Name: analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e programma di Gilead Sciences Research Scholar (Y.-J. N).

Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione del Comitato di uso e Vanderbilt University Medical Center istituzionale Animal Care.
1. mouse raccolta degli embrioni e dissezione
<ol><li>Compagno di 8-10 settimane vecchio MLC-2v-tdTomato+ /- topi femmina con 8-10 settimane vecchio MLC-2v-tdTomato+ /- topo maschio per ottenere MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- e MLC-2v-tdTomato- / - embrioni.</li>
	<li>Con...

<ol>
	<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation.">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li><li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene.">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function.">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li><li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HF-1a/HF-1b/MEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression.">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart.">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li><li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network.">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li><li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development.">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li><li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4.">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li><li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis.">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li><li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo.">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li><li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line.">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube.">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li></ol>

Il metodo descritto qui è relativamente semplice per esaminare lo sviluppo camera ventricolare, senza laboriosi esperimenti per etichettare ventricolare o cardiaci specifici geni strutturali o proteine. Quindi, questo metodo riduce al minimo tecnico variabilities che spesso sono stati trovati nelle sezioni immunostained cuore.
Ci sono due passaggi critici per l'esecuzione con successo questo metodo tra cui stima precisa dell'età embrionali di topi e dissezione del cuore embrionale. Stimiamo ...

Formazione di camera durante lo sviluppo del cuore è un processo complesso, passando attraverso diversi stadi embrionali morfologicamente distinti1,2. La forma a mezzaluna cardiaco della popolazione delle cellule del progenitore forma un tubo lineare cuore e poi subisce allungamento e looping per formare la forma a spirale del cuore in via di sviluppo. Dopo il suo processo di settazione, cuore in via di sviluppo si trasforma in cuore quattro-a temperatura ambiente. Interruzione di uno qualsiasi di questi processi si traduce in difetti inerenti allo sviluppo del cuore. Pertanto, è importante capire i meccanismi molecolari sottostanti formazione camera durante lo sviluppo del cuore. Nonostante i numerosi studi precedenti su sviluppo del cuore, la nostra comprensione di questo complesso processo resta limitata.
L'ibridazione in situ, immunoistochimica e beta-galattosidasi che macchia usando topi reporter LacZ sono stati ampiamente usati per studiare la formazione di camera durante lo sviluppo del cuore del mouse dall'etichettatura cardiaci specifici o camera di specifici geni strutturali o proteine (ad es., Nppa, colpo di stato-TFII, Irx4, MLC-2a e MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Tuttavia, questi esperimenti con embrioni di topo richiedono molto tempo e competenze, perché diverse fasi sperimentali devono essere eseguite in sequenza11. Qui, descriviamo un metodo di microscopia semplice intero Monte epifluorescente per visualizzare i ventricoli sviluppo utilizzando embrioni dissecati dal MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in12. Il vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi precedenti è di evitare la complessa procedura sperimentale che spesso può creare variazioni sperimentali. Lo scopo principale di questo protocollo è descrivere come dissezionare embrioni di topo e cuori in via di sviluppo e di esaminare ogni fase dello sviluppo di alloggiamento cardiaco del mouse senza esperimenti istochimici noiosi. Questo metodo può essere applicato facilmente per valutare lo sviluppo di cuore utilizzando varie altre linee di topi transgenici etichettatura marcatori cardiaci precoci (ad es., Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15e topi16 TgMef2c-AHF-GFP).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:647px;" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">MZ125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DNA ladder (100 bp)</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">epifluorescence dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GoTaq Green master Mix</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR machine (master cycler)</td>
			<td style="width:83px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6336000023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence

L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo per la dissezione degli embrioni del mouse e visualizzazione delle camere ventricolari embrionali del mouse durante lo sviluppo del cuore usando topi knock-in reporter fluorescenti specifici ventricolare (MLC-2v-tdTomato topi). Sviluppo del cuore implica una formazione cuore lineare del tubo, il tubo di cuore looping e quattro camera settazione. Questi complessi processi sono altamente conservati in tutti i vertebrati. Il cuore di embrionali del topo è stato ampiamente usato per studi evolutivi di cuore. Tuttavia, a causa della loro dimensioni estremamente ridotte, cuori embrionali del topo di dissezione è tecnicamente impegnativo. Inoltre, visualizzazione di formazione camera cardiaca spesso ha bisogno di ibridazione in situ, beta-galattosidasi che macchia usando topi reporter LacZ, o immunostaining del cuore embrionale sezionato. Qui, descriviamo come sezionare cuori embrionali del mouse e visualizzare direttamente la formazione di camera ventricolare di MLC-2v-tdTomato topi usando la microscopia intero Monte epifluorescente. Con questo metodo, è possibile esaminare direttamente la formazione del tubo di cuore e loop e quattro formazione di camera senza ulteriore manipolazione sperimentale degli embrioni del mouse. Anche se la linea di topo knock-in reporter MLC-2v-tdTomato è utilizzata in questo protocollo come esempio, questo protocollo può essere applicato ad altre linee di topi transgenici reporter fluorescenti specifici del cuore.

Durante lo sviluppo del cuore, MLC-2v è considerato essere l'indicatore più in anticipo per camera ventricolare specifica:17. Come descritto in Figura 1, abbiamo dissecato fuori interi embrioni del mouse e hearts embrionali di topi knock-in reporter di MLC-2v-tdTomato ed esaminato MLC-2v-tdTomato reporter espressione durante lo sviluppo del cuore. In MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in, espressione costitutiva tdTomato nel cuore i...

