Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

نحن نعترف بجميع موظفي خدمات الحياة البرية في وزارة الزراعة الأمريكية الذين قاموا حاليًا أو سبق لهم بجمع عينات معززة لمراقبة داء الكلب وأجروا DRIT لتشخيص داء الكلب. وبالمثل، نعترف بالعديد من المتعاونين الذين يساعدوننا في جمع مراقبة داء الكلب المعزز. كما نشكر مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومعهد ويستار على إمكانية الوصول إلى الكواشف الحرجة اللازمة لإجراء عملية DRIT وعلى توفير فرص التدريب. وبالإضافة إلى ذلك، نقدر التشخيص المؤكد والمساعدة التقنية التي تقدمها مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها ومركز وادسوورث مع وزارة الصحة في ولاية نيويورك. استخدام أي منتجات تجارية هو لأغراض المقارنة فقط ولا يشكل تأييد.

وينبغي أن يتلقى كل شخص يجري اختبارات تشخيصية لداء الكلب سلسلة تطعيم قياسية قبل التعرض لداء الكلب وأن يخضع لتقييم منتظم للأجسام المضادة المصلية، مع التحصينات المعززة حسب الحاجة. ولا ينبغي للأفراد الذين لا يُعون عددهم أن يدخلوا المختبرات أو المناطق التي يُضطلع فيها بهذا العمل. وينبغي إجراء جميع أنواع التلاعب بالأنسجة والشرائح لعدم الهباء الجوي للسوائل أو إنتاج جزيئات محمولة جواً. أغطية الدخان ليست مطلوبة ولكن عندما يكون ذلك ممكنا أنها يمكن أن توفر حماية إضافية من الروائح، والطفيليات الخارجية، وشظايا العظام. وينبغي ارتداء الحد الأدنى من معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات وحماية العين، في جميع الأوقات أثناء جمع العينات واختبارها.
1. مجموعة جذع الدماغ
<ol><li>جمع عينات جذع الدماغ إما على الفور عند جمع الذبيحة أو التأكد من أن يتم وضع الذبيحة في الثلاجات للتخزين حتى وقت لاحق اختبار. إذا تم تجميد الذبيحة الحيوانية، ذوبان في درجة الحرارة المحيطة قبل جمع جذع الدماغ لسهولة جمع. في بعض الظروف، يتم جمع العينات مباشرة من الحيوانات المجمدة.</li>
	<li>
بالنسبة للالحيوانات التي يتم جمعها حديثًا أو التي تم إذابتها إلى درجة الحرارة المحيطة، ضع السوبين الحيواني على سطح مستو مع العمود الفقري العنقي الذي يدور قليلاً نحو الفاحص. Palpate لتحديد المفصل الأكانتو القذالي على الجانب الجانبي للعمود الفقري العنقي.
	<ol>
<li>للجثث التي لا تزال مجمدة تماما، ووضع supine الحيوان كما هو موضح أعلاه، إذا كانت عملية. استخدام المناشير والسكاكين والمقصات العظام أو معدات مماثلة لفصل الرأس تماما من الجسم. ملاحظة: وينبغي تنظيف جميع المعدات المستخدمة التي لا تستخدم لمرة واحدة بدقة بين العينات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>باستخدام شفرة مشرط، قم بإجراء شق على مستوى المفصل القذالي الأكانتو في الجانب البطني، وقطع جميع طبقات العضلات والأنسجة الرخوة، بما في ذلك القصبة الهوائية والمريء. استمر حتى تقريب الجانب الأمامي من فقرات العمود الفقري العنقي. للأنسجة المجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أي طبقات متبقية من العضلات والأنسجة الرخوة لفضح ماغنوم اللبو.</li>
	<li>نقل رأس الحيوان إلى تمديد المدى النهائي حتى جذع الدماغ مرئية. استخدم شفرة مشرط لإزالة جميع أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي المرئية لأخذ العينات. للحصول على عينة مجمدة، استخدم شفرة مشرط لإزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة جذع الدماغ/الجهاز العصبي الوطني المجمدة من داخل الجمجمة.</li>
	<li>وضع عينات جذع الدماغ في حاوية غير قابلة للكسر (أي القصدير مرهم معدني، القارورة بالتبريد، وما إلى ذلك) والتسمية وفقا لذلك.</li>
	<li>تأكد من أن عينات جذع الدماغ يتم اختبارها مباشرة بعد جمعها عن طريق اختبار DRIT، المبردة (4 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الاختبار، أو المجمدة (-20 درجة مئوية) حتى وقت الاختبار إذا كان الاختبار سيتم أكثر من 24 ساعة بعد جمع العينة.</li>
</ol>2. إعداد المواد لDRIT
<ol><li>
إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح (الشكل 1) ملاحظة: أطباق تلطيخ عميقة بما فيه الكفاية للسماح لغمر كامل من الشريحة (قطرها 96 ملم، وارتفاع 72 ملم، وعمق 42 ملم، وحجم 250 مل). 6<ol>
