Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Vi anerkender alle USDA Wildlife Services personale, der i øjeblikket eller har tidligere indsamlet øget rabies overvågning prøver og har gennemført DRIT for rabies diagnose. På samme måde anerkender vi de mange medarrangører, der hjælper os med forbedret indsamling af rabies overvågning. Vi takker også centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og Wistar Institute for adgang til kritiske reagenser, der kræves for at gennemføre DRIT og for at give uddannelsesmuligheder. Derudover sætter vi pris på den bekræftende diagnose og teknisk assistance fra centrene for sygdomskontrol og forebyggelse og af Wadsworth Center med New Yorks sundhedsministerium. Brug af kommercielle produkter er kun til sammenligningsformål og udgør ikke en påtegning.

Hver person, der udfører rabies diagnostisk testning bør modtage en standard præ-eksponering rabiesvaccination serie og gennemgå regelmæssig serologisk antistof vurdering, med booster immuniseringer efter behov. Ikke-immuniserede personer bør ikke komme ind i laboratorier eller områder, hvor arbejdet udføres. Al manipulation af væv og slides bør udføres for ikke at aerosolize væsker eller producere luftbårne partikler. Røghætter er ikke påkrævet, men når det er muligt, kan de give ekstra beskyttelse mod lugte, ektoparasitter og knoglefragmenter. Der skal til enhver tid bæres et minimum af personlige værnemidler, herunder handsker og øjenværn, under prøveopsamling og-testning.
1. brainstorm kollektion
<ol><li>Indsamle hjerne prøver enten umiddelbart efter indsamling af slagtekroppe eller sikre, at slagtekroppene anbringes i frysere til opbevaring indtil senere prøvning. Hvis dyrekroppe fryses, tø ved omgivelsestemperatur før brainstorming-samlingen for at lette indsamlingen. Under visse omstændigheder indsamles prøver direkte fra et frossen dyr.</li>
	<li>
For dyr, der er frisk indsamlet eller er blevet optøet til omgivende temperatur, placere dyret liggende på en flad overflade med den cervikale rygsøjlen let drejes mod eksaminatoren. Palpate at identificere den atlanto-occipital fælles på det laterale aspekt af den cervikale rygsøjlen.
	<ol>
<li>For slagtekroppe, der stadig er helt frosne, Anbring dyrehår som beskrevet ovenfor, hvis det er praktisk. Brug Save, knive, knogle sakse eller lignende udstyr til helt at adskille hovedet fra kroppen. Bemærk: Alt udstyr, der anvendes, som ikke er engangsbrug, skal rengøres grundigt mellem prøverne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved hjælp af en skalpel klinge, lave et snit på niveau med atlanto-occipital leddet på ventrale aspekt, skære gennem alle lag af muskler og blødt væv, herunder luftrør og esophagus. Fortsæt indtil tilnærmevis forreste aspekt af halshvirvelsøjlen ryghvirvler. For frosset væv, bruge en skalpel klinge til at fjerne eventuelle resterende lag af muskler og blødt væv til at udsætte foramen magnum.</li>
	<li>Flyt dyrets overhoved til forlængelse af området, indtil hjernestammen er synlig. Brug en skalpel klinge til at fjerne alt synligt Brain EM/centralnervesystemet (CNS)-væv til prøvetagning. For en frossen prøve skal du bruge en skalpel klinge til at fjerne så meget af det frosne hjernestammen/CNS-væv som muligt fra indersiden af kraniet.</li>
	<li>Hjerne prøverne placeres i en ubrydelig beholder (dvs. metal salve tin, Cryo-hætteglas osv.) og mærket i overensstemmelse hermed.</li>
	<li>Sørg for, at hjerne prøverne testes umiddelbart efter indsamlingen via DRIT-testen, nedkølet (4 °C) i op til 24 timer før testning eller frosset (-20 °C) indtil prøvningstidspunktet, hvis testen vil finde sted mere end 24 timer efterprøve udtagning.</li>
</ol>2. fremstilling af materialer til DRIT
<ol><li>
