Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
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我们感谢所有美国农业部野生动物服务部工作人员,他们目前或以前收集了增强的狂犬病监测样本,并进行了狂犬病诊断的DRIT。同样,我们感谢许多合作者,他们协助我们收集增强狂犬病监测。我们还感谢美国疾病控制和预防中心以及威斯塔研究所获得进行DRIT所需的关键试剂,并提供培训机会。此外,我们感谢疾病控制和预防中心以及沃兹沃斯中心与纽约州卫生局提供的确认诊断和技术援助。任何商业产品的使用仅用于比较目的,不构成背书。

进行狂犬病诊断测试的每个人应接受标准的接触前狂犬病疫苗接种系列,并定期进行血清抗体评估,并根据需要进行强化免疫。未接种疫苗的个人不应进入进行此类工作的实验室或区域。组织和幻灯片的所有操作都应进行,不得使液体气溶胶或产生空气中的颗粒。不需要抽油烟机,但在可行的情况下,它们可以提供额外的保护,防止异味、异物和骨碎片。在样品收集和测试期间,应始终佩戴最少的个人防护设备,包括手套和眼睛防护装置。
1. 脑干收集
<ol><li>收集尸体后立即收集脑干样本,或确保尸体放在冰柜中存放,直至日后测试。如果动物尸体被冻结,在脑干收集之前在环境温度下解冻,以便于收集。在某些情况下,样品直接从冷冻动物中收集。</li>
	<li>
对于新鲜收集或已解冻至环境温度的动物,将动物上部放在平坦的表面上,颈椎稍微向检查者旋转。在颈椎的侧侧识别关节。
	<ol>
<li>对于仍然完全冷冻的尸体,如果可行,则如上所述定位动物。使用锯子、刀、骨剪或类似设备将头部与身体完全分开。 注:所有使用的设备,不是一次性使用,应在样品之间彻底清洁。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用手术刀,在腹腔的腹腔内,在腹腔的腹腔关节水平上切开,切割所有肌肉和软组织层,包括气管和食道。继续,直到接近颈椎的外向。对于冷冻组织,使用手术刀刀片去除任何剩余的肌肉和软组织层,以暴露前体巨体。</li>
	<li>将动物的头部移到末端延伸,直到脑干可见。使用手术刀去除所有可见的脑干/中枢神经系统 (CNS) 组织进行取样。对于冷冻样品,使用手术刀刀片从颅内尽可能多地取出冷冻脑干/CNS组织。</li>
	<li>将脑干样品放入牢不可破的容器(即金属孔、冷冻瓶等)中,并贴上相应的标签。</li>
	<li>确保通过DRIT测试采集后立即对脑干样本进行测试,在测试前冷藏(4°C)长达24小时,或冷冻(-20°C),直到测试时间在样品收集后24小时以上进行。</li>
</ol>2. DRIT 材料的准备
<ol><li>
设置 10 个幻灯片染色盘(图 1) 注:染色盘足够深,可以完全浸入滑动(直径 96 mm,高度 72 毫米,深度 42 毫米,体积 250 mL)。6<ol>
<li>用10%磷酸盐缓冲形式填充菜盘1。在 2 次测试运行后或每周更换正式形式。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲盐水填充菜肴 2、4 和 5,加 1% 补间-80 (TPBS)。在每次测试前更换新的 TPBS。</li>
		<li>用3%过氧化氢填充菜盘3。在每次测试前更换过氧化氢。</li>
		<li>用蒸馏水或去离子水填充菜肴 6、8、9 和 10。每次测试前更换水。</li>
		<li>用吉尔斯血氧林配方填充菜盘7#2蒸馏水中1:1的比例稀释6。在 2 次测试运行或每周运行后更换血氧林。 注:根据CDC12开发的原始DRIT协议,如果反染色太暗,可以使用1:2的吉尔斯血氧林与水的比例。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
制备氨基乙基卡巴佐尔(AEC)库存溶液
	<ol>
<li>使用玻璃移液器,将 5 mL 的 N、N-二甲基甲酰胺放入玻璃容器中。</li>
