exponering och förmedlar utbyte av näringsämnen för avfall. Ett test beskrivs här för att parfymera en isolerad råtta moderkakan och utvärdera moderns till foster flyttning av xenobiotika ex vivo. Dessutom kan utvärderingen av fysiologiska processer såsom vätske flöde till fostret och placenta metabolism genomföras med denna metod. Denna teknik är lämplig för att utvärdera maternell kinetik av farmaceutiska kandidater eller miljö föroreningar. I motsats till nuvarande alternativa metoder, denna metod gör det möjligt att utvärdera den isolerade moderns-fetal vaskulatur, med systemisk neurala eller immun engagemang bort, så att alla observerade förändringar i fysiologiska funktionen att vara som kan hänföras till lokala faktorer inom den isolerade vävnaden.

Figur 5 visar Proof-of-princip experiment med Evan blå färg, vilket gör att vi kan testa systemet och visualisera lämplig vätska och placenta barriär funktion och för att förhindra inne slutning överföring till foster facket. Den Evan blå färg nådde och parfymerade vävnaden i moderkakan inom detta system (figur 5a). Vid ytterligare utredning, är det tydligt att Evan blå färg inte in i fostrets navel sträng (Figur 5b), som förväntas som Evan blå färg är bunden till albumin.
Figur 6 visar data för det mock-experiment som beskrivs i detta protokoll. Utflödes prov från den distala änden av livmoder artären och fostrets navel sträng mättes vid varje 10-minuterssegment för att utvärdera vätske flödet över tiden efter att bolusdosen administrerades till moderns uterin artär (figur 6). Minskad vätske överföring till foster facket inom 10 minuter efter polystyren infusion identifierades. För att kvantifiera överföringen av polystyren till foster utrymmet under tiden när den inträffar, placerades 25 μL av den parfymerade vätskan från varje tidpunkt i en 96-platta i två exemplar för att mäta prov fluorescens. Fluorescens bestämdes genom spektroskopisk avläsning vid 546/575 nm (ex/EM) med hjälp av en fluorescerande mikroplattläsare. Polystyren överföring till foster facket inträffade inom 10 minuter och nådde 20 minuter och fortsatte under 90 minuter (figur 6b).
En delmängd av parfymerade placenta vävnader sparades för histopatologi och morfologiska bedömningar. Vävnaderna var formalin-fast och hematoxylin och eosin färgas och granskas av en styrelse certifierad veterinär patolog. Dessa experter identifierade inga strukturella avvikelser i moderkakor parfymerade av endast PSS, eller PSS med bolusdos av rhodamine-märkt polystyren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg"> Figur 1: den modifierade enkärls kammaren. Aen översikt över den modifierade kammaren. Ben närbild av de trubbiga kanyler som är säkrade i fartygs kammaren. Den röda pilen anger den termistor klämma som har ändrats för att hålla nålarna på plats för navel kanylering. Cen representativ bild av de fyra Kanylerna för beredda för vävnads kanylering. Röda pilar pekar på var och en av de fyra Kanylerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg"> Figur 2: en närmare bild av den placenta per fusions kammaren. (A) Detta representerar slangen ansluten till tryck givaren och kanyleras proximala moderns uterin artär, eller "inflöde". Trycket är inställt på en konstant 80 mmHg enligt definitionen i litteraturen. (B) Detta motsvarar kammarens tömnings port på superfusatet som omger placenta vävnaden under per fusion. (C) Detta motsvarar kammarens inflöde av superfusat för att bada moderkakan med värmda PSS under per fusion. (D) Detta motsvarar den distala moderns livmoder port där utflöde från livmoder per fusion kan samlas in. (E) Detta representerar temperatur porten, där fartygs kammaren kan fästas vid en termometer och värmare för att bibehålla en jämn temperatur under hela experimentet. (F) Detta representerar navel Strängs kanylering. Navel strängen är trycksatt till 50 mmHg för att möjliggöra motströmsflöde på nivån för placenta. Gdetta motsvarar insamlingen av navel Strängs avlopps vatten. Vätska som rinner mot Foster facket under per fusion kommer att samlas här. Hdetta är centrum för per fusions systemet, där moderkakan kanyleras och upprätthålls genom per fusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg"> Figur 3: en vy över placentabas per fusions system. (A och B) det tryck kontroll system som används för att övervaka och underhålla 80 mmHg av perfusatet genom uterin artär. Cdetta utgör termoregleringen av per fusions kammaren. D) Mikroskop. E) per fusions kammare. Fgravitations-Fed navel strängen per fusion inställd på 50 mmHg. Gen peristaltisk pump som används för att fylla och dränera placenta superfusate PSS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg"> Figur 4: schema över placentabas per fusions system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg"> Figur 5: representativa bilder av Proof-of-princip experiment med Evan blå färg ämne. (A och B) Proof-of-princip att Evan blå kommer att parfymera livmoder vaskulaturen, livmoder muskeln, och moderkakan men kommer inte passera placentabarriären på grund av albumin bindning. Den gröna pilen visar den blå venös dränering från moderkakan tillbaka till moderns cirkulation. Den röda pilen indikerar navel venen utflöde mot Foster facket. Notera avsaknaden av blått färg ämne. Cen representativ bild av insamlingen av avlopps vatten från navel venen. Den röda pilen indikerar DROPP bildning före insamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg"> Figur 6: data som härleds från det mock experimentet. Fluorescensmätningar av rhodamine-märkta polystyren nanomaterial, normaliserade till bas linjen fluorescens, genom insamling av (a) uterin artär och (b) fetal navel strängen veneffluents. Medelvärde normaliserad till fluorescens vid Baseline ± standard fel (SE). *: p < 0,05 och T: p < 0,1 via analys av var Ian sen (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta at JoVE.com