Opsætning af 10 glide pletter (figur 1) Bemærk: Farvning retter er dybe nok til at give mulighed for fuldstændig nedsænkning af dias (diameter 96 mm, højde 72 mm, dybde 42 mm, volumen 250 mL). 6<ol>
<li>Fyld skålen 1 med 10% fosfat Buffered formalin. Udskift formalin efter 2 testkørsler eller ugentligt.</li>
		<li>Fyld fade 2, 4 og 5 med fosfatbuffer saltvand med 1% Tween-80 (TPBS). Udskift med friske TPBS før hver test.</li>
		<li>Fyld skålen 3 med 3% hydrogenperoxid. Udskift hydrogenperoxid før hver test.</li>
		<li>Fyld fade 6, 8, 9 og 10 med destilleret eller deioniseret vand. Udskift vand før hver test.</li>
		<li>Fyld skålen 7 med Gills hematoxylinlegemer formulering #2 fortyndet i et 1:1-forhold i destilleret vand6. Udskift hematoxylinlegemer efter 2 testkørsler eller ugentligt. Bemærk: Ifølge den oprindelige DRIT protokol udviklet af CDC12, en 1:2 forholdet mellem gæller hematoxylinlegemer til vand kan anvendes, hvis kontra farvning er for mørkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fremstilling af amino-ethylcarbazol (AEC) stamopløsning
	<ol>
<li>Ved hjælp af en glas pipette placeres 5 mL N, N-dimethylformamid i en glasbeholder.</li>
		<li>Tilsæt 1 20 mg tablet 3-amino-9-ethylcarbazole og ryste indtil helt opløst. Mærk krukken med "AEC Stock" og den dato, hvor bestanden blev lavet. Bemærk: AEC-stamopløsningen kan opbevares under køling (4 °C) og anvendes i 1-2 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargøring af AEC-arbejds fortynding
	<ol>
<li>Der tilsættes 7 mL acetatbuffer til et 15 mL centrifugeglas.</li>
		<li>Med en glas pipette tilsættes 0,5 mL af AEC-stamopløsningen til centrifugeglasset.</li>
		<li>Tilsæt 0,075 mL 3% hydrogenperoxid til røret.</li>
		<li>Opløsningen filtreres med en 10 mL sprøjte ved hjælp af et 0,45 μm sprøjte filter. Bemærk: AEC-arbejds fortyndingen skal laves lige før hver DRIT-test, da den kun er stabil i 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. direkte hurtig immun Histokemisk test
<ol><li>
Mærk glas mikroskop slides med et unikt nummer for hver prøve ved hjælp af en smear-Proof, vandtæt, permanent blæk markør.
	<ol>
<li>Brug et skalpel blad til at fjerne hjernestammen fra beholderen og placere den på papirhåndklæde. Forsigtigt fjerne ethvert overskud af væske, blod eller pels med en anden papir håndklæde til at afsløre bare hjernestammen13. Hvis det er nødvendigt, sektion hjernestammen til at afsløre et tværsnit.</li>
		<li>Meget forsigtigt røre mikroskop slide til tværsnit af hjernestammen væv. Tryk på diaset til hjernestammen på flere punkter uden lateral bevægelse for at tillade, at flere områder af hjernestammen overføres til slide13. Sørg for, at kun 1 eller 2 lag af celler overføres fra hjernevæv til diaset med en blid berøring. Ingen monterings middel er nødvendig for at anbringe hjernestammen på diasene. Medtag både en positiv og negativ kontrol i hver DRIT-kørsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lad gliderne lufttørre i ca. 5 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Nedsænk lysbillederne i 10% Buffered formalin i 10 minutter (skål 1).</li>
	<li>Fjern slidene fra formalin og dip-skyl i en opløsning af TPBS (skål 2).</li>
	<li>Nedsænk gliderne i 3% hydrogenperoxid i 10 min (skål 3).</li>
	<li>Fjern slides fra hydrogenperoxid og dip-skyl i frisk TPBS (fad 4). Efter fjernelse overskydende hydrogenperoxid, placere slides i frisk TPBS (skål 5) og arbejde med en slide ad gangen, mens de andre slides ophold nedsænket i TPBS.</li>
	<li>Tag slides fra TPBS (fad 5) en ad gangen, ryste og blot overskydende buffer, og Placer på en fugtet papir håndklæde på Lab bænk, som grundlag for en ' fugtighedskammer '. Ved hjælp af en pipette, drop nok primære anti-rabiesvirus antistof på hver slide til at dække CNS væv. Der inkubates i 10 min i fugtigheds kammeret (dvs. dækker slides med brønd plader eller andet simpelt dæksel, mens de lægger på det fugtet papirhåndklæde) ved stuetemperatur (figur 2).</li>
