Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Wij erkennen alle USDA Wildlife diensten personeel die momenteel of hebben eerder verzameld verbeterde rabiës surveillance monsters en hebben de DRIT voor rabiës diagnose uitgevoerd. Evenzo erkennen we de vele coopera toren die ons helpen met de uitgebreide surveillance collectie van rabies. We danken ook de centra voor ziektebestrijding en preventie en het Wistar Institute voor toegang tot kritische reagentia die nodig zijn om de DRIT te voeren en om opleidingsmogelijkheden te bieden. Daarnaast waarderen we de bevestigende diagnostiek en technische bijstand van de centra voor ziektebestrijding en preventie en door het Wadsworth Center met het New Yorkse State Department of Health. Het gebruik van commerciële producten is uitsluitend voor vergelijkingsdoeleinden en vormt geen goedkeuring.

Elke persoon die de diagnostische tests van rabiës uitvoert, moet een standaard vaccinatiereeks voor rabiës met een voor blootstelling ondergaan en regelmatig een serologische evaluatie van het antilichaam krijgen, met Booster-immunisaties indien nodig. Niet-geïmmobiliseerde personen mogen geen laboratoria of gebieden betreden waar dergelijke werkzaamheden worden uitgevoerd. Alle manipulatie van weefsels en dia's moet worden uitgevoerd om geen vloeistoffen te aerosoliseren of deeltjes in de lucht te produceren. Rook afzuigkappen zijn niet nodig, maar indien haalbaar kunnen ze extra bescherming bieden tegen geuren, ectoparasieten en botfragmenten. Minimale persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen en oogbescherming, moeten tijdens het verzamelen en testen van monsters te allen tijde worden gedragen.
1. Brain stem collectie
<ol><li>Verzamelmonsters van hersenstam onmiddellijk na het verzamelen van het karkas of zorg ervoor dat karkassen in vrieskisten worden geplaatst totdat ze later worden getest. Als karkassen zijn bevroren, ontdooien bij omgevingstemperatuur voorafgaand aan de collectie van brain stem voor het gemak van de inzameling. Onder bepaalde omstandigheden worden monsters rechtstreeks van een bevroren dier verzameld.</li>
	<li>
Voor dieren die vers zijn ingezameld of zijn ontdooid tot aan de omgevingstemperatuur, plaatst u het dier op een vlakke ondergrond met de cervicale wervelkolom die lichtjes naar de examinator is gedraaid. Palpate om de atlanto-occipital joint op het laterale aspect van de cervicale wervelkolom te identificeren.
	<ol>
<li>Voor karkassen die nog volledig zijn bevroren, plaats de dieren rugligging zoals hierboven beschreven, indien praktisch. Gebruik zagen, messen, been scharen of soortgelijke apparatuur om het hoofd volledig van het lichaam te scheiden. Opmerking: Alle gebruikte apparatuur die niet eenmalig wordt gebruikt, moet grondig worden gereinigd tussen de monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een scalpel-blad om een incisie te maken op het niveau van het atlanto-occipitale gewricht op het ventrale aspect, door alle lagen van spieren en weke delen te snijden, inclusief de luchtpijp en de slokdarm. Ga door totdat het voorste aspect van de cervicale wervelkolom wordt benaderd. Voor bevroren weefsel, gebruik een scalpel Blade om alle overgebleven lagen van spier en zacht weefsel te verwijderen om de foramen magnum bloot.</li>