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

Här presenteras ett protokoll över ex vivo maternell vaskulär per fusion för att möjliggöra administrering av en test artikel till maternell kärl och för att utvärdera överföring av xenobiotiska partiklar eller farmakologiska agens i placenta, utöver förändringar i placenta fysiologi.

Ex vivo-perfusion av gnagare placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

En framgångsrik tillämpning av dessa tekniker kommer att möjliggöra den kinetiska utvärderingen av farmakologiska försök eller passage av xenobiotiska föroreningar genom en morfologiskt intakt moderkakan. Tekniken för gnagarkakan perfusion möjliggör en högre genomströmning av farmakologiska eller toxikologiska studier, eftersom flera föreningar kan bedömas med hjälp av vävnaden i en enda moderdjur. Demonstrera tekniken kommer att Jeanine D'Errico, en senior doktorand från mitt laboratorium.Innan du börjar proceduren, försiktigt fylla alla kamrarna, nålar, glas mikropipetter, slangar och reservoarer med värmde fysiologiska saltlösning eller PSS, försiktigt ta bort eventuella luftbubblor med en fin tippade överföring pipett som behövs. Vrid alla tre sätt stopcocks till off position för att säkra vätskan inom pipetterna. Placera en enda slips på var och en av de två glas mikropipettes förberedda för livmoder kannulation och på de två trubbiga spets nålar som utsetts för navel kanyl.Säkra sedan banden för att förhindra förlust under kammarens rörelser. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en sövd graviditetslängd dag 20 kvinnlig gravid råtta, lyfta en livmoder horn från buken och sprida hornet ut longways, externa till djuret. Använd flätade siden suturer att binda av livmoderns artär vid vaginala och äggstockscancer ändarna av hornet, inklusive äggstocken inuti suturen med livmoderhornet.Använda kirurgisk sax, gör snitt på den proximala sidan av äggstocken slips och den distala sidan av vaginal slips. Överför livmoderhornet till en dissekeringsfat fodrad med silikongummi och fylld med kall PSS. Med äggstocken sidan till vänster och vaginala sidan till höger, försiktigt driva en dissekerande stift genom livmoderhornet i silikongummi för att stabilisera livmodern.Välj en moderns moderkakan foster enhet central till hornet. Med hjälp av fina tlyckor och saxar, ta bort fosterhinnan från fosterytan av moderkakan var noga med att undvika navelsträngen. Unravel och ligate navelsträngen för att separera fostrets valp.Efter att identifiera umbilical artär och ven, försiktigt separera och ligate de umbilical fartyg. Skär sedan naveln lätt kortare än navelpultan för enkel identifiering. Och ligate livmoderns artär och ven med kirurgisk sax.Upprätthålla rätt orientering av livmoderns artär anatomiska blodflödet, placera placenta enheten i den modifierade isolerade kärl kammare fylld med varm syresatt PSS under en dissekera mikroskop. Med hjälp av ett par fina tlysen i varje hand, kannulate de proximala och distala ändarna av livmoderartären på glaset mikropipettes. Tätt säkra artären med den tidigare placerade sterila nylon suturen.Cannulate och säkra umbilical artären på 23 gauge trubbig nål. Sedan kantulera och säkra navel venen på 25 gauge trubbig nål och återfylla alla stopcocks och rör för att förhindra luftbubblor. Kom ihåg att kontrollera alla stopcocks, kanylerna och slangar för luftbubblor, som en luft bolus i systemet kommer att leda till cellulära nöd och eliminera räknaren strömflödet inom moderkakan.Anslut alla slangar enligt figuren. Placera små väga båtar under den distala kanylering av moderns livmoderns artär och under nålen kanylulation av fostrets navel ven att fånga utflödet som kommer att dyka upp under förfarandets gång. Förbered uppsamlingsplattan för utflödet för senare analys.