Name: analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R03 HL140264 (ю.-Дж. N) и Галааде наук исследования ученый программа (ю.-Дж. N).

Все животные процедуры выполнялись с одобрения Вандербильта университета медицинский центр институциональных животное уход и использование Комитета.
1. мышь эмбриона коллекции и рассечение
<ol><li>Мате женского док 2v-tdTomato 8-10 неделя+ / мышей с 8-10 недельных док 2v-tdTomato<s...

<ol>
	<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation.">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li><li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene.">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function.">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li><li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HF-1a/HF-1b/MEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression.">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart.">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li><li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network.">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li><li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development.">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li><li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4.">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li><li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis.">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li><li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo.">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li><li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line.">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube.">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li></ol>

Метод, описанный здесь является относительно простым для изучения развития желудочковой камеры, без выполнения трудоемких эксперименты на этикетке желудочка или сердечной конкретных структурных генов и белков. Таким образом этот метод минимизирует технические изменчивости, которые...

Камеры формирования во время разработки сердца является сложным процессом перехода через несколько морфологически различные эмбриональных стадий1,2. Форме полумесяца сердечной прогениторных клеток населения образует трубу линейной сердца и затем подвергается удлинение и циклы в форму спирали развивающихся сердца. После его septation процесса развивающегося сердце превращается в четырех-сердце. Перерыва какого-либо из этих процессов в результате пороков развития сердца. Таким образом важно понять молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования палаты во время разработки сердца. Несмотря на многочисленные предыдущие исследования по развитию сердца наше понимание этого сложного процесса, остается ограниченным.
Гибридизации in situ, иммуногистохимия и бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей широко использовался для изучения формирования палаты во время разработки сердца мыши, снабдив сердечной конкретных или камеры конкретных структурных генов или белки (например, НПЛН, переворот-TFII, Irx4, док 2a и док 2v)3,4,5,6,,78,9,10. Однако, эти эксперименты с использованием эмбрионов мыши требуется значительное время и опыт, потому что несколько различных экспериментальных шаги должны быть выполнены последовательно11. Здесь мы описываем метод простой всю гору epifluorescent микроскопии визуализировать развивающихся желудочков с использованием эмбрионов, расчлененный от док 2v-tdTomato репортер мышей стук в12. Преимущество этого метода по сравнению с ранее использовавшихся методов, чтобы избежать сложных экспериментальные шаги, которые часто может создать экспериментальные варианты. Основной целью настоящего Протокола является описать как вскрыть зародышей мыши и развивающихся сердца и изучить каждый этап развития сердечной камеры мыши без утомительного гистохимические экспериментов. Этот метод легко может применяться для оценки развития сердца, с использованием различных других трансгенные мыши линии маркировки ранней сердечной маркеров (например, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Роза mT /MG14, Nkx2-5Cre: Роза mT/мг14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Роза mT/мг14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15и TgMef2c-AHF-GFP16 мышей).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:647px;" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">MZ125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DNA ladder (100 bp)</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">epifluorescence dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GoTaq Green master Mix</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR machine (master cycler)</td>
			<td style="width:83px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6336000023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence

Цель настоящего Протокола заключается в описания метода для визуализации желудочков палат эмбриона мыши во время разработки сердца с помощью желудочков конкретных флуоресцентные репортер стук в мышах (док 2v-tdTomato мышей) и dissection зародышей мыши. Сердце развития включает в себя формирование трубки линейной сердце, сердце трубки циклов и четыре камеры septation. Эти сложные процессы сохраняются весьма всех позвоночных. Сердце эмбриона мыши широко используется для развития исследований сердца. Однако из-за их крайне небольшой размер, рассекает мыши эмбриональные сердца технически сложным. Кроме того визуализация сердечной камеры формирования часто нуждается в гибридизации situ, бета галактозидазы окрашивание с помощью LacZ репортер мышей, или иммуноокрашивания секционного эмбриональных сердец. Здесь мы опишем, как вскрыть мыши эмбриональные сердца и непосредственно визуализировать желудочков камеры формирования док 2v-tdTomato мышей, используя всю гору epifluorescent микроскопии. С помощью этого метода возможность непосредственно изучить сердце трубки формирования и циклов и четыре камеры формирования без дальнейших экспериментальных манипуляций зародышей мыши. Хотя линия стук в мыши репортер док 2v-tdTomato используется в этот протокол в качестве примера, этот протокол может применяться на другие линии сердца конкретных флуоресцентные репортер трансгенные мыши.

В ходе развития сердца док 2v считается ранних маркер для желудочковой палата спецификации17. Как показано на рисунке 1, мы разобрал весь зародышей мыши и эмбриональных сердца от док 2v-tdTomato репортер забивные мышей и изучены док 2v-tdTomato репорте...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence at JoVE.com

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Мы представляем протоколы для изучения развития сердца мыши, с помощью микроскопии всю гору epifluorescent эмбрионов мыши, расчлененный от желудочков конкретных док 2v-tdTomato репортер забивные мышей. Этот метод позволяет нам непосредственно визуализировать каждый этап формирования желудочка во время разработки сердца мыши без трудоемкого гистохимические методы.