<li>ملء طبق 1 مع 10٪ الفوسفات المخزنة رسميان المخزنة. استبدال الفورماين بعد 2 تشغيل الاختبار أو أسبوعيا.</li>
		<li>ملء الأطباق 2، 4، و 5 مع الفوسفات المخزنة المالحة مع 1٪ توين-80 (TPBS). يستعاض عنها بـ TPBS جديدة قبل كل اختبار.</li>
		<li>ملء طبق 3 مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪. استبدال بيروكسيد الهيدروجين قبل كل اختبار.</li>
		<li>ملء الأطباق 6 و 8 و 9 و 10 مع الماء المقطر أو منزوع الأيونات. استبدال الماء قبل كل اختبار.</li>
		<li>ملء طبق 7 مع صياغة هيماتوإكسلين جيل #2 المخفف ة في نسبة 1:1 في الماء المقطر6. استبدال هيماتوإكسلين بعد 2 أشواط الاختبار أو أسبوعيا. ملاحظة: وفقا لبروتوكول DRIT الأصلي التي وضعتها CDC12، يمكن استخدام نسبة 1:2 من الخلل هيماتوإكسيلين إلى الماء إذا كان التلطيخ المضاد مظلما جدا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد محلول الأسهم الأمينية-إيثيلكاربازول (AEC)
	<ol>
<li>باستخدام ماصة زجاجية، ضع 5 مل من N، N-dimethylformamide في وعاء زجاجي.</li>
		<li>إضافة قرص واحد 20 ملغ من 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول ويهز حتى يذوب تماما. تسمية جرة مع "AEC الأسهم" وتاريخ إجراء الأسهم. ملاحظة: يمكن تخزين محلول مخزون AEC تحت التبريد (4 درجة مئوية) واستخدامه لمدة 1-2 أشهر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد تخفيف عمل الجماعة الاقتصادية الأفريقية
	<ol>
<li>إضافة 7 مل من العازلة خلات إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.</li>
		<li>باستخدام ماصة زجاجية، أضف 0.5 مل من محلول مخزون AEC إلى أنبوب الطرد المركزي.</li>
		<li>إضافة 0.075 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ إلى الأنبوب.</li>
		<li>تصفية الحل باستخدام حقنة 10 مل باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرومتر. ملاحظة: يجب إنشاء تخفيف العمل AEC فقط قبل كل اختبار DRIT كما أنها مستقرة فقط لمدة 2-3 ساعة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. اختبار الكيمياء المناعية السريعة المباشرة
<ol><li>
تسمية الزجاج المجهر الشرائح مع عدد فريد من نوعه لكل عينة باستخدام مسحة واقية، للماء، علامة الحبر الدائم.
	<ol>
<li>باستخدام شفرة مشرط، قم بإزالة جذع الدماغ من الحاوية ومكانه على منشفة ورقية. لطخة بلطف بعيدا أي فائض من السوائل, الدم, أو الفراء مع منشفة ورقية ثانية للكشف عن الأنسجة الجذعية للدماغ فقط13. إذا لزم الأمر، قسم أنسجة جذع الدماغ للكشف عن مقطع عرضي.</li>
		<li>لمس بلطف جدا الشريحة المجهر إلى المقطع العرضي من أنسجة جذع الدماغ. لمس الشريحة إلى جذع الدماغ في عدة نقاط دون حركة جانبية للسماح لمناطق متعددة من جذع الدماغ ليتم نقلها إلى الشريحة13. تأكد من نقل 1 أو 2 طبقات فقط من الخلايا من أنسجة الدماغ إلى الشريحة بلمسة لطيفة. لا حاجة إلى عامل تصاعد لتثبيت أنسجة جذع الدماغ إلى الشرائح. تضمين كل من عنصر تحكم إيجابي وسلبي في كل تشغيل DRIT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>اسمحوا الشرائح الهواء الجاف لمدة 5 دقائق تقريبا في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تزج الشرائح في 10٪ الرسمي المخزنة لمدة 10 دقيقة (طبق 1).</li>
	<li>إزالة الشرائح من شكلي وشطف تراجع في حل TPBS (الطبق 2).</li>
	<li>تزج الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق (طبق 3).</li>
	<li>إزالة الشرائح من بيروكسيد الهيدروجين وتراجع شطف في TPBS الطازجة (الطبق 4). بعد إزالة بيروكسيد الهيدروجين الزائد، ضع الشرائح في TPBS الطازجة (الطبق 5) والعمل مع شريحة واحدة في وقت واحد في حين أن الشرائح الأخرى تبقى مغمورة في TPBS.</li>
	<li>تأخذ الشرائح من TPBS (طبق 5) واحد في وقت واحد، ويهز قبالة ووصمة عار العازلة الزائدة، ووضعها على منشفة ورقية مبللة على مقاعد البدلاء المختبر، كأساس ل "غرفة الرطوبة". باستخدام ماصة، إسقاط ما يكفي من الأجسام المضادة لفيروس مكافحة داء الكلب الأولية على كل شريحة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي الوطني. احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في غرفة الرطوبة (أي، تغطي الشرائح مع لوحات جيدة أو غيرها من غطاءبسيط أثناء وضعها على منشفة ورقية مبللة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).</li>