	<li>Fjern slidene fra fugtigheds kammeret, ryst og Afskær overskydende konjugat, og skyl gliderne i TPBS (genbrug de samme TPBS i fad 5).</li>
	<li>Arbejde med et dias ad gangen, mens andre forbliver fordybet i TPBS-brug en pipette til at droppe nok streptavidin-peroxidase kompleks til at dække CNS-vævet. Inkuber i fugtigheds kammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjern diasene fra fugtigheds kammeret, ryst og Afskær overskydende kompleks, og dip-skyl diasene i TPBS (skål 5).</li>
	<li>Arbejde med et dias ad gangen, ryste og blot overskydende buffer, mens andre forbliver nedsænket i TPBS-brug en pipette til at droppe nok AEC (forberedelse er forklaret ovenfor og bør ske umiddelbart før brug) til at dække CNS væv. Inkuber i fugtigheds kammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>DIP-skyl gliderne i destilleret vand (fad 6).</li>
	<li>Placer gliderne i modplet af gæller Hematoxylin (fortyndet 1:1 med destilleret vand) i 2 min (skål 7).</li>
	<li>DIP-skyl straks alle slides i destilleret vand (fad 8). Gentag to gange med frisk vand hver gang (fade 9 og 10).</li>
	<li>Arbejde med et dias ad gangen, mens andre forbliver nedsænket i destilleret vand (fad 10) — ryst og aflad overskydende vand og brug et vandopløseligt monterings medium til at anbringe en dækseddel.</li>
	<li>Brug en lys mikroskop med en 20x mål at se slides og en 40x mål, hvis tættere inspektion er nødvendig.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

DRIT er en fleksibel metode, der er velegnet til felt baseret overvågning til påvisning af tilstedeværelsen af rabiesvirus, som kan anvendes i decentraliserede laboratorieområder. Selv om det er muligt at gennemføre hele testen i en felt-baseret indstilling som på bagklap af en lastbil, er det ideelt at have en lille, indendørs rum dedikeret til DRIT på grund af kemiske, udstyr og forsyning opbevaring spørgsmål. Desuden skal overholdelse af alle gældende føderale, statslige og lokale love, og regler for kemisk brug og bortskaffelse overvejes. I øjeblikket, USDA WS har 15 DRIT faciliteter til at teste prøver fra 17 stater. USDA WS DRIT-faciliteterne er etableret i samarbejde med universitets-og stats folkesundheds laboratorier, i udpegede lokaler inden for større faciliteter og i lukkede påhængskøretøjer, der er blevet eftermonteret og ombygget til at fungere som mobile prøvnings enheder i tilfælde af et akut udbrud svar, hvor øget rabies overvågning test med øjeblikkelig behandlingstid er kritisk (figur 5).
Mens testen har været vellykket ved hjælp af hjernestammen materiale af varierende kvalitet, frisk hjernestammen væv uden vævs nedbrydning er optimal. Da nedbrydning, udtørring eller likvefaktion forekommer, mindskes prøve kvaliteten, og testen kan detektere mere uspecifik farvning, som kan forvirre resultaterne. Denne observation er den samme mellem DFA og DRIT2. Hjernestammen/CNS skal indsamles så hurtigt som muligt og derefter opbevares frosset (-20 °C) indtil testning.
Typisk, de fleste USDA WS faciliteter proces fra 12 til 24 slides på én gang i løbet af en DRIT session, herunder en positiv kontrol og en negativ kontrol, der er blevet bekræftet via DFA. Positive og negative kontroller udgør et referencepunkt for hver enkelt DRIT kørsel for at sikre, at testen blev gennemført, og for at bekræfte, om der opstår fortolkningsspørgsmål på prøve diasene. Hvis en prøve ikke er bestemt til at have et klart positivt eller negativt udfald, mærkes den som en ubestemt og afprøvet anden gang af DRIT. Hvis denne prøve ikke er en klar positiv eller negativ efter to DRIT-tests, sendes den til et referencelaboratorium for DFA eller relateret testning.