Öppna stopcock för att tillåta vätskeflöde genom slangen mot moderkakan och slå på peristaltisk pump, tryckreglering och tryckvakt. Långsamt öka trycket till 80 millimeter kvicksilver läsa på tryckvakten. Öppna långsamt stopcock för att tillåta vätskeflöde till livmoderns artär.Fyll på alla reservoarer för att upprätthålla vätskevolymen under hela experimentet. Efter att vävnaderna har ekvillibrerat i 30 minuter för att tillåta vasculaturen att anpassa sig till det nya vätskeflödet, fastställa baslinjen perfusion genom att samla ut spillvatten i 10 minuter från båda avvägning båtarna. Mät volymen av vätska som framträder genom livmoderns artär och navel ven.Vid slutet av baslinjen insamlingsperioden, administrera den experimentella behandlingen i livmoderns artär. Samla sedan in prover från den distala livmoderartären och fostrets navelsflödesavflöde var 10:e minut under totalt 180 minuter efter infusionen. Mät föroreningarna inom vätskeproverna.Perfusion med Evans blå färgämne för att testa systemet och för att visualisera lämplig vätske- och placentabarriärfunktion för att förhindra föroreningsöverföring till fetala facket avslöjar att färgämnet nått och perfunderas placenta vävnaden inom detta system. Vid närmare undersökning är det tydligt att Evans blå färgämne inte kom in i fostrets navel, vilket förväntas, som Evans blå färgämne är skyldig att albumin. I detta representativa experiment identifierades en reducerad vätskeöverföring till fetala delparten inom 10 minuter efter polystyren infusion.Polystyren överföringen till fetala facket sedan nådde 20 minuter och fortsatte i 90 minuter. Det viktigaste att komma ihåg under kanylering är att gå långsamt. Pipetterna och vävnaden är mycket känsliga och kan lätt bli trasiga eller sönderrivna.Genom att väga effluence, denna metodik skulle kunna användas för att undersöka placentafysiologi samt material flyttning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Tillvägagångssätt

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Inrättande av en kliniskt relevant<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mock kataraktoperation Modell för utredning Epithelial sårläkning i en Native mikromiljö

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Använda<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright Dropp Kulturer av hela organ hos fostren att studera utvecklingsprocesser under Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex vivo Kultur av Chick Cerebellar skivor och rumsligt riktade elektroporering av Granulat cellprekursorer

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiella utväxt Kultur-analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Bedömning av epikardiella-härledda cellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolering och Expansion av mesenkymala stam / stromaceller celler från Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metod för time-lapse avbildning av odlade Rat Mesenteric Mikrovaskulära Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering och karakterisering av mesenkymala stromala celler från human navelsträng och Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescerande märkning av mikrotubuli och Centrosomal proteiner i Ex Vivo Tarmvävnaden och 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...