	<li>إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة conjugate الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (إعادة استخدام نفس TPBS في الطبق 5).</li>
	<li>العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من مجمع streptavidin-بيروكسيداز لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ووصمة عار قبالة مجمع الزائدة، وتراجع شطف الشرائح في TPBS (الطبق 5).</li>
	<li>العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، والتخلص من ووصمة عار المخزن المؤقت الزائد، في حين أن آخرين البقاء مغمورة في TPBS - استخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من AEC (يتم شرح التحضير أعلاه، وينبغي أن يتم ذلك مباشرة قبل الاستخدام) لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركز. حضانة في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تراجع شطف الشرائح في الماء المقطر (طبق 6).</li>
	<li>ضع الشرائح في طبقة مضادة من جيل هيماتوكسيلين (مخفف1:1 مع الماء المقطر) لمدة دقيقتين (الطبق 7).</li>
	<li>على الفور تراجع شطف جميع الشرائح في الماء المقطر (طبق 8). كرر مرتين مع المياه العذبة في كل مرة (أطباق 9 و 10).</li>
	<li>العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، في حين أن الآخرين البقاء مغمورة في الماء المقطر (الطبق 10) - يهز ووصمة عار من الماء الزائد واستخدام وسيلة تركيب قابلة للذوبان في الماء لتثبيت زلة غطاء.</li>
	<li>استخدام المجهر الخفيف مع هدف 20X لعرض الشرائح والهدف 40X إذا كان هناك حاجة إلى فحص أوثق.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وDRIT هو طريقة مرنة مناسبة للمراقبة الميدانية للكشف عن وجود فيروس داء الكلب التي يمكن استخدامها في مناطق المختبرات اللامركزية. في حين أنه من الممكن إجراء الاختبار بأكمله في بيئة ميدانية مثل على الباب الخلفي للشاحنة، فمن المثالي أن يكون هناك مساحة داخلية صغيرة مخصصة لDRIT بسبب المواد الكيميائية والمعدات وقضايا تخزين الإمدادات. بالإضافة إلى ذلك، يجب النظر في الالتزام بجميع القوانين الاتحادية وقوانين الولايات والقوانين المحلية المعمول بها، واللوائح الخاصة باستخدام المواد الكيميائية والتخلص منها. حاليا، وزارة الزراعة WS لديها 15 مرافق DRIT لاختبار عينات من 17 ولاية. يتم إنشاء مرافق وزارة الزراعة الأمريكية WS DRIT بالتعاون مع مختبرات الصحة العامة الجامعية والحكومية، في غرف مخصصة داخل مرافق أكبر وفي مقطورات مغلقة تم تعديلها وتحويلها لتكون بمثابة وحدات اختبار متنقلة في حالة الاستجابة لفاشية الطوارئ حيث اختبار مراقبة داء الكلبالمعزز مع وقت التحول الفوري أمر بالغ الأهمية (الشكل 5).
في حين أن الاختبار كان ناجحا باستخدام مادة جذع الدماغ ذات جودة متغيرة، الأنسجة الجذعية الجديدة مع عدم وجود تحلل الأنسجة هو الأمثل. كما يحدث التحلل، والجفاف، أو تسييل، وانخفاض نوعية العينة والاختبار قد الكشف عن تلطيخ أكثر غير محددة التي يمكن أن تخلط بين النتائج. هذه الملاحظة مماثلة بين DFA وDRIT2. وينبغي جمع جذع الدماغ/الجهاز العصبي المركزي في أقرب وقت ممكن ثم تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) حتى الاختبار.
بشكل عام، معظم USDA WS مرافق عملية من 12 إلى 24 الشرائح في وقت واحد أثناء جلسة DRIT، بما في ذلك عنصر تحكم إيجابي واحد وعنصر تحكم سلبي واحد التي تم تأكيدها عبر DFA. وتوفر الضوابط الإيجابية والسلبية نقطة مرجعية لكل تشغيل DRIT لضمان نجاح الاختبار وللتأكد مما إذا كانت الأسئلة التفسيرية تنشأ على شرائح الاختبار. إذا لم يتم تحديد عينة أن يكون لها نتيجة إيجابية أو سلبية واضحة، يتم وصفها بأنها غير محددة واختبارها مرة ثانية من قبل DRIT. إذا لم تكن هذه العينة إيجابية أو سلبية واضحة بعد اختبارين DRIT، يتم إرسالها إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات ذات الصلة.