		<li>加入一个20毫克片剂3-氨基-9-乙卡巴佐尔,摇匀,直到完全溶解。用"AEC 股票"和库存日期标记罐子。 注:AEC 库存溶液可在制冷 (4°C) 下储存,使用 1-2 个月。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
准备 AEC 工作稀释
	<ol>
<li>将7 mL醋酸缓冲液加入15 mL离心管。</li>
		<li>使用玻璃移液器,将 0.5 mL 的 AEC 库存溶液添加到离心管中。</li>
		<li>在管中加入 0.075 mL 的 3% 过氧化氢。</li>
		<li>使用 0.45 μm 注射器过滤器使用 10 mL 注射器过滤溶液。 注:AEC 工作稀释应在每次 DRIT 测试之前创建,因为它仅稳定 2-3 小时。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 直接快速免疫性-植物化学试验
<ol><li>
使用防污、防水、永久油墨标记为每个试样贴上标签玻璃显微镜,每个样品都有唯一编号。
	<ol>
<li>使用手术刀,从容器中取出脑干,放在纸巾上。用第二条纸巾轻轻涂抹任何多余的液体、血液或毛皮,才能显示脑干组织13。如果需要,截断脑干组织以显示横截面。</li>
		<li>非常轻轻地触摸显微镜滑到脑干组织的横截面。在不横向移动的情况下,将幻灯片触摸到脑干的几个点,以便将多个脑干区域转移到幻灯片13。确保只有1或2层细胞从脑组织转移到幻灯片与温柔的触摸。无需安装剂即可将脑干组织固定在幻灯片上。在每个 DRIT 运行中包括正负控制。</li>
	</ol>
</li>
	<li>让幻灯片在室温下风干约 5 分钟。</li>
	<li>将幻灯片浸入 10% 缓冲形式,10 分钟(第 1 盘)。</li>
	<li>在 TPBS 溶液(第 2 盘)中取出卡林的滑片并浸渍。</li>
	<li>将幻灯片浸入 3% 过氧化氢中 10 分钟(第 3 盘)。</li>
	<li>从过氧化氢中取出滑轨,在新鲜的 TPBS(第 4 盘)中浸渍。去除多余的过氧化氢后,将幻灯片放入新鲜的 TPBS(第 5 层),同时使用一张幻灯片,而其他幻灯片则浸入 TPBS 中。</li>
	<li>一次取一张TPBS(第5盘)的幻灯片,甩掉并涂抹多余的缓冲液,放在实验室长凳上的湿纸巾上,作为"湿度室"的基础。使用移液器,在每个幻灯片上放置足够的原发性抗狂犬病病毒抗体,以覆盖CNS组织。在室温下在湿度室中孵育幻灯片 10 分钟(即,在滑动板或其他简单盖上盖在湿纸巾上时覆盖幻灯片)(图 2)。</li>
	<li>从湿度室中取出滑片,摇动和抹掉多余的混聚,在 TPBS 中冲洗滑片(在盘 5 中重复使用相同的 TPBS)。</li>
	<li>一次使用一张幻灯片,而其他幻灯片则沉浸在 TPBS 中 - 使用移液器滴下足够的链球蛋白过氧化物酶复合物以覆盖 CNS 组织。在室温下在湿度室中孵育10分钟。</li>
	<li>从湿度室中取出幻灯片,摇动和抹布多余的复合物,并在 TPBS(第 5 盘)中冲洗幻灯片。</li>
	<li>一次使用一张幻灯片,甩掉并留下多余的缓冲液,而其他幻灯片则浸入 TPBS 中 - 使用移液器掉落足够的 AEC(上述说明,应在使用前立即进行准备)覆盖 CNS 组织。在室温下在湿度室中孵育10分钟。</li>
	<li>将幻灯片浸入蒸馏水中(第 6 盘)。</li>
	<li>将滑轨置于吉尔斯血氧林(用蒸馏水稀释 1:1)的反面,放置 2 分钟(第 7 盘)。</li>
	<li>立即将所有幻灯片浸入蒸馏水中(第 8 盘)。每次用清水重复两次(菜9和10)。</li>
	<li>一次使用一张滑轨,而其他幻灯片则浸入蒸馏水中(第 10 盘) - 摇动和抹污多余的水,并使用水溶性安装介质粘贴盖滑。</li>
	<li>如果需要更仔细的检查,请使用具有 20 倍目标的光学显微镜查看幻灯片和 40x 目标。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