	<li>Beweeg de kop van het dier in de eindbereik verlenging tot de hersenstam zichtbaar is. Gebruik een scalpel Blade om alle zichtbare hersenstam/centrale zenuwstelsel (CNS) weefsel voor bemonstering te verwijderen. Voor een bevroren monster, gebruik een scalpel Blade om zoveel mogelijk van de bevroren hersenstam/CNS weefsel te verwijderen van binnen de schedel.</li>
	<li>Plaats de monsters van de hersenstam in een onbreekbaar reservoir (d.w.z. metalen zalf tin, Cryo-injectieflacon, enz.) en breng het etiket dienovereenkomstig aan.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de monsters van de hersenstam onmiddellijk na het verzamelen worden getest via de DRIT test, gekoeld (4 °C) tot 24 uur vóór het testen, of bevroren (-20 °C) tot het moment van testen, indien de test meer dan 24 uur na de monsterafname plaatsvindt.</li>
</ol>2. voorbereiding van de materialen voor DRIT
<ol><li>
10 dia-kleurings gerechten instellen (figuur 1) Opmerking: Kleurings gerechten zijn diep genoeg om een volledige onderdompeling van de glijbaan mogelijk te maken (diameter 96 mm, hoogte 72 mm, diepte 42 mm, volume 250 mL). 6<ol>
<li>Vul schotel 1 met 10% fosfaatgebufferde formalin. Vervang formaline na 2 test runs of wekelijks.</li>
		<li>Vul de gerechten 2, 4 en 5 met fosfaatgebufferde zoutoplossing met 1% Tween-80 (TPBS). Vervang met verse TPBS voor elke test.</li>
		<li>Vul schotel 3 met 3% waterstofperoxide. Vervang waterstofperoxide vóór elke test.</li>
		<li>Vul de gerechten 6, 8, 9 en 10 met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Vervang water voor elke test.</li>
		<li>Vul schotel 7 met kieuwen hematoxyline formulering #2 verdund in een 1:1 verhouding in gedistilleerd water6. Vervang hematoxyline na 2 test runs of wekelijks. Opmerking: Volgens het oorspronkelijke DRIT-protocol ontwikkeld door de CDC12, kan een 1:2-verhouding van kieuwen hematoxyline naar water worden gebruikt als tegen kleuring te donker is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van amino-ethylcarbazol (AEC) stockoplossing
	<ol>
<li>Gebruik een glazen pipet en plaats 5 mL N, N-dimethylformamide in een glazen recipiënt.</li>
		<li>Voeg 1 20 mg tablet 3-amino-9-ethylcarbazol toe en schud totdat het volledig is opgelost. Label de pot met "AEC Stock" en de datum waarop de voorraad is gemaakt. Opmerking: De AEC stockoplossing kan worden bewaard onder koeling (4 °C) en gebruikt worden voor 1-2 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de AEC-werkverdunning
	<ol>
<li>Voeg 7 mL acetaatbuffer toe aan een centrifugebuis van 15 mL.</li>
		<li>Voeg met behulp van een glazen pipet 0,5 mL van de AEC-voorraadoplossing toe aan de centrifugebuis.</li>
		<li>Voeg 0,075 mL van 3% waterstofperoxide toe aan de buis.</li>
		<li>Filter de oplossing met een injectiespuit van 10 mL met een spuit filter van 0,45 μm. Opmerking: De AEC-werkverdunning moet net voor elke DRIT test worden gemaakt, omdat deze alleen stabiel is voor 2-3 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. directe snelle immunohistochemie test
<ol><li>
Label Glass Microscoop dia's met een uniek nummer voor elk specimen met een uitstrijkje bestendige, waterbestendige, permanente inkt marker.