Som med enhver diagnostisk test, ' Trouble Shooting ' er nyttigt med uventede resultater. For eksempel, hvis en DRIT kørsel mislykkes (dvs. den positive kontrol ikke udviser + 3 eller + 4 farvning intensitet og antigen fordeling), sikre alle kemikalier og reagenser er ikke udløbet. Vi har fundet ved hjælp af en nyåbnet flaske hydrogenperoxid på mindst én gang om ugen er nyttigt at hjælpe med at forhindre ikke-specifik farvning gennem oxidation af hjernevæv. Derudover anbefaler vi udskiftning af acetatbuffer mindst én gang om året som minimum, uanset den mærkede udløbsdato.
Der er en række fordele ved DRIT over DFA, herunder lavere omkostninger, evne til at udføre testen uden for et centraliseret laboratorium, behov for kun lys mikroskopi i stedet for et fluorescerende mikroskop, og den relativt ligetil træning proces for mennesker, som administrerer og læser testen2,3,4. Disse fordele, kombineret med følsomhed og specificitet af drit, der er sammenlignelige med DFA2,7,8,9 har allerede bevist, at testen fungerer som et vigtigt redskab i bred skala forbedrede rabies overvågningsprogrammer8,10 i Nordamerika. Derudover har DRIT potentiale til at give mulighed for øget overvågning og mere hurtig testning i udviklingslande eller andre områder med begrænsede ressourcer, især efter den seneste OIE/WHO-vejledning som en anbefalet test.

Mens DFA er den mest udbredte test for rutinemæssig rabies diagnose1, kan omkostningerne ved at købe og vedligeholde et fluorescerende mikroskop begrænse til udviklingslande2,3,4 og for brede, storstilet forbedrede rabies overvågningsprogrammer3,4. Desuden kræver DFA evnen til at køle prøver under fiksering og til at inkubere prøver over omgivende temperatur under antistof-antigen-reaktionerne, hvilket kan være en betydelig forhindring i lande uden passende infrastruktur. På grund af de begrænsninger, der er forbundet med moderne DFA-testning, har den globale virkning af rabies længe været undervurderet5.
I denne forbindelse er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker for at forbedre overvågningen af rabies globalt, især i udviklingslandene. Den DRIT-protokol, der præsenteres her, tilbyder et laboratorium eller felt baseret test alternativ til DFA, der bruger let mikroskopi og ikke kræver køling eller laboratorie inkubation under testen6. Den DRIT og DFA er ens i, at begge teknikker bruger touch indtryk af hjerne prøver indsamlet fra potentielt rabiat dyr. Men det første trin i DRIT bruger formalin som en historisk fixativ for prøver, som inaktiverer rabiesvirus. Dette giver en betydelig forbedring af biosikkerheden i forhold til acetone anvendes til at fastsætte prøver i DFA protokol3, hvilket er vigtigt ikke kun i laboratoriet, men måske endnu mere i marken-baserede eller decentrale Lab miljøer. Til dato, den drit viser følsomhed og specificitet svarende til DFA2,7,8,9.
