Name: analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00
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この作品は、NIH R03 HL140264 によって支えられた (雄 j.N) とギリアド ・ サイエンシズ研究学者プログラム (雄 j.N)。

動物のすべてのプロシージャは、ヴァンダービルト大学医療センター機関動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行った。
1. マウス胚のコレクションおよび郭清
<ol><li>チームメイトの 8-10 週齢雌 MLC 2 v tdTomato+/-マウス 8-10 週古い男性 MLC 2 v tdTomato+/-マウスと MLC 2 v tdTomato を取得する+/+、MLC 2 v tdTomato+/-と MLC 2 v tdTomato-/-胚。</li>
	<li...

<ol>
	<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation.">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li><li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene.">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function.">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li><li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HF-1a/HF-1b/MEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression.">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart.">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li><li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network.">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li><li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development.">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li><li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4.">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li><li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis.">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li><li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo.">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li><li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line.">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube.">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li></ol>

ここで説明する方法は心室または心臓固有の構造遺伝子または蛋白質のラベルに手間のかかる実験を行わず心室の開発を検討する比較的簡単です。したがって、このメソッドは、immunostained 中心部のセクションで発見された多くの場合技術的な変動を最小限に抑えます。
マウスの萌芽期の年齢・胚の心の解剖の正確な推定を含むこのメソッドを正常に実行するための 2 つ...

心臓の発達過程室形成は、複数胚の形態的に異なる段階1,2と移り変わり複雑なプロセスです。心臓前駆細胞の三日月形リニア心臓の管を形作るし、伸長と成長の中心のスパイラル形状を形成するループを経る。その隔プロセスの後、心臓の開発は 4 chambered 中心に変換されます。これらのプロセスのいずれかの中断は、発達心臓の欠陥で結果します。したがって、心臓の発達過程室形成の分子機構を理解することが重要です。心臓の開発で多数の先行研究、にもかかわらずこの複雑なプロセスの私達の理解は限られています。
In situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および β-ガラクトシダーゼは、LacZ レポーター マウスを用いた染色を広く心臓特定または商工会議所特定構造遺伝子の分類によってマウス心臓開発中に商工会議所の形成を研究に使用されているまたはタンパク質 (例えば、Nppa クーデター TFII Irx4、MLC 2 a、MLC 2 v)3,4,5,6,7,8,9,10。ただし、これらの実験は、マウスの胚を使用して膨大な時間と専門知識、ので必要する必要がありますいくつかの異なる実験手順11を順番に実行します。ここでは、MLC 2 v tdTomato 記者ノックイン マウス12から解剖した胚を使用して発展途上心室を視覚化する単純な全体マウント epifluorescent 顕微鏡法について述べる。以前使用していた方法と比較してこの方法の利点は、実験的バリエーションを作成可能性があります多くの場合複雑な実験手順を避けるためです。このプロトコルの主な目的は、マウス胚および開発の心を解剖し退屈な組織化学的実験なしマウス心臓チャンバーの開発の各段階を確認する方法を説明します。早期の心臓マーカーをラベリング様々 な他トランスジェニック マウス ラインを使用して心臓の開発を評価するためにこのメソッドを簡単に適用できる (例えば、Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13Hcn4H2BGFP14Hcn4Cre: ローザ mT/mG14, Nkx2 5Cre: ローザ mT/mG14、Hcn4 eGFP15Isl1Cre: ローザ mT/mG14Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15、および16の TgMef2c AHF GFP マウス)。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:647px;" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">MZ125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DNA ladder (100 bp)</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">epifluorescence dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GoTaq Green master Mix</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR machine (master cycler)</td>
			<td style="width:83px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6336000023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence

このプロトコルの目的は、マウス胚の郭清とマウス萌芽期の心室の部屋心室固有蛍光レポーター ノックイン マウス (MLC 2 v tdTomato マウス) を使用して心臓の発達過程の可視化方法の説明です。リニア心臓管形成、ループ、心臓の管および 4 室中隔、心臓の開発が含まれます。これらの複雑なプロセスはすべての脊椎動物で非常に節約されます。マウス胚の心臓は、心の発達研究のため広く使用されています。ただし、彼らの非常に小さなサイズのためマウス胚心を解剖するは、技術的に挑戦的なです。さらに、しばしば心臓室形成の可視化には、in situ ハイブリダイゼーション、β-ガラクトシダーゼ LacZ レポーター マウス、または断面胚心の免疫染色を使用して染色が必要があります。ここでは、マウスの胚中心を細かく分析し、全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いた MLC 2 v tdTomato マウス心室形成を直接可視化する方法をについて説明します。この方法では、心臓管形成とループ、およびマウス胚のさらなる実験的操作なしの 4 つの商工会議所形成を直接調査することが可能です。MLC 2 v tdTomato 記者ノックイン マウス ラインは、例としてこのプロトコルで使用されますが、このプロトコルは、他の心臓特異蛍光レポーター トランスジェニック マウスのラインに適用できます。

心の開発中に MLC 2 v は心室仕様17の最も早いマーカーと見なされます。図 1に示すように我々 は MLC 2 v tdTomato 記者式心臓の発達過程を検討し、マウス胚と MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスからの萌芽期心を解剖しました。MLC 2 v tdTomato レポーター ノックイン マウスの心臓の開発で構成 tdTomato 式は落射蛍光全台紙?...