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Используя этот метод, мы можем непосредственно изучат образование сердечной трубки, цикл и полное образование камер без дальнейших экспериментальных манипуляций эмбриона мыши. Хотя, мы используем MLC-2v-tdTomato мышей в качестве примера, этот простой метод может быть широко использован с другими флуоресцентными линиями мыши репортера. Основным преимуществом этого протокола является то, что он очень прост и не требует каких-либо сложных методов или оборудования.Это может быть выполнено в обычной обстановке лаборатории. После спаривания самки с мышами мужского пола, как MLC-2v-tdTomato от 8 до 10 недель, проверить плотины для вагинальных пробки каждое утро. Положите беременных плотин, усыпляют в разные дни после coitum, в положении на спине и спрей живота с 70%этанола.Используйте острые хирургические ножницы и миппы, чтобы открыть брюшную полость путем разреза кожи и брюшной стенки. После обнаружения двусторонних рогов матки в спинной части брюшной полости, отделить всю матку с помощью острых хирургических ножниц и типсов, чтобы тщательно сократить выше яйцеклетки с обеих сторон. Поместите всю вскрытую матку в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS.Используя острые хирургические ножницы и типсы, тщательно отделяйте каждый амниотический мешок вдоль рога матки. Используйте пинцет для переноса каждого эмбриона в 35-миллиметровую культурную пластину, наполненную ледяным PBS. Используя острые хирургические ножницы и типсы, откройте амниотический мешок и разоблачите каждый эмбрион, отрезав пуповину, а затем обрежьте дополнительные эмбриональные ткани как можно больше, не повреждая эмбрионы.Под рассеченным микроскопом с помощью волоконно-оптического микроскопа иллюминатор отрежьте голову эмбриона и перенесите его в 1,5 миллилитровую трубку со 100 микролитров буфера А для более поздних генотипирования, чтобы соотнести с результатами эпифлуоресцентной визуализации. Используя тонкие миппы, откройте грудную клетку эмбриона. Острыми хирургическими ножницами и типсами удалите сердце из легких и сосудов.Используйте пинцет для переноса расчлененного эмбрионального сердца в 35-миллиметровую культурную пластину с ПОМОЩЬю PBS. Поместите пластину с эмбриональными сердцами мыши под эпифлюоресцентным рассечением микроскопа. Используйте тонкие миппы, чтобы распоставить эмбриональные сердца таким образом, чтобы развивающие желудочков сталкиваются с экспертом.Отрегулируйте фокус с помощью 0,63-х объектива в режиме яркого поля. Возьмите ярко-полевых экспозиций и захватить несколько изображений. Чтобы визуализировать экспрессию tdTomato, выключите микроскоп и установите фильтр для красной флуоресценции.При необходимости отрегулируйте фокусировку изображения, отрегулируйте яркость и контрастность, сделайте краснофлуоресцентные экспозиции и захватите несколько изображений. Для генотипирования эмбрионов кипячение ранее изолированных образцов головы в буфере А при 100 градусах Цельсия в течение 30 минут. Центрифуга в течение двух минут в 11, 360 раз G.Transfer 20 микролитров супернатанта в новую 1,5 миллилитровую трубку с 20 микролитров буфера B и смеси.Используйте 4,5 микролитера смешанного супернатанта в качестве шаблона ДНК и объедините его с 0,5 микролитров каждого из 10 микромолярно-специфических форвардов и реверсивных грунтовок, 10 микролитров полимеразы и буфера реакции 2x-premixed, а затем добавьте воду в общий объем 20 микролитров. Запустите ПЦР, как описано в рукописи. Загрузите завершенную реакцию в 100 базовой паре ДНК лестницы на 1%agarose гель и запустить на 140 вольт в 1x TAE буфера в течение 25 минут.Поместите завершенный гель на УФ-трансиллюминатор и включите ультрафиолетовый свет для идентификации полос ДНК. MLC-2v считается самым ранним маркером для желудочковой камеры спецификации во время развития сердца. В MLC-2v-tdTomato репортер стук в мышей, относительно слабое выражение tdTomato в линейной трубке сердца на E8.0 становится сильнее на E8.5, как показано с помощью цельно-монтировать эпифлурелсцентные изображения эмбрионов.Используя цельно-монтирующий эпифлурелсцентное изображение расчлененного сердца, образование желудочковой камеры во время развития сердца мыши можно легко определить. В расчлененном сердце от целого эмбриона мыши на E10.5, MLC-2v-tdTomato выражение репортера было показано в желудочковой части сердца, а не в тракте притока, отток тракта, или будущее atria. На E12.5 до E13.5, tdTomato репортер исключительно выражается в желудочках четырехколесного сердца.Аналогичная модель экспрессии желудочков была показана в расчлененном эмбрионе мыши на E16.5. После целой визуализации генотип эмбрионов был определен с использованием двух наборов грунтовок для генотипирования ПЦР, подтверждающих гомозиготные эмбрионы, несущие аллель tdTomato knock-in, гетерозигот и эмбрионы дикого типа. Этот метод довольно прост и прост в работе.Критическим шагом является вскрытие эмбриональных сердец. Понимание сердечной анатомии во время развития сердца необходимо для успешной изоляции сердца от всего эмбриона.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Оптимизированный<em&gt; Экс-ово</em&gt; Культивирование куриных эмбрионов в продвинутых стадиях разработки

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

С помощью<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Вертикальный воздушно-капельных Культуры всей фетальных органов по изучению процессов развития во Mouse органогенеза

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Визуализация глазной борозды Superior во время эмбриогенеза данио рерио

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...