	<ol>
<li>Gebruik een scalpel-blad om de hersenstam uit de container te verwijderen en op een papieren handdoek te plaatsen. DEP voorzichtig overtollig vocht, bloed of bont weg met een tweede papieren handdoek om alleen het hersenstam weefsel13te onthullen. Indien nodig, sectie het hersenstam weefsel om een dwarsdoorsnede te onthullen.</li>
		<li>Raak de Microscoop-dia zeer voorzichtig aan de dwarsdoorsnede van het hersenstam weefsel. Raak de schuif aan de hersenstam op verschillende punten zonder laterale beweging, zodat meerdere delen van de hersenstam kunnen worden overgebracht naar dia13. Zorg ervoor dat slechts 1 of 2 lagen cellen van het hersenweefsel naar de glijbaan worden overgebracht met een zachte aanraking. Er is geen montage middel nodig om het hersenstam weefsel op de dia's aan te brengen. Neem zowel een positieve als een negatieve controle op in elke DRIT-run.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de lantaarnplaten ongeveer 5 minuten lucht drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Dompel de glaasjes in 10% gebufferde formaline gedurende 10 min (Dish 1).</li>
	<li>Verwijder de glaasjes van formaline en spoel in een oplossing van TPBS (gerecht 2).</li>
	<li>Dompel de dia's in 3% waterstofperoxide gedurende 10 min (Dish 3).</li>
	<li>Verwijder de glaasjes uit de waterstofperoxide en DIP-rinse in verse TPBS (gerecht 4). Na het verwijderen van overtollige waterstofperoxide, plaats de dia's in verse TPBS (schotel 5) en werk met één dia tegelijk, terwijl de andere dia's blijven ondergedompeld in TPBS.</li>
	<li>Neem de dia's van TPBS (Dish 5) een voor een, schud af en DEP overtollige buffer, en plaats op een bevochtigde papieren handdoek op Lab Bench, als basis van een ' vochtigheids kamer '. Gebruik een pipet en laat voldoende primair anti-rabiësvirus antilichaam op elke dia vallen om het CZS-weefsel te bedekken. Inbroed de glaasjes gedurende 10 minuten in de vochtigheids kamer (d.w.z. dia's met goed platen of andere eenvoudige afdekking bedekken terwijl ze op de vochtige papieren handdoek leggen) bij kamertemperatuur (Figuur 2).</li>
	<li>Verwijder de glaasjes uit de vochtigheids kamer, schud en DEP de overtollige conjugaat af en spoel de glaasjes in TPBS (hergebruik dezelfde TPBS in Dish 5).</li>
	<li>Werken met één dia tegelijk, terwijl anderen ondergedompeld blijven in TPBS — gebruik een pipet om voldoende streptavidin-peroxidase complex te laten vallen om het CZS-weefsel te bedekken. Inincuberen in de vochtigheids kamer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de glaasjes uit de vochtigheids kamer, schud en DEP het overtollige complex af en spoel de glaasjes in TPBS (schotel 5).</li>
	<li>Werken met één dia tegelijk, schud af en DEP overtollige buffer, terwijl anderen ondergedompeld blijven in TPBS-gebruik een pipet om voldoende AEC te laten vallen (voorbereiding wordt hierboven uitgelegd en moet onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik worden gedaan) om het CZS-weefsel te bedekken. Inincuberen in de vochtigheids kamer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>DIP-spoel de glaasjes in gedestilleerd water (schotel 6).</li>
	<li>Plaats de glaasjes in Contra vlekken van de kieuwen HEMA Oxylin (verdund 1:1 met gedestilleerd water) gedurende 2 minuten (gerecht 7).</li>
	<li>Onmiddellijk spoelen-spoel alle glaasjes in gedestilleerd water (schotel 8). Herhaal tweemaal met vers water elke keer (gerechten 9 en 10).</li>
	<li>Werken met één dia tegelijk, terwijl anderen ondergedompeld blijven in gedistilleerd water (schotel 10) — schud en DEP overtollig water af en gebruik een in water oplosbaar bevestigings medium om een afdekplaat aan te brengen.</li>
	<li>Gebruik een lichte Microscoop met een 20x-doelstelling om de dia's en een 40x-doelstelling te bekijken als een nadere inspectie nodig is.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De DRIT is een flexibele methode die geschikt is voor veld-based Surveillance voor het opsporen van de aanwezigheid van rabiësvirus dat kan worden gebruikt in gedecentraliseerde laboratorium gebieden. Hoewel het mogelijk is om de hele test uit te voeren in een veld-gebaseerde setting zoals op de achterklep van een truck, is het ideaal om een kleine binnenruimte te hebben die is gewijd aan DRIT vanwege chemische, apparatuur en Supply-opslagproblemen. Daarnaast moet rekening worden gehouden met de naleving van alle toepasselijke federale, staats-en lokale wetten en voorschriften voor chemisch gebruik en verwijdering. Op dit moment heeft USDA WS 15 DRIT faciliteiten om samples uit 17 Staten te testen. De USDA WS DRIT-faciliteiten worden opgericht in samenwerking met de Universiteit en de staat volksgezondheids laboratoria, in aangewezen kamers binnen grotere faciliteiten en in gesloten aanhangwagens die zijn omgebouwd en geconverteerd om als mobiele testunits te dienen in de geval van een nood uitbraak reactie waarbij verscherpte rabiës surveillance tests met onmiddellijke doorlooptijd kritisch zijn (Figuur 5).