Siden 2005, USDA WS programmet har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats i Nordamerika ved hjælp af DRIT som en del af en omfattende Wildlife rabies Management program10. Øget rabies overvågning anvendes som et supplement til eksponeringsbaseret folkesundhedsmæssig overvågning og tester primært vildtlevende Meso-kødædende arter, herunder vaskebjørne (Procyon lotor), stribede skunks (mephitis mephitis), grå ræve ( Urocyon cinereoargenteus), røde ræve (Vulpes vulpes), og Coyoter (Canis latrans), der ikke har været involveret i en menneskelig eller indenlandsk dyrs eksponering. Dyrekroppe, der anvendes til testning, blev indsendt til USDA WS gennem øget rabies overvågningsindsats og bestod af rabies vektorarter, der er: syg eller mærkelig skuespil; fundet død, vej-dræbt, eller en plage; og ikke er forbundet med en eksponering af mennesker eller dyr i hjemmet. Den DRIT giver en rabies diagnostisk test, der kan være ansat af uddannede felt biologer med ringe eller ingen laboratorie erfaring til at forbedre rabies overvågning og reducere den finansielle byrde og arbejdsbyrden for den offentlige sundhed diagnostiske laboratorier10. Den grundlæggende DRIT-træning for USDA WS-medarbejdere tager typisk 1,5 til 2 dage, hvilket omfatter ca. 4 timer i klasseundervisning, der dækker grundlæggende principper for biosikkerhed, metoder til indsamling af prøver og DRIT-processerne samt > 8 timer laboratorie tiden, hvor testen udføres. Uddannelsesmuligheder har været til rådighed for USDA WS og program samarbejdsvillige gennem centre for Disease Control og forebyggelse (CDC), Lyssa LLC, og Wistar Institute.
Inden for strategiske Management områder, har USDA WS testet over 94.000 Wildlife prøver ved hjælp af DRIT og har opdaget mere end 1.850 rabiat prøver, der ville have sandsynligvis gået uopdaget afhængige kun ved eksponering baseret folkesundheden test af mistænkte dyr. Forbedrede rabies overvågningsdata leveret af DRIT resultater er afgørende for at give en mere komplet tidsmæssig og rumlig repræsentation af rabies på landskabet til støtte for oral rabiesvaccination programmer for dyreliv i hele USA10, 11. Tilsvarende, provins Wildlife agenturer i Canada har indarbejdet DRIT i stor skala dyreliv rabies overvågning indsats i tandem med deres offentlige sundhed programmer med succes8. Både USDA WS og Canadian DRIT overvågningsprogrammer har brugt nationale referencelaboratorier til at bekræfte rabies ved DFA og til at udføre viral variant indtastning som relevant8. Desuden, USDA WS biologer sende 10% af negative eksemplarer til DFA bekræftelse til referencelaboratorier og siden 2008, har deltaget i halvårlige DRIT præstationstest leveret af Wisconsin State Laboratory hygiejne, som en del af standard kvalitetssikringsforanstaltninger.
Målet med denne metode er at tilbyde en alternativ tilgang til rabies diagnostisk testning, der kan gøres i decentrale laboratorier, i marken, eller i områder uden rutinemæssig adgang til elektronmikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

Laboratoriebaseret overvågning er en integrerende del af forebyggelsen, kontrollen og ledelsen af rabies. Mens DFA er den gyldne standard for rabies diagnose, er der behov for at validere yderligere diagnostiske teknikker til at forbedre rabies overvågning, især i udviklingslandene. Her præsenterer vi en standardprotokol for DRIT som en alternativ, laboratorium eller felt-baseret test option, der bruger lys mikroskopi i forhold til DFA. Touch indtryk af hjernevæv indsamlet fra mistænkte dyr er fastsat i 10% Buffered formalin. Den DRIT bruger rabiesvirus-specifikke monoklonale eller polyklonale antistoffer (konjugeret til biotin), en streptavidin-peroxidase enzym, og en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) til at detektere virale indeslutninger i inficerede væv. I ca. 1 time kan en hjerne vævsprøve testes og fortolkes af DRIT. Evaluering af mistænkte dyr hjerner testet fra en række forskellige arter i Nordamerika, Asien, Afrika, og Europa har illustreret høj følsomhed og specificitet af DRIT nærmer 100% med resultater i forhold til DFA. Siden 2005, de Forenede Staters Department of Agriculture Wildlife Services (USDA WS) program har gennemført storstilet øget rabies overvågning indsats ved hjælp af DRIT at teste > 94000 prøver indsamlet fra dyreliv i strategiske rabies Management områder . Den DRIT giver en kraftfuld, økonomisk værktøj til rabies diagnose, der kan bruges af laboratorierne og felt biologer til at forbedre nuværende rabies overvågning, forebyggelse og kontrolprogrammer globalt.