DRIT 是一种灵活的方法,适用于现场监测,用于检测可用于分散实验室区域的狂犬病病毒的存在。虽然可以在基于现场的设置(如卡车尾门)中进行整个测试,但由于化学、设备和供应存储问题,非常适合为 DRIT 提供专用的室内空间。此外,还必须考虑到遵守所有适用的联邦、州和地方法律以及化学品使用和处置法规。目前,美国农业部拥有15个DRIT设施,用于测试来自17个州的样品。美国农业部 WS DRIT 设施是与大学和州公共卫生实验室、大型设施内的指定房间和经过改装和改装的封闭式拖车一起建立的,可作为紧急疫情反应,其中加强狂犬病监测检测,并立即周转时间至关重要(图5)。
虽然测试已经成功地使用可变质量的脑干材料,但新的脑干组织没有组织分解是最佳的。当分解、干燥或液化发生时,样品质量会下降,测试可能会检测到更多非特异性染色,从而混淆结果。此观察值在 DFA 和 DRIT2之间相似。应尽快收集脑干/CNS,然后冷冻存储(-20°C),直到测试。
通常,大多数 USDA WS 设施在 DRIT 会话期间一次处理 12 到 24 个幻灯片,包括一个正控制和一个通过 DFA 确认的阴性控制。正负控制为每次 DRIT 运行提供参考点,以确保测试成功,并确认测试幻灯片上是否出现解释性问题。如果样本未确定具有明显的阳性或阴性结果,则将其标记为不确定,并由 DRIT 进行第二次测试。如果此样品在两次 DRIT 测试后不是明显的阳性或阴性,则将其发送到参考实验室进行 DFA 或相关测试。
与任何诊断测试一样,"故障排除"对于意外的发现非常有用。例如,如果 DRIT 运行不成功(即阳性控制不显示 +3 或 +4 染色强度和抗原分布),请确保所有化学品和试剂均未过期。我们发现,每周至少使用一瓶新打开的过氧化氢有助于防止脑组织氧化的非特异性染色。此外,我们建议每年至少更换一次醋酸缓冲液,无论标记为到期日期如何。
与DFA一起,DRIT具有许多优点,包括成本更低、能够在集中实验室外进行测试、只需要光学显微镜而不是荧光显微镜,以及相对简单的训练过程。管理和阅读测试2、3、4 的人。这些优势,加上DRIT的灵敏度和特异性,可与DFA2、7、8、9相媲美,已经证明该测试在广泛尺度上是一种重要的工具。加强狂犬病监测计划8,10在北美。此外,DRIT有潜力在发展中国家或资源有限的其他地区加强监测和更迅速的检测,特别是在国际动物卫生组织/世卫组织最近作为建议测试提供指导之后。

虽然DFA是常规狂犬病诊断1最广泛使用的检测,但购买和维护荧光显微镜的成本可以限于发展中国家2、3、4和广义的,大规模加强狂犬病监测计划3、4。此外,DFA 要求在固定期间冷藏样品,并在抗体-抗原反应期间孵育高于环境温度的样品,这在没有适当基础设施的国家中可能是一个重大障碍。部分由于与现代DFA检测相关的局限性,狂犬病的全球影响长期被低估。
在这方面,需要验证更多的诊断技术,以改进全球狂犬病监测,特别是在发展中国家。此处介绍的DRIT协议提供了一个实验室或基于现场的测试替代DFA,使用光显微镜,不需要冷藏或实验室孵育在测试6。DRIT 和 DFA 相似,因为这两种技术都使用从潜在疯动物身上采集的大脑样本的触摸印象。然而,DRIT的第一步使用形式化作为样本的历史固定剂,它使狂犬病病毒失去活性。与用于修复DFA协议3中的样品的丙酮相比,这提供了实质性的生物安全改进,这不仅在实验室中很重要,在基于现场或分散的实验室环境中可能更为重要。迄今为止,DRIT 显示的灵敏度和特异性等于 DFA2、7、8、9 。
自2005年以来,美国农业部WS项目在北美开展了大规模的增强狂犬病监测工作,利用DRIT作为野生动物狂犬病综合管理计划的一部分。加强狂犬病监测是作为补充暴露的公共卫生监测和测试主要是野生动物中生动物物种,包括熊(Procyon Lotor),条纹臭气(甲发炎),灰狐狸(乌罗西翁·西罗阿根特斯,红狐狸(秃鹰)和土狼(Canislatrans),它们没有参与人类或家畜的暴露。测试中使用的动物尸体通过加强狂犬病监测工作提交给美国农业部WS,包括狂犬病病媒物种:生病或奇怪的行为;被发现死亡,道路死亡,或滋扰;与人类或家畜接触无关。DRIT提供狂犬病诊断测试,可由受过训练的实地生物学家使用,他们很少或根本没有实验室经验,以改善狂犬病监测,减轻公共卫生诊断实验室10的财务负担和工作量。为 USDA WS 现场员工提供的基本 DRIT 培训通常需要 1.5 到 2 天,其中包括大约 4 小时的课堂教学,包括生物安全的基本原则、样品收集方法和 DRIT 流程以及 >8 h实验室时间进行测试。通过美国疾病控制和预防中心(CDC)、LYSSA LLC和威斯塔研究所,美国农业部和项目合作者提供了培训机会。
在战略管理领域,美国农业部WS使用DRIT测试了超过94,000个野生动物样本,并检测了超过1,850个野生样本,这些样本可能仅仅依靠对可疑动物的基于暴露的公共卫生检测而无法被发现。DRIT结果提供的增强狂犬病监测数据对于在景观上提供更完整的狂犬病时空表现,以支持全美野生动物的口服狂犬病疫苗接种计划至关重要。 11.同样,加拿大省级野生动物机构也把DRIT纳入其公共卫生计划的同时,也纳入了大规模的野生动物狂犬病监测工作,并取得了成功。美国农业部和加拿大的DRIT监测项目都利用国家参考实验室通过DFA确认狂犬病,并酌情进行病毒变异类型化。此外,美国农业部WS现场生物学家将10%的阴性标本送往DFA鉴定参考实验室,自2008年以来,作为标准标准的一部分,他们参加了威斯康星州卫生实验室提供的半年一次的DRIT熟练程度测试质量保证措施。
该方法的目的是为狂犬病诊断测试提供另一种方法,这种检测可以在分散的实验室、现场或没有常规电子显微镜的区域进行。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