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Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Utilizzando questo metodo possiamo esamiare direttamente la formazione del tubo cardiaco, il looping e la formazione completa della camera senza ulteriori manipolazioni sperimentali dell'embrione del topo. Anche se, usiamo topi MLC-2v-tdTomato come esempio, questo semplice metodo può essere ampiamente utilizzato con altre linee di mouse reporter fluorescenti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è molto semplice e non richiede tecniche o attrezzature complesse.Può essere eseguito in normali impostazioni di laboratorio. Dopo aver accoppiato la femmina con topi maschi, entrambi MLC-2v-tdTomato di età da 8 a 10 settimane, controllare le dighe per le spine vaginali ogni mattina. Posare le dighe gravide, eutanasiate in giorni diversi dopo il coitum, in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di etanolo.Utilizzare forbici chirurgiche affilate e forcep per aprire la cavità addominale per incisione sia della pelle che della parete addominale. Dopo aver individuato le corna uterine bilaterali nella parte dorsale della cavità addominale, separare l'intero utero usando forbici chirurgiche affilate e forcette per tagliare con cura sopra gli ovidotti su entrambi i lati. Posizionare l'intero utero sezionato in una piastra di petri di 10 centimetri con PBS ghiacciato.Utilizzando forbici chirurgiche affilate e pini, separare accuratamente ogni sacco amniotico lungo il corno uterino. Utilizzare una pinzetta per trasferire ogni embrione in una piastra di coltura di 35 millimetri piena di PBS ghiacciato. Utilizzando forbici chirurgiche affilate e pini, aprire un sacco amniotico ed esporre ogni embrione tagliando il cordone ombelicale e quindi tagliare il più possibile i tessuti embrionali extra senza danneggiare gli embrioni.Al microscopio sezionato con un illuminatore a microscopio in fibra ottica, tagliare la testa dell'embrione e trasferirla in un tubo da 1,5 millilitri con 100 microlitri di tampone A per la successiva genotipizzazione per correlare con i risultati dell'imaging epifluorescente. Usando le forcep fini, aprire il torace dell'embrione. Con forbici chirurgiche affilate e forcep, rimuovere il cuore dai polmoni e dalla vascucolatura.Utilizzare una pinzetta per trasferire il cuore embrionale sezionato in una piastra di coltura di 35 millimetri con PBS. Posizionare la piastra con cuori embrionali di topo al microscopio a dissezione epifluorescente. Usa le forcep fini per posizionare i cuori embrionali in modo che i ventricoli in via di sviluppo siano rivolti verso l'esaminatore.Regola lo stato attivo usando un obiettivo 0,63x in modalità campo luminoso. Scatta esposizioni a campo luminoso e cattura più immagini. Per visualizzare l'espressione tdTomato, spegnere un illuminatore per microscopio in fibra ottica e impostare il filtro per la fluorescenza rossa.Riregolare la messa a fuoco dell'immagine, se necessario, regolare la luminosità e il contrasto, assumere esposizioni rosso-fluorescenti e acquisire più immagini. Per la genotipizzazione dell'embrione, far bollire campioni di testa precedentemente isolati nel tampone A a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare per due minuti a 11, 360 volte G.Trasferire 20 microlitri di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri con 20 microlitri di tampone B e miscelare.Utilizzare 4,5 microlitri del supernatante misto come modello di DNA e combinarlo con 0,5 microlitri di ciascuno dei primir in avanti e invertiti specifici per 10 micromolari, 10 microlitri di polimerasi premiscelata 2x e tampone di reazione e quindi aggiungere acqua a un volume totale di 20 microlitri. Eseguire una PCR come descritto nel manoscritto. Caricare la reazione completata in una scala del DNA a coppia di base 100 su un gel di agarosio dell'1% e correre a 140 volt in tampone 1x TAE per 25 minuti.Posizionare il gel completato su un transilluminatore UV e accendere la luce UV per identificare le bande di DNA. MLC-2v è considerato il primo marcatore per le specifiche della camera ventricolare durante lo sviluppo cardiaco. Nei topi knock-in reporter MLC-2v-tdTomato, l'espressione relativamente debole di tdTomato nel tubo cardiaco lineare a E8.0 diventa più forte a E8.5 come mostrato utilizzando l'imaging epiflourescente a montaggio intero degli embrioni.Utilizzando l'imaging epiflourescente a montaggio intero del cuore sezionato, la formazione della camera ventricolare durante lo sviluppo del cuore del topo può essere facilmente determinata. Nel cuore sezionato da un intero embrione di topo a E10.5, l'espressione del reporter MLC-2v-tdTomato è stata mostrata nella porzione ventricolare del cuore e non nel tratto di afflusso, nel tratto di deflusso o negli atri futuri. Da E12.5 a E13.5, tdTomato reporter si esprime esclusivamente nei ventricoli del cuore a quattro camere.Lo schema di espressione specifico ventricolare simile è stato mostrato nell'embrione di topo sezionato all'E16.5. Dopo l'imaging intero, il genotipo degli embrioni è stato determinato utilizzando due serie di primer per il genotipizzazione PCR, confermando gli embrioni omozigoti che trasportano l'allele knock-in tdTomato, l'eterozigote e gli embrioni di tipo selvatico. Questo metodo è piuttosto semplice e semplice da eseguire.Il passo critico è sezionare i cuori embrionali. Comprendere l'anatomia cardiaca durante lo sviluppo cardiaco è necessario per isolare con successo il cuore dall'intero embrione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Ottimizzato<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

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Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

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