Positive resultater fra drit viser røde ICSI virale indeslutninger, der kan variere i form og størrelse (figur 3) inden for cytoplasmaet af blålig celle legemer. Inklusionerne vises glatte med meget lyse margener og et mindre intensivt farvet centralt område. Intensitet og antigen fordeling registreres, når indeslutninger detekteres. Intensiteten er gradueret fra + 4 til + 1. Den positive kontrol slide skal have en intens, iøjnefaldende magenta glans, som omtales som en + 4 intensitet. En let tab af farve kan forekomme, især når prøvehåndtering ikke har været optimal (dvs., prøve vævet har nedbrydes lidt), og disse bør klassificeres som + 3. Mærkbart kedelig bejdset er klassificeret som en + 2 til + 1, er ikke betragtes som diagnostisk for rabiesvirus infektion og er mærket som ubestemt.
Desuden er antigen fordeling klassificeret fra + 4 til + 1 med + 4 repræsenterer antigen fordeling består af en overflod af store og små indeslutninger varierende i størrelse og form, og til stede i alle felter (eller næsten alle felter) af synspunkt i CNS væv Tryk på indtryk. Den positive kontrol har typisk en + 4 antigen fordeling. En antigen fordeling på + 3 ville blive tildelt, når der er indeslutninger i en række størrelser i de fleste, men ikke alle synsfelter. Hvis der findes indeslutninger i 10%-50% af mikroskop felterne, tildeles a + 2 antigen fordeling. Når indeslutninger findes i < 10% af mikroskop felterne, tildeles a + 1 antigen fordeling.
De fleste CNS-væv med rabiesvirus tilstedeværende udviser typiske virale indeslutninger klassificeret som + 3 eller + 4 intensitet og antigen fordeling. Hvis resultaterne indikerer en intensitet på + 2 eller + 1 eller a + 2 eller + 1 antigen, erklæres prøven for "ubestemt", og gentagen testning er berettiget. Hvis den samme prøve har et gentaget udefineret prøvningsresultat, skal prøven sendes til et referencelaboratorium for DFA eller relateret bekræftende prøvning.
En test prøve, der anvender DRIT, anses for at være negativ for rabiesvirus antigener, efter at det dias, der indeholder CNS-vævet, er blevet scannet med en forstørrelse på 200X eller derover, og der ikke er påvist nogen typiske virus indeslutninger (figur 4). Negative prøver udviser blålig celle legemer med ringe eller ingen uspecifik farvning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Figur 1: Opsætning af 10 slide farvning retter med reagenser til testning. Retterne er mærket med reagensnavn i den rækkefølge, der kræves for at følge protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figur 2: enkel fugtighedskammer skabt med en våd papir håndklæde og cellekultur plader.  En simpel fugtighedskammer ved hjælp af en våd papir håndklæde og cellekultur plader giver mulighed for felt-baseret applikation.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figur 3: repræsentative lysbilleder af rabies positive virale indeslutninger med + 4 intensitet og + 4 antigen distribution. (A og B) udviser positive rabies virale indeslutninger ved 200x forstørrelse. (C og D) udviser positive rabies virale indeslutninger ved 400x forstørrelse. Skala stænger = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figur 4: repræsentative dias af negative prøver uden rabies viral indeslutninger. (A og B) viser prøver negativt for rabies viral indeslutninger ved 200x forstørrelse. (C og D) viser prøver negativt for rabies viral indeslutninger ved 400x forstørrelse. Skala stænger = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figur 5: repræsentative fotografier af DRIT-prøvningsfaciliteter, der anvendes af USDA ws. A) mobilt prøvningsanlæg i en lukket påhængsvogn til transport. B) efter montering af køretøjer til drit-prøvning. C) anlæg til afprøvning af drit i forbindelse med universitetslaboratorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Øget rabies overvågning ved hjælp af en direkte, hurtig immun Histokemisk test