基于实验室的监测是狂犬病预防、控制和管理工作的组成部分。虽然DFA是狂犬病诊断的黄金标准,但需要验证其他诊断技术,以改善狂犬病监测,特别是在发展中国家。在这里,我们为DRIT提供一个标准协议,作为替代的实验室或基于现场的测试选项,与DFA相比,使用光显微镜。从可疑动物身上收集的脑组织的触摸印象固定在10%缓冲形式中。DRIT使用狂犬病病毒特异性的单克隆或多克隆抗体(与生物素结合)、链球菌素-过氧化物酶和色原报告器(如乙酰3-氨基-9-乙酰卡巴佐尔)检测受感染组织内的病毒内含物。在大约 1 小时内,DRIT 可以测试和解释脑组织样本。对北美、亚洲、非洲和欧洲各种物种的可疑动物大脑的评估表明,与DFA相比,DRIT的灵敏度和特异性接近100%。自 2005 年以来,美国农业部野生动物服务局 (USDA WS) 计划利用 DRIT 开展了大规模强化狂犬病监测工作,以检测从战略狂犬病管理区域收集的野生动物样本的 34,000 个样本.DRIT为狂犬病诊断提供了一个强大、经济的工具,可供人工和现场生物学家使用,以改进全球当前的狂犬病监测、预防和控制计划。

DRIT的阳性结果显示,在蓝色细胞体细胞质中,细胞内病毒内含物的形状和大小可能发生变化(图3)。内含物看起来光滑,边缘非常明亮,中央区域污染程度较低。当检测到内含物时,将记录强度和抗原分布。强度从 +4 到 +1 进行分级。正控制滑动应具有强烈、明显的洋红色亮度,称为 +4 强度。颜色轻微流失可能发生,尤其是在样品处理未达到最佳时(即样本组织略有分解),应分级为 +3。明显沉闷的污渍被评定为+2至+1,不被视为狂犬病病毒感染的诊断,并标记为不确定。
此外,抗原分布从+4到+1分级,+4代表抗原分布,由大量大小和形状不同的大和小内含物组成,并存在于CNS组织内每个领域(或几乎每个领域)触摸印象。阳性对照通常具有+4抗原分布。当大多数(但不是所有视场)中各种尺寸的内含物存在内含物时,将分配 ±3 的抗原分布。如果在 10%-50% 的显微镜场中找到内含物,则分配 +2 抗原分布。当在 <10% 的显微镜场中找到内含物时,将分配 +1 抗原分布。
大多数带有狂犬病病毒的CNS组织表现出典型的病毒内含物,分级为+3或+4强度和抗原分布。如果结果显示±2或+1强度或+2或+1抗原分布,则样品被宣布为"不确定",并保证重复测试。如果同一样品有重复的不确定测试结果,则应将样品送往参考实验室进行DFA或相关的确认测试。
使用DRIT的检测样本在以200倍或更大的倍率扫描含有CNS组织的幻灯片后,被视为狂犬病病毒抗原阴性(图4)。阴性样本表现出蓝色细胞体,很少或没有非特异性染色。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> 图1:设置10个带试剂的滑动染色盘进行检测。按照遵循协议所需的顺序,将餐具标上试剂名称。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> 图2:用湿纸巾和细胞培养板创建的简单湿度室。 使用湿纸巾和细胞培养板的简单湿度室允许基于现场的应用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> 图3:狂犬病阳性病毒内含物的代表性幻灯片,强度为+4,抗原分布为+4。(A和B) 以 200 倍放大倍率显示阳性狂犬病病毒内含物。(C和D) 以 400 倍放大倍率显示阳性狂犬病病毒内含物。比例尺 = 5 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> 图4:无狂犬病病毒内含物阴性样本的代表性幻灯片。(A和B) 以 200 倍放大倍数显示狂犬病病毒内含物的样本阴性。(C和D) 以 400 倍放大倍率显示狂犬病病毒内含物的阴性样本。比例尺 = 5 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> 图5:美国农业部WS使用的DRIT测试设施的代表性照片。(A) 在封闭的拖车内提供流动测试设施,供运输。(B) 改装用于DRIT测试的休闲车辆。(C) 与大学实验室联合的 DRIT 测试设施。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