كما هو الحال مع أي اختبار تشخيصي، "مشكلة اطلاق النار" مفيد مع نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال، إذا كان تشغيل DRIT غير ناجح (أي، لا يعرض عنصر التحكم الإيجابي +3 أو +4 كثافة تلطيخ وتوزيع مستضد)، تأكد من عدم انتهاء صلاحية كافة المواد الكيميائية والكواشف. لقد وجدنا باستخدام زجاجة مفتوحة حديثا من بيروكسيد الهيدروجين في الحد الأدنى مرة واحدة في الأسبوع هو مفيد للمساعدة في منع تلطيخ غير محددة من خلال أكسدة أنسجة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، نوصي استبدال المخزن المؤقت خلات مرة واحدة على الأقل كل عام على الأقل، بغض النظر عن تاريخ انتهاء الصلاحية المسمى.
هناك عدد من المزايا من DRIT على DFA بما في ذلك انخفاض التكاليف، والقدرة على إجراء الاختبار خارج مختبر مركزي، والحاجة إلى مجهرية خفيفة فقط بدلا من المجهر الفلورسنت، وعملية التدريب مباشرة نسبيا ل الناس إدارة وقراءةالاختبار 2،3،4. وقد أثبتت هذه المزايا، إلى جانب حساسية وخصوصية DRIT التي يمكن مقارنتها DFA2و7و8و9 أن الاختبار بمثابة أداة هامة على نطاق واسع تعزيز برامج مراقبة داء الكلب8،10 في أمريكا الشمالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح هذه اللجنة بزيادة المراقبة والاختبار الفوري في البلدان النامية أو في مناطق أخرى ذات موارد محدودة، لا سيما بعد التوجيهات الأخيرة التي أصدرتها منظمة الصحة العالمية/منظمة الصحة العالمية كاختبار موصى به.

في حين أن DFA هو الاختبار الأكثر استخداما لتشخيص داء الكلب الروتيني1،فإن تكلفة شراء وصيانة المجهر الفلورسنت يمكن أن تكون محدودة للدول النامية2،3،4 وعلى نطاق واسع، برامج مراقبة داء الكلب على نطاق واسع3و4. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وزارة الخارجية تتطلب القدرة على تبريد العينات أثناء التثبيت واحتضان العينات فوق درجة الحرارة المحيطة أثناء تفاعلات مستضد الأجسام المضادة، والتي يمكن أن تشكل عقبة كبيرة في البلدان التي لا توجد فيها بنية تحتية مناسبة. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود المرتبطة باختبارات DFA الحديثة، وقد تم التقليل من الأثر العالمي لداء الكلب منذ فترة طويلة5.
وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب على الصعيد العالمي، ولا سيما في البلدان النامية. يوفر بروتوكول DRIT المعروض هنا بديلاً مختبرياً أو ميدانياً للاختبار على بروتوكول DFA يستخدم الفحص المجهري الخفيفولا يتطلب التبريد أو الحضانة المختبرية أثناء الاختبار 6. DRIT وDFA متشابهة في أن كلا الأسلوبين استخدام انطباعات اللمس من عينات الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات التي يحتمل أن تكون مسعورة. ومع ذلك، فإن الخطوة الأولى من DRIT يستخدم formalin كالمثبت التاريخي للعينات، مما يعطل فيروس داء الكلب. وهذا يوفر تحسنا كبيرا في السلامة الأحيائية على الأسيتون المستخدم لإصلاح العينات في بروتوكول DFA3، وهو أمر مهم ليس فقط في المختبر ولكن ربما أكثر من ذلك في بيئات المختبر الميدانية أو اللامركزية. حتى الآن، يظهر DRIT حساسية وخصوصيةمساوية لDFA 2،7،8،9.
منذ عام 2005، قام برنامج WS التابع لوزارة الزراعة الأميركية بجهود مراقبة داء الكلب المعززة على نطاق واسع في أمريكا الشمالية باستخدام DRIT كجزء من برنامج شامل لإدارة داء الكلب البرية 10. يتم استخدام مراقبة داء الكلب المعززة كتكملة لمراقبة الصحة العامة القائمة على التعرض والاختبارات في المقام الأول أنواع الحيوانات البرية meso-carnivore، بما في ذلك الراكون(Procyon lotor)،الظربان المخطط (mephitismephitis)،الثعالب الرمادية ( Urocyon cinereoargenteus)، الثعالب الحمراء(الفرجالفرج) ، والقيوط (كانيسلاترانس)التي لم تشارك في التعرض للحيوانية البشرية أو المنزلية. وقدمت جثث الحيوانات المستخدمة في الاختبار إلى وزارة الزراعة الأمريكية WS من خلال جهود تعزيز مراقبة داء الكلب وتتألف من أنواع ناقلات داء الكلب التي هي: سوء أو غريب التمثيل; العثور على القتلى ، وقتل على الطرق ، أو مصدر إزعاج ؛ ولا ترتبط بتعرض الحيوانات البشرية أو المنزلية. يوفر DRIT اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل علماء الأحياء الميدانية المدربين مع خبرة مختبرية قليلة أو معدومة لتحسين مراقبة داء الكلب والحد من العبء المالي وعبء العمل من مختبرات تشخيص الصحة العامة10. عادة ما يستغرق التدريب الأساسي لـ DRIT للموظفين الميدانيين في وزارة الزراعة الأميركية من 1.5 إلى 2 يومًا، والذي يتضمن حوالي 4 ساعات من التعليم في الفصول الدراسية الذي يغطي المبادئ الأساسية للسلامة البيولوجية، وطرق جمع العينات وعمليات DRIT، فضلاً عن >8 ساعة من وقت المختبر إجراء الاختبار. وقد أتيحت فرص التدريب لوزارة الزراعة الأميركية والمتعاونين في البرنامج من خلال مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC)، LYSSA LLC، ومعهد ويستار.