Den direkte hurtige immun histokemiske test (DRIT) tilbyder en verdensorganisation for dyresundhed og Verdenssundhedsorganisationen (OIE/WHO) anerkendt alternativ til den direkte fluorescerende antistof (DFA) test for rabies diagnose. Denne test giver mulighed for felt-baserede applikationer, der kan udføres i ca 1 h på hjernen indtryk ved hjælp af lys mikroskopi.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT er signifikant, fordi det giver en rabiesdiagnostisk test, der kan udføres i decentrale laboratorier i marken eller i områder uden rutinemæssig adgang til elektronmikroskopi. Den største fordel ved DRIT er, at det kun udnytter simpel lysmikroskopi, og at resultaterne kan opnås på cirka en time. DRIT er et kraftfuldt økonomisk værktøj til rabiesdiagnose, der kan bruges af laboratorielaboratorier og feltbiologer til at forbedre rabiesovervågning, forebyggelse og kontrolprogrammer globalt.For dyr, der er friskopsamlet eller er optøet til omgivelsestemperatur, placeres dyrets liggende på en flad overflade med halshvirvelsøjlen let roteret mod eksaminatoren. Palpate at identificere atlanto-occipital fælles på det laterale aspekt af halshvirvelsøjlen. Ved hjælp af en skalpel klinge, foretage et snit på niveau med atlanto-occipital fælles på ventrale aspekt skære gennem alle lag af muskler og blødt væv, herunder luftrør og spiserøret.Fortsæt indtil tilnærme den forreste aspekt af halshvirvelsøjler. Flyt derefter dyrets hoved ind i en forlængelse af endeområdet, indtil hjernestammen er synlig. Brug en skalpel klinge til at fjerne alle synlige hjernestammer og centralnervesystemet væv til prøve.Læg hjernestammeprøverne i en ubrydelig beholder, og mærk dem i overensstemmelse hermed. Først, der er fastsat farvning retter, der er dybe nok til at give mulighed for fuldstændig nedsænkning af en prøve dias. Fyld fad en med 10% fosfat buffered formalin.Fyld opvasken to, fire og fem med TPBS. Fyld fad tre med 3% hydrogenperoxid. Derefter fylde retter seks, otte, ni og 10 med destilleret eller deioniseret vand.Fyld fad syv med Gill's hæmatoxylin formulering nummer to fortyndet i en 1:1 forholdet med destilleret vand. For at forberede amino-ethyl-carbazole lager opløsning, ved hjælp af et glas pipette, placere fem milliliter N, N-dimethylformamid i en glasbeholder. Tilføj 120 milligram tablet 3-amino-9-ethylcarbazol til glasbeholderen og ryst indtil helt opløst.For at forberede AEC arbejder fortynding, tilsættes syv milliliter acetat buffer til en 15 milliliter centrifuge rør. Brug en glaspipette til at tilsætte 0,5 milliliter AEC-lageropløsning til centrifugerøret. Der tilsættes 0,75 milliliter 3 % hydrogenperoxidopløsning.Brug en 10 millilitersprøjte med et sprøjtefilter på 0,45 mikrometer til at filtrere opløsningen. Til at begynde, skal du bruge en smear-bevis vandtæt permanent blæk markør til at mærke glas mikroskop dias med et unikt nummer for hver prøve. Brug en skalpel klinge til at fjerne hjernestammen fra beholderen og læg den på en køkkenrulle.Brug en anden køkkenrulle til forsigtigt blot væk overskydende væske, blod eller pels til at afsløre bare hjernestammen væv. Hvis det er nødvendigt, afsnit hjernestammen væv til at afsløre et tværsnit. Rør mikroskopet meget forsigtigt til flere punkter i hjernestammen uden sidefine bevægelse for at tillade, at flere områder af hjernestammen overføres til diaset og sørger for, at kun et eller to lag celler overføres fra hjernevævet til diaset.Lad rutsjebanerne lufttørre i ca. fem minutter ved stuetemperatur. Derefter nedsænkes dias i 10%buffered formalin i fad en i 10 minutter. Fjern objektglassene fra formalinen, og dyp dem i TPBS-opløsningen i skål to.De skyllede objektglas nedsænkes i hydrogenperoxidopløsningen i skål tre i 10 minutter. Derefter fjernes objektglassene fra brintoverilte og dyppes skylle dem i den friske TPBS, der er indeholdt i skål fire. Efter fjernelse af overskydende brintoverilte, læg objektglassene i den friske TPBS, der er indeholdt i skål fem.Tag dias en ad gangen fra fad fem, ryste og skamplet overskydende buffer og placere dias på en fugtet køkkenrulle på laboratoriet bænken. Når alle dias er blevet overført, skal du bruge en pipetter eller pipette til at droppe nok primær anti-rabiesvirus antistof på hvert dias til at dække CNS væv. Dæk