Name: analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par les NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) et Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).

Toutes les procédures d’animaux ont été effectués avec l’approbation du comité de l’emploi et Vanderbilt University Medical Center institutionnels animalier.
1. la collecte des embryons et la dissection de la souris
<ol><li>S’accouplent MLC-2v-tdTomato+/- souris femelles vieux de 8 à 10 semaine avec MLC-2v-tdTomato+/- souris mâles âgé de 8-10 semaine pour obtenir le MLC-2v-tdTomato+ / +, tdTomato-2v-MLC+/- et MLC-2v-tdTomato- ...

<ol>
	<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation.">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li><li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene.">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function.">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li><li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HF-1a/HF-1b/MEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression.">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart.">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li><li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network.">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li><li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development.">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li><li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4.">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li><li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis.">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li><li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo.">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li><li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line.">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube.">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li></ol>

La méthode décrite ici est relativement simple d’examiner le développement chambre ventriculaire, sans effectuer des expériences à forte main-d'oeuvre pour étiqueter ventriculaires ou cardiaque spécifique des gènes de structure ou de protéines. Ainsi, cette méthode minimise les variabilités techniques qui souvent trouvées dans les sections de cœur immunostained.
Il y a deux étapes cruciales pour réaliser avec succès cette méthode notamment l’évaluation précise de l’âg...

Formation de chambre pendant le développement du cœur est un processus complexe qui passe par plusieurs stades embryonnaires morphologiquement distinctes1,2. La forme en croissant de progéniteurs cardiaques de population forme un tube cardiaque linéaire et puis subit une élongation et une boucle pour obtenir la forme de la spirale du coeur en développement. Après son processus de cloisonnement, le coeur en développement se transforme en le cœur à quatre cavités. Interruption de le quelconque de ces processus résulte du développement de cardiopathies congénitales. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la formation de la chambre au cours du développement du cœur. Malgré de nombreuses études précédentes sur le développement du cœur, notre compréhension de ce processus complexe reste limitée.
Hybridation in situ, immunohistochimie et bêta-galactosidase LacZ journaliste chez des souris de coloration ont été largement utilisées pour étudier la formation de chambre pendant le développement cardiaque chez la souris par marquage cardiaque spécifique ou une chambre spécifique des gènes de structure ou protéines (p. ex., Ppne, Coup-TFII, Irx4, MLC-2 a et MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Toutefois, ces expériences utilisant des embryons de souris exigent beaucoup de temps et expertise, parce que plusieurs différentes étapes expérimentales doivent être effectuées dans l’ordre de11. Nous décrivons ici une méthode de microscopie épifluorescente de Mont toute simple pour visualiser les ventricules en développement utilisant des embryons disséqués du MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in12. L’avantage de cette méthode par rapport aux méthodes utilisées précédemment est d’éviter les étapes expérimentales complexes qui peuvent souvent créer des variations expérimentales. L’objectif principal du présent protocole est de décrire comment disséquer des embryons de souris et coeurs en voie de développement et d’examiner chaque étape du développement cardiaque chambre souris sans expériences histochimiques fastidieux. Cette méthode peut être facilement appliquée pour évaluer le développement de coeur à l’aide de divers autres lignées de souris transgéniques étiquetage des marqueurs cardiaques précoces (par exemple, Mesp1Cre : Rosa26EYFP13, Isl1Cre : Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre : Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre : Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre : Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre : Rosa26tdTomato TgMef2c-AHF-GFP16 souris et15).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:647px;" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">MZ125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DNA ladder (100 bp)</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">epifluorescence dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GoTaq Green master Mix</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR machine (master cycler)</td>
			<td style="width:83px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6336000023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence

Le but du présent protocole est de décrire une méthode pour la dissection des embryons de souris et la visualisation des cavités ventriculaires embryonnaires de souris au cours du développement de coeur à l’aide de la souris knock-in ventriculaire journaliste fluorescents spécifiques (MLC-2v-tdTomato souris). Développement de coeur implique une formation du tube cardiaque linéaire, le tube de coeur looping et quatre chambre septation. Ces processus complexes sont hautement conservées chez tous les vertébrés. Le coeur embryonnaire de souris a été largement utilisé pour les études sur le développement cardiaque. Toutefois, en raison de leur taille extrêmement petite, coeurs embryonnaires de souris de dissection est techniquement difficile. En outre, visualisation de formation de chambre cardiaque souvent a besoin d’hybridation in situ, bêta-galactosidase, coloration à l’aide de la souris journaliste LacZ ou immunostaining des coeurs embryonnaires sectionnés. Ici, nous décrivons comment disséquer coeurs embryonnaires de souris et de visualiser directement formation chambre ventriculaire du MLC-2v-tdTomato de souris au microscope toute monture épifluorescente. Avec cette méthode, il est possible d’examiner directement la formation du tube cardiaque et une boucle et quatre formation de chambre sans plus loin la manipulation expérimentale des embryons de souris. Bien que la ligne de souris knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato est utilisée dans le présent protocole à titre d’exemple, le présent protocole peut être appliqué aux autres lignées de souris transgéniques journaliste fluorescents spécifiques à cœur.

Au cours du développement du cœur, MLC-2v est considéré comme le premier marqueur pour chambre ventriculaire spécification17. Comme illustré à la Figure 1, nous avons disséqué les embryons entiers de souris et coeurs embryonnaires de souris MLC-2v-tdTomato journaliste knock-in et examiné MLC-2v-tdTomato expression du rapporteur au cours du développement du cœur. Dans souris mise knock-in journaliste MLC-2v-tdTomato, express...