وفي مناطق الإدارة الاستراتيجية، قامت وزارة الزراعة الأمريكية باختبار أكثر من 94,000 عينة من الحيوانات البرية باستخدام DRIT واكتشفت أكثر من 1,850 عينة مسعورة من المرجح أن تكون قد لم يتم اكتشافها بالاعتماد فقط على اختبارات الصحة العامة للالحيوانات المشتبه فيها. تعزيز بيانات مراقبة داء الكلب التي توفرها نتائج DRIT حاسمة لتوفير تمثيل زمني ومكاني أكثر اكتمالا لداء الكلب في المناظر الطبيعية دعما لبرامج التطعيم عن طريق الفم ضد داء الكلب للحياة البرية في جميع أنحاء الولايات المتحدة الأمريكية10، 11. وبالمثل، أدرجت وكالات الحياة البرية الإقليمية في كندا DRIT في جهود مراقبة داءالكلب البري على نطاق واسع جنبا إلى جنب مع برامجها للصحة العامة بنجاح 8. وقد استخدمت كل من وزارة الزراعة الأمريكية WS والكندية DRIT برامج المراقبة المختبرات المرجعية الوطنية لتأكيد داء الكلب من قبل DFA وأداء البديل الفيروسي ة الكتابة حسب الاقتضاء8. وعلاوة على ذلك، يرسل علماء الأحياء الميدانيون التابعون لوزارة الزراعة الأمريكية 10% من العينات السلبية لتأكيد DFA إلى المختبرات المرجعية، ومنذ عام 2008، شاركوا في اختبار الكفاءة نصف السنوي لـ DRIT الذي يقدمه مختبر ولاية ويسكونسن للنظافة الصحية، كجزء من المعايير تدابير ضمان الجودة.
والهدف من هذه الطريقة هو تقديم نهج بديل لاختبار تشخيص داء الكلب الذي يمكن القيام به في المختبرات اللامركزية، في الميدان، أو في المناطق التي لا يمكن الوصول إليها بشكل روتيني إلى المجهر الإلكتروني.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

والمراقبة المختبرية جزء لا يتجزأ من جهود الوقاية من داء الكلب ومكافحته وإدارته. وفي حين أن وزارة الخارجية هي المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب، فإن هناك حاجة إلى التحقق من صحة تقنيات التشخيص الإضافية لتحسين مراقبة داء الكلب، ولا سيما في البلدان النامية. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لDRIT كخيار اختبار بديل أو مختبري أو ميداني يستخدم الفحص المجهري الخفيف مقارنة بـ DFA. يتم إصلاح انطباعات اللمس من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من الحيوانات المشتبه بها في 10٪ رسميا. يستخدم DRIT أجسام مضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة خاصة بفيروس الكلب (مترافقة مع البيوتين)، وأنزيم streptavidin-peroxidase، ومراسل كروموجين (مثل أسيتيل 3-أمينو-9-إيثيلكاربازول) للكشف عن التضمينات الفيروسية داخل الأنسجة المصابة. في حوالي 1 ساعة، يمكن اختبار عينة أنسجة الدماغ وتفسيرها من قبل DRIT. وقد أظهر تقييم العقول الحيوانية المشتبه فيها التي تم اختبارها من مجموعة متنوعة من الأنواع في أمريكا الشمالية وآسيا وأفريقيا وأوروبا حساسية عالية وخصوصية من قبل DRIT تقترب 100٪ مع النتائج مقارنة مع DFA. منذ عام 2005، قام برنامج خدمات الحياة البرية التابع لوزارة الزراعة في الولايات المتحدة بجهود معززة واسعة النطاق لمراقبة داء الكلب باستخدام DRIT لاختبار > 94,000 عينة تم جمعها من الحياة البرية في مناطق إدارة داء الكلب الاستراتيجية . يوفر DRIT أداة قوية واقتصادية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل العاملين وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين مراقبة داء الكلب الحالي، وبرامج الوقاية والسيطرة على الصعيد العالمي.