dias med godt plader eller en anden simpel dækning for at skabe en fugtighed kammer og inkubere dias ved stuetemperatur i kammeret i 10 minutter.Derefter fjernes objektglassene fra fugtighedskammeret, rystes og blotgør eventuelt overskydende konjugat, og rutsjebanerne i TPBS skylles i skål fem. Arbejde med et dias ad gangen, fjerne et dias fra TPBS og bruge en pipetter til at droppe nok Streptavidin peroxidase kompleks til at dække CNS væv. Når alle objektglassene er dækket, inkuberes de i fugtighedskammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.Fjern derefter objektglassene fra fugtighedskammeret, ryst og afslet overskydende kompleks, og dyp skyl diasene i TPBS, der er indeholdt i parabol fem. Arbejde med et dias ad gangen, fjerne et dias fra TPBS og bruge en pipette til at droppe nok AEC arbejdsløsning til at dække CNS væv. Kuber objektglassene i fugtighedskammeret i 10 minutter ved stuetemperatur.Efter dette, dyppe skylles dias i destilleret vand, der er indeholdt i fad seks og læg dem i en kontrastain af Gills hematoxylin i fad syv i to minutter. Straks dyppe skylle alle dias i destilleret vand i fad otte. Gentag dette to gange ved hjælp af ferskvand i retter ni og 10 for hver vask.Arbejde en slide ad gangen, fjerne et dias fra vandet og ryste og blot off overskydende vand. Brug et vandopløseligt monteringsmedium til at anbringe en dæksling på diaset. Brug derefter et let mikroskop med en 20X-målsætning til at se diasene.Positive resultater fra DRIT viser røde intracytoplasmic virale indeslutninger, der kan variere i form og størrelse inden for cytoplasmaet af de blålige celleorganer. Indeslutningerne fremstår glatte med meget lyse kanter og et mindre intensivt farvet centralt område. Antigenfordelingen er klassificeret fra plus fire til plus en med plus fire, der repræsenterer antigenfordelingen, og som består af en overflod af store og små indeslutninger, der varierer i størrelse og form og er til stede i alle synsfelt inden for CNS-vævstryk.Der tildeles en fordeling på plus tre, når der er medtagelser i forskellige størrelser i de fleste, men ikke alle synsfelter. Hvis der findes medtagelser i 10 til 50 % af mikroskopfelterne, tildeles der en plus to antigenfordelinger, mens der tildeles plus en, når der findes indeslutninger i mindre end 10 % af felterne. De fleste CNS væv med rabiesvirus til stede udviser typiske virale indeslutninger klassificeret som plus tre eller plus fire intensitet og antigen fordeling.Hvis resultaterne viser et plus et plus et eller plus to i enten intensitet eller antigenfordeling, erklæres prøven for ubestemt, og gentagne test er berettiget. En prøve med DRIT anses for negativ for rabiesvirusantigener, efter at diaset med CNS-vævet scannes ved en forstørrelse på 200X eller derover, og der påvises ingen typiske virusinteslutninger. Negative prøver udviser blålige cellekroppe med ringe eller ingen kendt specifik farvning.Hver person, der udfører rabiesdiagnostiske test, bør modtage standard rabiesvaccinationer før eksponering og underkastes regelmæssig serologisk antistofvurdering. Ikke-udtalte personer bør ikke komme ind på områder, hvor et sådant arbejde udføres. Ud over de forholdsregler, der træffes ved arbejdet med levende rabiesvirus, er flere af de reagenser, der anvendes i testen, farlige.Se sikkerhedsdatabladene for hvert reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriske Bakteriel invasion af tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Er dramatisk forøget hjælp af en lodret diffusionskammer Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En hurtig strategi for Isolering af nye Faustoviruses fra miljøprøver Brug<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Ved hjælp af forbedret grønne fluorescens Protein-udtryk for Escherichia Coli at vurdere musen Peritoneal makrofag fagocytose

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus realtid RT-PCR for rabies diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunohistochemistry Test for Lyssavirus Antigen Detection fra Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...