Hoewel de test succesvol is geweest met behulp van hersenstam materiaal van variabele kwaliteit, is vers hersenstam weefsel zonder weefsel ontleding optimaal. Als ontleding, uitdroging of vloeibaarmaking optreedt, neemt de monster kwaliteit af en kan de test meer niet-specifieke vlekken detecteren die de resultaten kunnen verwarren. Deze waarneming is vergelijkbaar tussen DFA en DRIT2. Hersenstam/CNS moet zo snel mogelijk worden verzameld en vervolgens bevroren (-20 °C) worden bewaard tot het testen.
Meestal verwerken de meeste USDA WS-faciliteiten in één keer van 12 tot 24 dia's tijdens een DRIT sessie, inclusief één positieve controle en één negatieve controle die is bevestigd via DFA. Positieve en negatieve controles bieden een referentiepunt voor elke DRIT run om ervoor te zorgen dat de test geslaagd is en om te bevestigen of interpretatieve vragen op de test dia's ontstaan. Als een monster niet is vastbesloten om een duidelijk positief of negatief resultaat te hebben, wordt het aangeduid als een onbepaalde en een tweede keer getest door DRIT. Als dit monster niet duidelijk positief of negatief is na twee DRIT tests, wordt het naar een referentielaboratorium voor DFA of verwant testen gestuurd.
Zoals bij elke diagnostische test is ' Trouble Shooting ' handig bij onverwachte bevindingen. Als een DRIT-run bijvoorbeeld niet lukt (d.w.z. de positieve controle vertoont geen + 3 of + 4 kleurings intensiteit en antigeen-verdeling), zorg er dan voor dat alle chemicaliën en reagentia niet zijn verlopen. We hebben gevonden met behulp van een nieuw geopende fles waterstofperoxide ten minste eenmaal per week is nuttig om te helpen voorkomen dat niet-specifieke kleuring door oxidatie van het hersenweefsel. Bovendien wordt u aangeraden acetaat-buffer ten minste eenmaal per jaar minimaal te vervangen, ongeacht de gelabelde vervaldatum.
Er zijn een aantal voordelen van de DRIT over DFA inclusief lagere kosten, de mogelijkheid om de test uit te voeren buiten een gecentraliseerd laboratorium, alleen Lichtmicroscopie nodig in plaats van een fluorescerende Microscoop, en het relatief eenvoudige trainingsproces voor mensen die de test2,3,4beheren en lezen. Deze voordelen, in combinatie met de gevoeligheid en specificiteit van de DRIT die vergelijkbaar zijn met DFA2,7,8,9 , hebben al bewezen dat de test als een belangrijk instrument op grote schaal dient versterkte rabiës surveillance Programma's8,10 in Noord-Amerika. Daarnaast heeft de DRIT potentieel om meer surveillance en meer snelle tests mogelijk te maken in ontwikkelingslanden of andere gebieden met beperkte middelen, vooral na recente OIE/WHO-richtlijnen als een aanbevolen test.

Hoewel de DFA de meest gebruikte test is voor routine rabiës diagnose1, kunnen de aanschaf-en onderhoudskosten van een fluorescerende Microscoop worden beperkt tot ontwikkelingslanden2,3,4 en voor brede, grootschalige versterkte rabiës surveillance Programma's3,4. Bovendien vereist de DFA de mogelijkheid om monsters te koelen tijdens de fixatie en om monsters boven de omgevingstemperatuur te inbrotsen tijdens de antilichaam-antigeen reacties, wat een aanzienlijke hindernis kan zijn in landen zonder geschikte infrastructuur. Vanwege de beperkingen in verband met moderne DFA-testen, is de wereldwijde impact van hondsdolheid al lang onderschat5.