تظهر النتائج الإيجابية من DRIT التضمينات الفيروسية الحمراء intracytoplasmic التي يمكن أن تختلف في الشكل والحجم (الشكل 3) داخل السيتوبلازم من أجسام الخلايا المزرقة. تظهر التضمينات ناعمة مع هوامش مشرقة جداً ومنطقة مركزية أقل كثافة. يتم تسجيل الكثافة وتوزيع المستضد عند الكشف عن التضمينات. يتم تقدير الكثافة من +4 إلى +1. يجب أن يكون الشريحة التحكم الإيجابي مكثفة, تألق أرجواني صارخ الذي يشار إليه على أنه +4 كثافة. يمكن أن يحدث فقدان طفيف للون خاصة عندما لم يكن التعامل مع العينة الأمثل (أي أن الأنسجة عينة قد تحللت قليلا) وينبغي تصنيف هذه على أنها +3. يتم تصنيف وصمة عار مملة بشكل ملحوظ على أنها +2 إلى +1، لا تعتبر تشخيصية للعدوى بفيروس داء الكلب ووصفت بأنها غير محددة.
بالإضافة إلى ذلك، يتم تصنيف توزيع المستضد من +4 إلى +1 مع +4 الذي يمثل توزيع المستضد اتّصل بوفرة من التضمينات الكبيرة والصغيرة التي تختلف في الحجم والشكل، وموجودة في كل مجال (أو كل حقل تقريبًا) من العرض داخل أنسجة الجهاز العصبي الوطني لمس الانطباع. يحتوي عنصر التحكم الإيجابي عادةً على توزيع مستضد +4. سيتم تعيين توزيع مستضد +3 عندما تكون هناك تضمينات في مجموعة متنوعة من الأحجام في معظم مجالات العرض وليس كلها. إذا تم العثور على التضمينات في 10٪ -50٪ من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +2. عند العثور على التضمينات في <10% من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضد +1.
معظم أنسجة الجهاز العصبي الوطني مع فيروس داء الكلب الحالية تظهر التضمينات الفيروسية النموذجية التي تم تصنيفها على أنها +3 أو +4 كثافة وتوزيع مستضد. إذا كانت النتائج تشير إلى كثافة +2 أو +1 أو توزيع مستضد +2 أو +1، يتم تعريف العينة "غير محدد" ويكون هناك ما يبرر تكرار الاختبار. إذا كانت نفس العينة لديها نتيجة اختبار غير محددة تكرار، يجب إرسال العينة إلى مختبر مرجعي لDFA أو الاختبارات التأكيدية ذات الصلة.
تعتبر عينة الاختبار التي تستخدم DRIT سلبية لمستضدات فيروس داء الكلب بعد مسح الشريحة التي تحتوي على أنسجة الجهاز العصبي الوطني عندتكبير 200X أو أكثر ولم يتم الكشف عن أي إدراجات فيروس نموذجية (الشكل 4). عينات سلبية تظهر أجسام الخلايا مزرق مع تلطيخ قليلا أو لا محددة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> الشكل 1: إعداد 10 أطباق تلطيخ الشرائح مع الكواشف للاختبار. يتم تسمية الأطباق مع اسم كاشف في الترتيب اللازم لمتابعة البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> الشكل 2: غرفة الرطوبة بسيطة تم إنشاؤها باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية.  غرفة الرطوبة بسيطة باستخدام منشفة ورقية مبللة ولوحات ثقافة الخلية يسمح للتطبيق الميداني.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> الشكل 3: الشرائح التمثيلية لداء الكلب التضمينات الفيروسية الإيجابية مع +4 كثافة وتوزيع مستضد +4. (A و B)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 200x. (C و D)تظهر التضمينات الفيروسية داء الكلب إيجابية في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank"></a> ميكرومتر.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> الشكل 4: شرائح تمثيلية من العينات السلبية مع عدم وجود شوائب فيروسية داء الكلب. (A و B)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 200x. (C و D)تظهر عينات سلبية لالشموة الفيروسية داء الكلب في التكبير 400x. قضبان مقياس = 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank"></a> ميكرومتر.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> الشكل 5: الصور التمثيلية لمرافق اختبار DRIT التي تستخدمها وزارة الزراعة الأمريكية WS. (أ) مرفق اختبار متنقل في مقطورة مغلقة للنقل. (ب) مركبة ترفيهية تم تعديلها لاختبار DRIT. (ج) مرفق اختبار DRIT بالتعاون مع مختبر الجامعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

تعزيز مراقبة داء الكلب باستخدام اختبار سريع مباشر للمناعة الكيميائية