使用直接快速免疫性化学测试增强狂犬病监测

直接快速免疫组织化学测试 (DRIT) 提供了世界动物卫生组织和世界卫生组织 (OIE/WHO) 认可的狂犬病诊断直接荧光抗体 (DFA) 测试的替代方案。此测试允许基于现场的应用,可以使用光显微镜在大约 1 小时的大脑印象中执行。

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT 之所以重要，因为它提供狂犬病诊断测试，可在现场分散的实验室或没有常规电子显微镜访问的区域进行。DRIT 的主要优点是它只使用简单的光显微镜，结果可以在大约一小时内获得。DRIT 为狂犬病诊断提供了强大的经济工具，供劳工和现场生物学家使用，以改善全球狂犬病监测、预防和控制计划。对于刚采集或已解冻至环境温度的动物，将动物的子宫对平放，颈椎稍微旋转朝向检查员。在颈椎的横向上识别亚特兰托-腹关节。使用手术刀刀片，在腹科的阿特兰托-腹关节水平上切开一个切口，切开所有肌肉和软组织层，包括气管和食道。继续，直到接近颈椎椎骨的前部。然后将动物的头部移动到最终范围延伸，直到脑干可见。使用手术刀刀片去除所有可见的脑干和中枢神经系统组织作为样品。将脑干样本放入牢不可破的容器中，并相应地贴上标签。首先，设置足够深的染色盘，以便完全浸入样品幻灯片。用10%磷酸盐缓冲的甲醛填充一盘。用 TPBS 填充二、四和五盘。用3%过氧化氢填充菜三。然后用蒸馏水或去水填充6、8、9和10个盘子。用吉尔的赤氧树脂制剂二号用蒸馏水以1：1的比例稀释。为了准备氨基乙基-卡巴佐尔库存溶液，使用玻璃移液器，将五毫升的N、N-二甲基甲酰胺放在一个玻璃容器中。将120毫克的3-氨基-9-乙基卡巴佐尔添加到玻璃容器中，摇动直到完全溶解。要准备 AEC 工作稀释，在 15 毫升离心管中加入 7 毫升醋酸盐缓冲液。使用玻璃移液器向离心管添加 0.5 毫升 AEC 库存溶液。加入0.75毫升的3%过氧化氢溶液。使用 10 毫升注射器与 0.45 微米注射器过滤器过滤溶液。首先，使用防污防水永久墨水标记标记玻璃显微镜幻灯片，每个样品都有一个唯一的编号。使用手术刀刀片从容器中去除脑干，并将其放在纸巾上。使用第二条纸巾轻轻擦去多余的液体、血液或毛皮，只露出脑干组织。如果需要，切段脑干组织以露出横截面。非常轻轻地触摸显微镜幻灯片到脑干的几个点，无需横向运动，以允许脑干多个区域转移到幻灯片，以确保只有一两层细胞从脑组织转移到幻灯片。让滑梯在室温下风干约五分钟。然后将幻灯片浸入 10% 缓冲的甲醛中，放在菜中 10 分钟。从甲醛上取下幻灯片，并在菜二中的 TPBS 溶液中浸水冲洗。将冲洗过氧化氢溶液浸入盘三中，浸泡10分钟。在此之后，从过氧化氢中取下幻灯片，将其浸入菜四中包含的新鲜 TPBS 中。去除任何多余的过氧化氢后，将幻灯片放在菜五中包含的新鲜TPBPS中。从菜五一次拿一个幻灯片，甩掉并涂抹多余的缓冲液，将幻灯片放在实验室长椅上的湿纸巾上。当所有幻灯片都已转移时，使用滴管或移液器将足够的原发性抗狂犬病病毒抗体滴到每张幻灯片上，以覆盖 CNS 组织。用井板或其他简单盖盖住幻灯片，以创建湿度室，并在室室中将幻灯片在室温下孵育 10 分钟。在此之后，从湿度室中取下幻灯片，摇动并抹掉任何多余的结合，并在盘五中的 TPBS 中浸入 TPBS 中的幻灯片。一次使用一张幻灯片，从 TPBS 上取下一张幻灯片，并使用滴管或移液器放置足够的 Streptavidin 过氧化物酶复合物来覆盖 CNS 组织。覆盖所有幻灯片后，在室温下在湿度室中孵育 10 分钟。然后从湿度室中取下幻灯片，摇动并抹掉任何多余的复合物，并在菜五中包含的 TPBS 中浸入湿滑盘。一次使用一张幻灯片，从 TPBS 上卸下一张幻灯片，并使用移液器滴下足够的 AEC 工作溶液以覆盖 CNS 组织。在室温下在湿度室中孵育滑梯10分钟。在此之后，将幻灯片浸入菜6中含的蒸馏水中，并把它们放在7号菜中吉尔的赤氧林的柜台上两分钟。立即将所有幻灯片浸入第八盘中的蒸馏水中。每次洗涤时，使用9和10个盘子中的淡水重复两次。一次工作一张幻灯片，从水中取下一张幻灯片，然后摇动并污迹掉掉任何多余的水。