In dit verband is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës wereldwijd te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Het hier gepresenteerde DRIT-protocol biedt een laboratorium of veld-gebaseerd test alternatief voor de DFA die Lichtmicroscopie gebruikt en geen koeling of laboratorium incubatie nodig heeft tijdens de test6. De DRIT en DFA zijn vergelijkbaar in dat beide technieken Touch indrukken van hersen monsters verzameld uit mogelijk rabiate dieren gebruiken. Echter, de eerste stap van de DRIT gebruikt formaline als een historische fixeermiddel voor monsters, die rabiësvirus inactiveert. Dit zorgt voor een substantiële bioveiligheid verbetering ten opzichte van de aceton gebruikt om monsters te repareren in het DFA protocol3, dat is belangrijk niet alleen in het laboratorium, maar misschien nog meer in het veld-gebaseerde of gedecentraliseerde lab-omgevingen. Tot op heden toont de DRIT gevoeligheid en specificiteit gelijk aan de DFA2,7,8,9.
Sinds 2005 heeft het USDA WS programma grootschalige versterkte rabiës surveillance-inspanningen in Noord-Amerika uitgevoerd met behulp van de DRIT als onderdeel van een uitgebreid Wildlife rabiës Management programma10. De verscherpte bewaking van rabiës wordt gebruikt als aanvulling op op blootstelling gebaseerde volksgezondheids surveillance en-tests, voornamelijk in de fauna Meso-Carnivore soorten, waaronder wasberen (Procyon lotor), gestreepte Stink (Mephitis mephitis), Gray Foxes ( Urocyon cinereoargenteus), Rode Vossen (Vulpes vulpes) en coyotes (Canis latrans) die niet betrokken zijn geweest bij een blootstelling aan mens of huisdier. Dier karkassen die in het onderzoek zijn gebruikt, zijn aan USDA WS verstrekt door middel van verbeterde surveillance-inspanningen voor rabiës en bestond uit rabiës vector soorten die: ziek of vreemd handelen; dood aangetroffen, weggedood of hinderlijk; en zijn niet geassocieerd met een blootstelling aan mens of huisdier. De DRIT geeft een rabiës diagnostische test die kan worden gebruikt door getrainde veld biologen met weinig of geen laboratorium ervaring om het toezicht op rabiës te verbeteren en de financiële last en de werklast van de diagnostische laboratoria voor de volksgezondheid te verminderen10. De Basic DRIT training voor USDA WS veld medewerkers duurt meestal 1,5 tot 2 dagen, die ongeveer 4 h van de klas instructie met betrekking tot de fundamentele principes van bioveiligheid, methoden voor monster inzameling en de DRIT processen, alsmede > 8 h van laboratorium tijd die de test uitvoert. Er zijn opleidingsmogelijkheden beschikbaar voor USDA WS en Program coopera tors via de centra voor ziektebestrijding en preventie (CDC), LYSSA LLC en het Wistar Institute.
Binnen strategische beheer gebieden heeft USDA WS meer dan 94.000 Wildlife monsters getest met behulp van de DRIT en heeft meer dan 1.850 rabiate monsters gedetecteerd die waarschijnlijk onopgemerkt zouden zijn gebleven, waarbij alleen werd uitgegaan van blootstelling op basis van openbare gezondheidstests van verdachte dieren. Versterkte rabiës surveillancegegevens verstrekt door DRIT resultaten zijn van cruciaal belang voor het bieden van een completere temporele en ruimtelijke representatie van rabiës op het landschap ter ondersteuning van orale rabiësvaccinatie Programma's voor wilde dieren in de VS10, 11. Op dezelfde manier hebben provinciale natuur agentschappen in Canada DRIT in grootschalige Wildlife rabiës surveillance-inspanningen in tandem met hun volksgezondheidsprogramma's met succes8opgenomen. Zowel USDA WS als Canadian DRIT surveillance Programma's hebben nationale referentielaboratoria gebruikt om rabiës door DFA te bevestigen en een virale variant te typen die geschikt is voor8. Bovendien zenden USDA WS-veld biologen 10% van de negatieve specimens voor de bevestiging van DFA aan referentielaboratoria en sinds 2008, hebben deelgenomen aan tweejaarlijkse DRIT bekwaamheidsproeven die zijn verstrekt door het Wisconsin State Laboratory of Hygiene, als onderdeel van standaard maatregelen voor kwaliteitsborging.