يوفر الاختبار المناعي المناعي السريع المباشر (DRIT) بديلاً معترفاً به من قبل المنظمة العالمية لصحة الحيوان ومنظمة الصحة العالمية (OIE/WHO) لاختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) لتشخيص داء الكلب. يسمح هذا الاختبار للتطبيقات الميدانية التي يمكن تنفيذها في حوالي 1 ساعة على انطباعات الدماغ باستخدام الفحص المجهري الخفيف.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

وDIT كبيرة لأنه يوفر اختبار تشخيص داء الكلب التي يمكن إجراؤها في المختبرات اللامركزية في الميدان أو في المناطق التي لا الوصول الروتيني إلى المجهر الإلكتروني. الميزة الرئيسية للDIT هو أنه يستخدم فقط المجهر الخفيفة بسيطة ويمكن الحصول على النتائج في ساعة واحدة تقريبا. يوفر DRIT أداة اقتصادية قوية لتشخيص داء الكلب التي يمكن استخدامها من قبل المختبرات وعلماء الأحياء الميدانية لتحسين برامج مراقبة داء الكلب والوقاية منه ومكافحته على مستوى العالم.بالنسبة للحيوانات التي يتم جمعها حديثا أو تم إذابة درجة الحرارة إلى درجة الحرارة المحيطة، ضع الحيوان على سطح مستو مع العمود الفقري العنقي استدارة قليلا نحو الفاحص. بالبات لتحديد المفصل القذالي الاتلانتو على الجانب الجانبي من العمود الفقري العنقي. باستخدام شفرة مشرط، قم بعمل شق على مستوى المفصل القذالي الاتلانتو في الجانب البطني يقطع جميع طبقات العضلات والأنسجة الرخوة بما في ذلك القصبة الهوائية والمريء.استمر حتى تقريبًا من الجانب الأمامي من فقرات العمود الفقري العنقي. ثم نقل رأس الحيوان إلى امتداد نطاق نهاية حتى جذع الدماغ مرئيا. استخدام شفرة مشرط لإزالة جميع الدماغ مرئية وأنسجة الجهاز العصبي المركزي لعينة.ضع عينات جذع الدماغ في حاوية غير قابلة للكسر وتسمية وفقا لذلك. أولاً، قم بإعداد أطباق تلطّخ تكون عميقة بما يكفي للسماح بالغمر الكامل لشريحة عينة. ملء طبق واحد مع 10٪ الفوسفات buffered formalin.ملء الأطباق اثنين وأربعة وخمسة مع TPBS. ملء الطبق الثالث مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪. ثم ملء الأطباق ستة وثمانية وتسعة و10 مع الماء المقطر أو ديوند.ملء الطبق سبعة مع تركيبة الهماوكسيلين جيل رقم اثنين المخفف في نسبة 1:1 مع الماء المقطر. لإعداد محلول الأسهم أميني إيثيل-كاربازول، وذلك باستخدام ماصة زجاجية، ضع خمسة ملليلترات من N، N-dimethylformamide في وعاء زجاجي. إضافة 120 ملليغرام قرص من 3-أمينو-9-ethylcarbazole إلى حاوية الزجاج ويهز حتى يذوب تماما.لإعداد تخفيف عمل AEC، أضف سبعة ملليلترات من مخزن الخلات المؤقت إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. استخدم ماصة زجاجية لإضافة 0.5 ملليلتر من محلول مخزون AEC إلى أنبوب الطرد المركزي. إضافة 0.75 ملليلتر من 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين.استخدام حقنة 10 ملليلتر مع 0.45 ميكرومتر حقنة مرشح لتصفية الحل. للبدء، استخدم علامة الحبر الدائم المقاوم للماء لمنع اللطاخة لتسمية شرائح المجهر الزجاجي مع عدد فريد لكل عينة. استخدام شفرة مشرط لإزالة جذع الدماغ من الحاوية ووضعها على منشفة ورقية.استخدام منشفة ورقية ثانية للطخة بلطف بعيدا أي السوائل الزائدة، والدم أو الفراء للكشف عن الأنسجة فقط جذع الدماغ. إذا لزم الأمر، قسم أنسجة جذع الدماغ للكشف عن المقطع المقطعي. لمسة بلطف جدا الشريحة المجهر إلى عدة نقاط من جذع الدماغ دون حركة جانبية للسماح مناطق متعددة من جذع الدماغ ليتم نقلها إلى الشريحة التأكد من أن يتم نقل واحد أو اثنين فقط من طبقات من الخلايا من أنسجة الدماغ إلى الشريحة.اتركي الهواء الجاف لمدة خمس دقائق تقريباً في درجة حرارة الغرفة. ثم غمر الشرائح في 10٪ buffered formalin في طبق واحد لمدة 10 دقائق. إزالة الشرائح من formalin وتراجع شطف لهم في حل TPBS في الطبق الثاني.غمر الشرائح المشطفة في محلول بيروكسيد الهيدروجين الوارد في الطبق الثالث لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، إزالة الشرائح من بيروكسيد الهيدروجين وتراجع شطفها في TPBS الطازجة الواردة في الطبق الرابع. بعد إزالة أي بيروكسيد الهيدروجين الزائد، ضع الشرائح في TPBS الطازجة الواردة في الطبق الخامس.