Name: analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00
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Este trabajo fue financiado por los NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) y Gilead Sciences (Y.-J. programa de investigación N).

Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación del Comité de uso y Vanderbilt University Medical centro institucional Animal Care.
1. disección y colección de embriones de ratón
<ol><li>Compañero de 8-10 semanas de edad hembra MLC-2v-tdTomato+- ratones con 8-10 semanas viejo MLC-2v-tdTomato+- ratones machos para obtener MLC-2v-tdTomato+ / +, MLC-2v-tdTomato+- y MLC-2v-tdTomato- / - embriones.</li>
	<li>Compru...

<ol>
	<li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+lineage+development.">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li><li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation.">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li><li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene.">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function.">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li><li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HF-1a/HF-1b/MEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression.">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart.">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li><li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network.">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li><li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development.">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li><li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4.">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li><li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis.">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li><li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo.">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li><li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line.">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube.">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li></ol>

El método descrito aquí es relativamente simple examinar el desarrollo de la Cámara ventricular, sin realizar experimentos que requieren mucho trabajo para etiqueta proteínas o genes estructurales cardiacos específicos o ventriculares. Por lo tanto, este método reduce al mínimo la variabilidad técnica que se encuentra a menudo en las secciones de corazón immunostained.
Hay dos pasos fundamentales para realizar con éxito este método como estimación precisa de la edad embrionaria de ...

Formación de la cámara durante el desarrollo del corazón es un complejo proceso de transición a través de varias etapas embrionarias morfológicamente distintos1,2. La forma crescent de células progenitoras cardíacas de la población forma un tubo lineal corazón y entonces sufre alargamiento y colocación para formar la forma espiral del corazón en desarrollo. Después de su proceso de tabicación, pleno en desarrollo se transforma en el corazón de cuatro cámaras. Interrupción de cualquiera de estos procesos resulta en defectos del desarrollo del corazón. Por lo tanto, es importante entender los mecanismos moleculares subyacentes la formación de la cámara durante el desarrollo del corazón. A pesar de numerosos estudios anteriores en el desarrollo del corazón, nuestra comprensión de este complejo proceso es limitada.
Hibridación in situ, inmunohistoquímica y la beta-galactosidasa coloración utilizando ratones de reportero LacZ han sido ampliamente utilizados para el estudio de formación de cámara durante el desarrollo del corazón de ratón por etiquetado cardiaco específico o compartimiento específicos genes estructurales o proteínas (por ejemplo, Nppa, golpe TFII, Irx4, MLC-2a MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, estos experimentos con embriones de ratón requieren mucho tiempo y conocimientos, porque varios pasos experimentales diferentes tienen que ser realizadas secuencialmente11. Aquí, describimos un método de microscopía epifluorescente de montaje todo simple para visualizar los ventrículos en desarrollo embriones disecados de MLC-2v-tdTomato reportero ratones knock-in12. La ventaja de este método en comparación con los métodos previamente utilizados es evitar complejos pasos experimentales que a menudo pueden crear variaciones experimentales. El objetivo principal de este protocolo es describir cómo diseccionar embriones de ratón y corazones en vías de desarrollo y examinar cada etapa de desarrollo de cámara cardiaca ratón sin experimentos histoquímicos tediosos. Este método se puede aplicar fácilmente para evaluar el desarrollo del corazón con varias otras líneas de ratón transgénico etiquetado marcadores cardiacos tempranos (por ejemplo, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: mT Rosa /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mG/mT14, eGFP Hcn415, Isl1Cre: Rosa mG/mT14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15y TgMef2c-AHF-GFP16 ratones).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:647px;" width="647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">MZ125</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DNA ladder (100 bp)</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G2101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">epifluorescence dissecting microscope</td>
			<td style="width:83px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M165 FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">GoTaq Green master Mix</td>
			<td style="width:83px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR machine (master cycler)</td>
			<td style="width:83px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6336000023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac chamber development during mouse embryogenesis using whole mount epifluorescence

El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección de embriones de ratón y visualización de cámaras ventriculares embrionarias de ratón durante el desarrollo del corazón con ventrículo reportero fluorescente específico knock-en ratones (MLC-2v-tdTomato). Desarrollo del corazón consiste en una formación de tubo lineal de corazón, el tubo de corazón bucle y cuatro de cámara de tabicación. Estos complejos procesos son altamente conservados en todos los vertebrados. El corazón embrionario de ratón ha sido ampliamente utilizado para los estudios del desarrollo del corazón. Sin embargo, debido a su tamaño extremadamente pequeño, disección de corazón de embrión de ratón es un desafío técnico. Además, la visualización de la formación de la cámara cardiaca a menudo necesita hibridación in situ, beta-galactosidasa que manchaba usando ratones de reportero LacZ, o immunostaining del corazón embrionario seccionado. Aquí, describimos cómo diseccionar el corazón embrionario de ratón y visualizar directamente la formación de la Cámara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratones utilizando microscopía epifluorescente Monte todo. Con este método, es posible examinar directamente la formación del tubo corazón y bucle y 4 formación de la cámara sin más manipulación experimental de embriones de ratón. Aunque la línea de ratón knock-in de reportero de MLC-2v-tdTomato se utiliza en este protocolo como un ejemplo, este protocolo se puede aplicar a otras líneas de ratón transgénico de reportero fluorescente específica de corazón.