Het doel van deze methode is om een alternatieve aanpak voor rabiës diagnostische tests die kunnen worden gedaan in gedecentraliseerde laboratoria, in het veld, of in gebieden zonder routine toegang tot elektronenmicroscopie bieden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

Laboratorium toezicht is een integraal onderdeel voor preventie, controle en beheer van rabiës. Hoewel de DFA de gouden standaard is voor de diagnose van rabiës, is het noodzakelijk om aanvullende diagnostische technieken te valideren om het toezicht op rabiës te verbeteren, met name in ontwikkelingslanden. Hier presenteren we een standaardprotocol voor de DRIT als een alternatieve, laboratorium of veld-gebaseerde test optie die Lichtmicroscopie gebruikt in vergelijking met de DFA. Aanraking indrukken van hersenweefsel verzameld van verdachte dieren zijn vastgesteld in 10% gebufferde formalin. De DRIT gebruikt rabiësvirus-specifieke monoklonale of Polyklonale antilichamen (geconjugeerd met biotine), een streptavidin-peroxidase enzym, en een chromogeen Reporter (zoals acetyl 3-amino-9-ethylcarbazol) om virale insluitsels binnen geïnfecteerd weefsel te detecteren. In ongeveer 1 uur kan een hersenweefsel monster worden getest en geïnterpreteerd door de DRIT. Evaluatie van verdachte dierlijke hersenen getest uit een verscheidenheid van soorten in Noord-Amerika, Azië, Afrika, en Europa hebben geïllustreerd hoge gevoeligheid en specificiteit door de DRIT naderen 100% met resultaten in vergelijking met DFA. Sinds 2005, het Amerikaanse ministerie van landbouw Wildlife Services (USDA WS) programma heeft grootschalige versterkte rabiës surveillance inspanningen uitgevoerd met behulp van de DRIT te testen > 94000 monsters verzameld uit de natuur in strategische rabiës beheer gebieden . De DRIT biedt een krachtig, zuinig hulpmiddel voor de diagnose van rabiës, dat door laboratorianen en veld biologen kan worden gebruikt om de huidige bewakings-, preventie-en controleprogramma's van de rabiës wereldwijd te verbeteren.

Positieve resultaten van de DRIT tonen rode intracytoplasmorische virale insluitsels die kunnen variëren in vorm en grootte (Figuur 3) binnen het cytoplasma van blauwachtige cellichamen. De insluitsels lijken glad met zeer heldere marges en een minder intensief bevlekt centraal gebied. De intensiteit en antigeen verdeling worden geregistreerd wanneer insluitsels worden gedetecteerd. Intensiteit wordt beoordeeld van + 4 tot + 1. De positieve controle Slide moet een intense, flauw magenta schittering hebben die wordt aangeduid als een + 4 intensiteit. Een licht verlies van kleur kan vooral optreden wanneer de behandeling van het monster niet optimaal is (d.w.z. dat het monster weefsel lichtjes is afgebroken) en deze moeten worden beoordeeld als + 3. Merkbaar saaie vlek wordt beoordeeld als een + 2 tot + 1, wordt niet beschouwd als diagnostische voor rabiësvirus infectie en is gelabeld als onbepaalde.