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Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent 顕微鏡を用いたマウス心臓の開発を検討するプロトコルを提案します。このメソッドでは、心室形成労働集約的な組織化学的方法なしマウス心臓の発達過程の各段階を直接可視化することが出来ます。

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

この方法を使用すると、マウス胚のさらなる実験的操作なしに、心臓管形成、ループ、および完全なチャンバー形成を直接検査することができます。一例としてMLC-2v-tdTomatoマウスを用いるが、この簡便な方法は他の蛍光レポーターマウスラインと広く用いることができる。このプロトコルの主な利点は、非常に単純であり、任意の複雑な技術や機器を必要としないことです。通常のラボ設定で実行できます。生後8~10週のMLC-2v-tdTomatoの雌を雄マウスと交配した後、ダムで毎朝膣プラグを確認する。妊娠したダムを置き、結腸後の異なる日に安楽死させ、仰向けの位置に、腹部に70%エタノールを噴霧する。皮膚と腹壁の両方の切開によって腹腔を開くために鋭い外科用ハサミと鉗子を使用してください。腹腔の後部に両側の子宮の角を見つけ、鋭い外科用ハサミと鉗子を使用して子宮全体を分離し、両側の卵管の上に慎重に切断する。解剖した子宮全体を氷冷PBSで10センチメートルのシャーレに入れます。鋭利な外科用ハサミと鉗子を使用して、子宮の角に沿って各羊膜嚢を慎重に分離する。ピンセットを使用して、各胚を氷冷PBSで満たされた35ミリメートルの培養プレートに移します。鋭利な外科用ハサミと鉗子を使用して、羊膜嚢を開き、臍帯を切断して各胚を露出させ、胚を損傷することなく可能な限り余分な胚組織をトリミングする。光ファイバー顕微鏡照明器を用いた解剖顕微鏡の下で、胚の頭部を切断し、100マイクロリットルの緩衝液Aを有する1.5ミリリットルのチューブに移し、後のジェノタイピングは蛍光イメージングの結果と相関させる。細かい鉗子を使って、胚の胸部を開く。鋭利な手術用ハサミと鉗子で、肺と脈管から心臓を取り除きます。ピンセットを使用して、解剖した胚心臓をPBSで35ミリメートル培養プレートに移します。マウス胚性心臓を用いてプレートを蛍光解剖顕微鏡の下に置きます。発達中の心室が試験官に向かうような胚性心臓を配置するために細かい鉗子を使用する。明視野モードで0.63xの目標を使用してフォーカスを調整します。明視野露出を取り、複数の画像をキャプチャします。tdTomatoの発現を可視化するには、光ファイバー顕微鏡の照明をオフにして、赤い蛍光のフィルターをセットします。必要に応じて画像の再調整、明るさとコントラストの調整、赤蛍光露出の撮影、複数の画像のキャプチャを行います。胚のジェノタイピングの場合、以前に分離された頭部サンプルを100°Cで摂氏100度で30分間沸騰させる。遠心分離機は11で2分間、360倍G.20マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、20マイクロリットルのバッファーBと混合します。DNAテンプレートとして4.5マイクロスプリナを使用し、10マイクロモル特異的なフォワードおよびリバースプライマー、2xプレミックスポリメラーゼおよび反応バッファーの10マイクロリットルのそれぞれ0.5マイクロリットルと組み合わせて、合計20マイクロリットルに水を加えます。原稿に記載されているとおりに PCR を実行します。完成した反応を1%アガロースゲルに100塩基対DNAラダーでロードし、1x TAEバッファーで140ボルトで25分間実行します。完成したゲルをUVトランイルミエーターに置き、UV光をオンにしてDNAバンドを識別します。MLC-2vは、心臓の発達中に心室室の仕様のための最も初期のマーカーであると考えられる。MLC-2v-tdTomatoレポーターノックインマウスでは、E8.0のリニア心臓管におけるtdTomatoの比較的弱い発現は、胚の全マウントエピロウのイメージングを用いて示されるようにE8.5において強くなる。解剖された心臓の全マウントエピフラワー画像を使用して、マウス心臓の発達中の心室形成を容易に決定することができる。E10.5でマウス胚全体から解剖された心臓では、MLC-2v-tdTomatoレポーターの発現は、心臓の心室部分に示され、血流路、流出路、または将来のアトリアには示されなかった。E12.5~E13.5では、tdTomatoレポーターは4室の心臓の心室で独占的に表現される。同様の心室特異的発現パターンは、E16.5における解剖マウス胚に示された。全体のイメージングの後、胚の遺伝子型をPCR遺伝子型化のためのプライマーの2組を用いて決定し、tdTomatoノックインアレーレ、ヘテロ接合、および野生型胚を運ぶホモ接合性胚を確認した。この方法は非常に簡単で、実行が簡単です。重要なステップは、胚性心臓を解剖することです。心臓の発達中に心臓解剖学を理解することは、胚全体から心臓を正常に分離するために必要である。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

最適化された<em&gt;元OVO</em&gt;開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

使い方<em&gt;エクスビボ</em&gt;全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

ニワトリ胚組織の開発培養法

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...