Durante el desarrollo del corazón, MLC-2v se considera ser el marcador más temprano para Cámara ventricular especificación17. Como se muestra en la figura 1, diseca el corazón embrionario de MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones y embriones todo ratón y examinado MLC-2v-tdTomato expresión de reportero durante el desarrollo del corazón. En MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones, expresión constitutiva tdTomato en pleno...

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Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Usando este método podemos examinar directamente la formación de tubos cardíacos, bucles, y la formación de cámara completa sin más manipulaciones experimentales del embrión de ratón. Aunque, utilizamos ratones MLC-2v-tdTomato como ejemplo, este método simple se puede utilizar ampliamente con otras líneas fluorescentes de ratón reportero. La principal ventaja de este protocolo es que es muy simple y no requiere ninguna técnica o equipo complejo.Se puede realizar en entornos de laboratorio regulares. Después de aparear a las hembras con ratones machos, ambos MLC-2v-tdTomato 8 a 10 semanas de edad, revise las presas en busca de tapones vaginales cada mañana. Colocar las presas embarazadas, eutanizadas en diferentes días después del coitum, en posición supina y rociar el abdomen con 70%etanol.Utilice tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps para abrir la cavidad abdominal mediante la incisión de la piel y la pared abdominal. Después de localizar cuernos uterinos bilaterales en la parte dorsal de la cavidad abdominal, separe todo el útero usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps para cortar cuidadosamente por encima de los oviductos en ambos lados. Coloque todo el útero diseccionado en una placa petri de 10 centímetros con PBS helado.Usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, separe cuidadosamente cada saco amniótico a lo largo del cuerno uterino. Utilice pinzas para transferir cada embrión a una placa de cultivo de 35 milímetros llena de PBS helado. Usando tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, abra un saco amniótico y exponga cada embrión cortando el cordón umbilical y luego recorte los tejidos embrionarios adicionales tanto como sea posible sin dañar los embriones.Bajo un microscopio de disección con un iluminador de microscopio de fibra óptica, corte la cabeza del embrión y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros con 100 microlitros de tampón A para que su genotipado posterior se correlacione con los resultados de la imagen epifluorescente. Usando fórceps finos, abre el pecho del embrión. Con tijeras quirúrgicas afiladas y fórceps, retire el corazón lejos de los pulmones y la vasculatura.Utilice pinzas para transferir el corazón embrionario diseccionado a una placa de cultivo de 35 milímetros con PBS. Coloque la placa con corazones embrionarios de ratón bajo un microscopio de disección epifluorescente. Utilice fórceps finos para colocar los corazones embrionarios de manera que los ventrículos en desarrollo estén frente al examinador.Ajuste el enfoque utilizando un objetivo de 0,63x en modo de campo brillante. Tome exposiciones de campo brillante y capture varias imágenes. Para visualizar la expresión tdTomato, apague un iluminador de microscopio de fibra óptica y configure el filtro para la fluorescencia roja.Reajuste el enfoque de la imagen si es necesario, ajuste el brillo y el contraste, tome exposiciones rojo-fluorescentes y capture varias imágenes. Para el genotipado de embriones, hierva muestras de cabeza previamente aisladas en el tampón A a 100 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifugadora durante dos minutos a 11, 360 veces G.Transfer 20 microlitros de sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 mililitros con 20 microlitros de tampón B y mezclar.Utilice 4,5 microlitros del sobrenadante mixto como plantilla de ADN y combínelo con 0,5 microlitros de cada uno de los 10 primeros específicos de micromolar, 10 microlitros de polimerasa premezclada 2x y tamp buffer de reacción y luego agregue agua a un volumen total de 20 microlitros. Ejecute un PCR como se describe en el manuscrito. Cargue la reacción completa en la escalera de ADN de 100 pares de bases en un gel de 1% de agarosa y corra a 140 voltios en 1x tampón TAE durante 25 minutos.Coloque el gel completo en un transilluminador UV y encienda la luz UV para identificar las bandas de ADN. MLC-2v se considera el marcador más temprano para la especificación de la cámara ventricular durante el desarrollo del corazón. En ratones con impactos de reportero de MLC-2v-tdTomato, la expresión relativamente débil de tdTomato en el tubo cardíaco lineal en E8.0 se hace más fuerte en E8.5 como se muestra utilizando imágenes epiflourescentes de montaje integral de los embriones.Mediante el uso de imágenes epiflourescentes de montaje completo del corazón diseccionado, la formación de la cámara ventricular durante el desarrollo del corazón del ratón se puede determinar fácilmente. En el corazón diseccionado de un embrión de ratón entero en E10.5, la expresión del reportero MLC-2v-tdTomato se mostró en la porción ventricular del corazón y no en el tracto de entrada, el tracto de salida o las aurículas futuras. En E12.5 a E13.5, el reportero de tdTomato se expresa exclusivamente en los ventrículos del corazón de cuatro cámaras.El patrón de expresión específico del ventricular similar se mostró en el embrión de ratón diseccionado en E16.5. Después de imágenes enteras, el genotipo de los embriones se determinó utilizando dos conjuntos de imprimadores para el genotipado de PCR, confirmando embriones homocigotos que llevaban el alelo knock-in tdTomato, heterocigoto y los embriones de tipo salvaje. Este método es bastante sencillo y fácil de realizar.El paso crítico es diseccionar corazones embrionarios. Comprender la anatomía cardíaca durante el desarrollo cardíaco es necesario aislar con éxito el corazón de todo el embrión.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

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Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

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