تأخذ الشرائح واحد في وقت واحد من الطبق الخامس، والتخلص من وصمة عار أي العازلة الزائدة ووضع الشريحة على منشفة ورقية مبللة على مقاعد البدلاء المختبر. عندما تم نقل جميع الشرائح، استخدم القطارة أو ماصة لإسقاط ما يكفي من الأجسام المضادة الأولية للفيروس المضاد لمكافحة داء الكلب على كل شريحة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. تغطية الشرائح مع لوحات جيدا أو غطاء بسيط آخر لإنشاء غرفة الرطوبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، وتهز وصمة عار قبالة أي الاقتران الزائد وتراجع شطف الشرائح في TPBS في الطبق الخامس. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من TPBS واستخدام القطارة أو ماصة لإسقاط ما يكفي Streptavidin peroxidase المعقدة لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. مرة واحدة وقد تم تغطية جميع الشرائح، احتضان لهم في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ثم إزالة الشرائح من غرفة الرطوبة، يهز ولطخة قبالة أي مجمع الزائدة وتراجع شطف الشرائح في TPBS الواردة في الطبق الخامس. العمل مع شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من TPBS واستخدام ماصة لإسقاط ما يكفي من AEC حل العمل لتغطية أنسجة الجهاز العصبي المركزي. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.بعد هذا، تراجع شطف الشرائح في الماء المقطر الواردة في طبق ستة ووضعها في وضع مضاد للهماوكسيلين جيل في طبق سبعة لمدة دقيقتين. تراجع على الفور شطف جميع الشرائح في الماء المقطر في طبق ثمانية. كرر هذا مرتين باستخدام المياه العذبة في أطباق تسعة و 10 لكل غسل.العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة شريحة من الماء ويهز ولطخة قبالة أي المياه الزائدة. استخدام الماء القابل للذوبان تصاعد المتوسطة للصق غطاء على الشريحة. ثم استخدام المجهر الخفيفة مع هدف 20X لعرض الشرائح.تظهر النتائج الإيجابية من DRIT إدراجات فيروسية حمراء يمكن أن تختلف في الشكل والحجم داخل سيتوبلازم من أجسام الخلايا المزرقة. تظهر التضمينات على نحو سلس مع هوامش مشرقة للغاية ومنطقة مركزية أقل لطخة. يتم تصنيف توزيع المستضد من زائد أربعة إلى واحد زائد مع أربعة زائد تمثل توزيع المستضد تتألف من وفرة من إدراجات كبيرة وصغيرة متفاوتة في الحجم والشكل والحاضر في كل مجال من مجالات الرؤية داخل CNS نسيج لمس الانطباع.يتم تعيين توزيع زائد ثلاثة عند وجود تضمينات في مجموعة متنوعة من الأحجام في معظم ولكن ليس جميع حقول العرض. إذا تم العثور على التضمينات في 10 إلى 50٪ من حقول المجهر، يتم تعيين توزيع مستضدين زائد بينما يتم تعيين واحد زائد عند العثور على التضمينات في أقل من 10٪ من الحقول. معظم أنسجة الجهاز العصبي المركزي مع فيروس داء الكلب الحالي معرض إدراجات نموذجية الفيروسية متدرج كما زائد ثلاثة أو زائد أربعة كثافة وتوزيع المستضد.إذا كانت النتائج تشير إلى زائد واحد أو اثنين زائد في توزيع إما كثافة أو مستضد، يتم التصريح عن العينة غير محدد وتكرار الاختبار هو ما يبرره. تعتبر عينة الاختبار باستخدام DRIT سلبية بالنسبة لمستضدات فيروس داء الكلب بعد فحص الشريحة التي تحتوي على أنسجة الجهاز العصبي المركزي بتكبير 200X أو أكبر ولا يتم الكشف عن أي إدراجات نموذجية للفيروس. العينات السلبية المعرض أجسام الخلايا المزرق مع تلطيخ معين قليلة أو معدومة معروفة.وينبغي أن كل شخص إجراء اختبار داء الكلب التشخيص تلقي التطعيمات ما قبل التعرض القياسية وخضوعها لتقييم الأجسام المضادة المصلية العادية. وينبغي ألا يدخل الأفراد غير المحصنين المناطق التي يجري فيها هذا العمل. بالإضافة إلى الاحتياطات المتخذة عند العمل مع فيروس داء الكلب الحي، العديد من الكواشف المستخدمة في الاختبار خطرة.الرجوع إلى أوراق بيانات السلامة لكل كاشف.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

الطيور ترصد الأنفلونزا اتفاقية التجارة الحرة مع بطاقات : أساليب الميدانية ، الأحيائية ، وقضايا النقل محلولة

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق<em&gt; الدودي Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

استخدام تعزيز الفلورية الخضراء البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء الكلب

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

حقل ما بعد الوفاة داء الكلب اختبار تشخيصية مناعية سريعة لإعدادات الموارد المحدودة مع مزيد من التطبيقات الجزيئية

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...