使用水溶性安装介质将盖玻片贴在幻灯片上。然后使用具有 20 倍目标的光学显微镜查看幻灯片。DRIT 的阳性结果显示，蓝色细胞体细胞质中的形状和大小可能变化的红色细胞内细胞内病毒内含物。内含物看起来光滑，边缘非常明亮，中心区域污染较少。抗原分布等级为加四至加一，加四表示抗原分布，由大小和形状各异的大量大小和小型内含物组成，并存在于 CNS 组织接触印象的每个视野中。当大多数（但不是所有视图字段）中具有各种大小的包含时，将分配加三的分布。如果在 10 到 50% 的显微镜字段中找到内含物，则在低于 10% 的杂物中发现内含物时，将分配加两个抗原分布，而加一个则分配。大多数患有狂犬病病毒的 CNS 组织都表现出典型的病毒内含物，其等级为加三或加四强度和抗原分布。如果结果显示强度或抗原分布中加号一或加二，则样品被宣布为不确定，并保证重复测试。使用 DRIT 的测试样本在含有 CNS 组织的幻灯片以 200 倍或更大的放大倍率扫描后，被视为狂犬病病毒抗原呈阴性，并且未检测到典型的病毒内含物。负样本显示蓝色细胞体，很少或没有已知的特定染色。进行狂犬病诊断检测的每个人应接受标准的暴露前狂犬病疫苗接种，并定期进行血清学抗体评估。未接种疫苗的个人不应进入进行此类工作的地区。除了使用活狂犬病病毒时采取的预防措施外，测试中使用的几种试剂也是危险的。请参阅每种试剂的安全数据表。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

胶粘剂基于磁带的采样和荧光组合原位杂交快速检测沙门氏菌新鲜农产品

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

科研

免疫与感染

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

禽流感监测与FTA卡：实地方法，生物安全，和运输问题解决了

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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肠道细菌侵入肠上皮细胞<em&gt;体外</em&gt;使用垂直扩散室模型，显着增强

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

革兰从血培养液使用MALDI-TOF质谱阴性细菌快速鉴定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

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一种快速战略新Faustoviruses从环境样品使用隔离<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

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增强型绿色荧光蛋白表达大肠杆菌评价小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞增多

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

体外ELISA测试评估狂犬病疫苗效力

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

用于狂犬病诊断的泛源病毒实时RT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

现场验尸狂犬病快速免疫性诊断测试资源有限设置与进一步分子应用

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

从正式固定组织检测利沙病毒抗原的免疫化学测试

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...