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Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

En utilisant cette méthode, nous pouvons directement passer en examen la formation de tube cardiaque, en boucle, et la formation de chambre pleine sans autres manipulations expérimentales de l’embryon de souris. Bien que, nous utilisons MLC-2v-tdTomato souris comme un exemple, cette méthode simple peut être largement utilisé avec d’autres lignes fluorescentes de souris reporter. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est très simple et ne nécessite pas de techniques ou d’équipements complexes.Il peut être effectué en laboratoire régulier. Après l’accouplement femelle avec des souris mâles, à la fois MLC-2v-tdTomato 8 à 10 semaines, vérifier les mères pour les bouchons vaginaux tous les matins. Déposer les mères enceintes, euthanasiées à différents jours après le coït, en position supinée et pulvériser l’abdomen avec 70% d’éthanol.Utilisez des ciseaux chirurgicaux pointus et des forceps pour ouvrir la cavité abdominale par incision de la peau et de la paroi abdominale. Après avoir localisé les cornes utérine bilatérales dans la partie dorsale de la cavité abdominale, séparez l’utérus entier à l’aide de ciseaux chirurgicaux pointus et de forceps pour couper soigneusement au-dessus des oviductes des deux côtés. Placer l’utérus entier disséqué dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec du PBS glacé.À l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants et de forceps, séparez soigneusement chaque sac amniotique le long de la corne utérine. Utilisez des pinces à épiler pour transférer chaque embryon dans une plaque de culture de 35 millimètres remplie de PBS glacé. À l’aide de ciseaux et de forceps chirurgicaux tranchants, ouvrez un sac amniotique et exposez chaque embryon en coupant le cordon ombilical, puis coupez autant que possible les tissus embryonnaires supplémentaires sans endommager les embryons.Sous un microscope disséquant avec un illuminateur de microscope à fibres optiques, coupez la tête de l’embryon et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre avec 100 microlitres de tampon A pour que le génotypage ultérieur soit corrélé avec les résultats de l’imagerie épifluorescente. À l’aide de forceps fins, ouvrir la poitrine de l’embryon. Avec des ciseaux chirurgicaux pointus et des forceps, retirez le cœur des poumons et de la vascularisation.Utilisez des pinces à épiler pour transférer le cœur embryonnaire disséqué dans une plaque de culture de 35 millimètres avec PBS. Placez la plaque avec des cœurs embryonnaires de souris sous un microscope à disséquer épifluorescent. Utilisez des forceps fins pour positionner les cœurs embryonnaires de sorte que les ventricules en développement sont confrontés à l’examinateur.Ajustez la mise au point à l’aide d’un objectif de 0,63 x en mode champ lumineux. Prenez des expositions en champ lumineux et capturez plusieurs images. Pour visualiser l’expression tdTomato, éteignez un illuminateur de microscope à fibres optiques et réglez le filtre pour la fluorescence rouge.Réajustez la mise au point de l’image si nécessaire, ajustez la luminosité et le contraste, prenez des expositions rouge-fluorescentes et capturez plusieurs images. Pour le génotypage embryonnaire, faire bouillir des échantillons de tête précédemment isolés dans le tampon A à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifugeuse pendant deux minutes à 11, 360 fois G.Transfert 20 microlitres de supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre avec 20 microlitres de tampon B et mélanger.Utilisez 4,5 microlitres du supernatant mixte comme modèle d’ADN et combinez-le avec 0,5 microlitres de chacun des 10 amorces avant et inversées spécifiques aux micromolaires, 10 microlitres de polymése préméxée 2x et tampon de réaction, puis ajoutez de l’eau à un volume total de 20 microlitres. Exécutez un PCR tel que décrit dans le manuscrit. Chargez la réaction terminée dans une échelle d’ADN de paire de base de 1% sur un gel d’agarose de 1% et courez à 140 volts dans le tampon 1x TAE pendant 25 minutes.Placez le gel complété sur un transilluminateur UV et allumez la lumière UV pour identifier les bandes d’ADN. MLC-2v est considéré comme le marqueur le plus tôt pour la spécification ventriculaire de chambre pendant le développement de coeur. Chez les souris knock-in de journaliste de MLC-2v-tdTomato, l’expression relativement faible de tdTomato dans le tube linéaire de coeur à E8.0 devient plus forte à E8.5 comme montré utilisant la formation image épiflourescente de montage entier des embryons.Utilisant l’imagerie épiflourescente de montage entier du coeur disséqué, la formation ventriculaire de chambre pendant le développement de coeur de souris peut être facilement déterminée. Dans le coeur disséqué d’un embryon entier de souris à E10.5, l’expression de journaliste de MLC-2v-tdTomato a été montrée dans la partie ventriculaire du coeur et pas dans le secteur d’entrée, le tractus de sortie, ou les futurs atria. Chez E12.5 à E13.5, le journaliste tdTomato s’exprime exclusivement dans les ventricules du cœur à quatre chambres.Le modèle d’expression ventriculaire-spécifique semblable a été montré dans l’embryon disséqué de souris à E16.5. Après l’imagerie entière, le génotype des embryons a été déterminé à l’aide de deux ensembles d’amorce pour le génotypage PCR, confirmant les embryons homozygotes porteurs de l’allèle knock-in tdTomato, des hétérozygotes et des embryons de type sauvage. Cette méthode est assez simple et simple à exécuter.L’étape critique consiste à disséquer les cœurs embryonnaires. Comprendre l’anatomie cardiaque pendant le développement cardiaque est nécessaire pour isoler avec succès le cœur de l’embryon entier.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

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Optimisé<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Utilisation<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

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