Bovendien wordt antigeen-verdeling beoordeeld van + 4 tot + 1 met + 4 die antigen-distributie vertegenwoordigt die bestaat uit een overvloed aan grote en kleine insluitsels variërend in grootte en vorm, en aanwezig in elk veld (of bijna elk veld) in het CZS-weefsel Aanraak vertoning. De positieve controle heeft meestal een + 4 antigen-verdeling. Een antigeen-verdeling van + 3 zou worden toegewezen wanneer er in een verscheidenheid van formaten in de meeste, maar niet alle weergave gebieden inclusies zijn. Indien insluitsels worden aangetroffen in 10%-50% van de Microscoop velden, wordt een a + 2 antigeen distributie toegewezen. Wanneer insluitsels worden aangetroffen in < 10% van de Microscoop velden, wordt een + 1-antigeen verdeling toegewezen.
Meeste CNS weefsel met rabiësvirus vertonen typische virale insluitsels ingedeeld als + 3 of + 4 intensiteit en antigeen distributie. Als de resultaten duiden op een + 2 of + 1 intensiteit of een + 2 of + 1 antigeen distributie, wordt het monster een "onbepaalde" verklaard en wordt het herhaald testen gerechtvaardigd. Als hetzelfde monster een herhaalde onbepaalde testuitslag heeft, moet het monster worden verzonden naar een referentielaboratorium voor DFA of verwante bevestigende testen.
Een testmonster met behulp van de DRIT wordt beschouwd als negatief voor rabiësvirus antigenen nadat de dia met het CZS-weefsel is gescand bij een vergroting van 200X of hoger en er geen typische virus insluitsels worden gedetecteerd (Figuur 4). Negatieve monsters vertonen blauwachtige cellichamen met weinig of geen niet-specifieke kleuring.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Figuur 1: installatie van 10 dia-kleurings gerechten met reagentia voor testen. De gerechten zijn gelabeld met reagensnaam in de volgorde die nodig is om het protocol te volgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figuur 2: eenvoudige vochtigheids kamer gemaakt met een natte papieren handdoek en celcultuurplaten.  Een eenvoudige vochtigheids kamer met een natte papieren handdoek en celcultuurplaten maakt toepassing op veld basis mogelijk.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figuur 3: representatieve glijbanen van rabiës positieve virale insluitsels met + 4 intensiteit en + 4 antigeen verdeling. (A en B) tonen positieve rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 200x. (C en D) tonen positieve rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 400x. Schaal staven = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figuur 4: representatieve dia's van negatieve monsters zonder virale rabiës-insluitsels. (A en B) Toon monsters negatief voor rabiës virale insluitsels bij een vergroting van 200x. (C en D) Toon monsters negatief voor rabiës virale insluitsels bij 400x vergroting. Schaal staven = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figuur 5: representatieve foto's van de proefinstallaties die door USDA WS worden gebruikt. A) mobiele testfaciliteit in een afgesloten aanhangwagen voor vervoer. B) recreatief voertuig dat is uitgerust voor proef proeven. C) DRIT testfaciliteit in combinatie met universitair laboratorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test

De directe Rapid immunohistochemische test (DRIT) biedt een Wereldorganisatie voor diergezondheid en Wereldgezondheidsorganisatie (OIE/WHO) erkend alternatief voor de direct fluorescent antilichaam (DFA) test voor de diagnose van rabiës. Deze test maakt het mogelijk voor veld-gebaseerde toepassingen die kunnen worden uitgevoerd in ongeveer 1 h na hersen vertoningen met behulp van Lichtmicroscopie.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

De DRIT is belangrijk omdat het een rabiës diagnostische test die kan worden uitgevoerd in gedecentraliseerde laboratoria in het veld of in gebieden zonder routinematige toegang tot elektronenmicroscopie biedt. Het belangrijkste voordeel van de DRIT is dat het alleen eenvoudige lichte microscopie gebruikt en de resultaten kunnen worden verkregen in ongeveer een uur. De DRIT biedt een krachtig economisch instrument voor rabiës diagnose die kan worden gebruikt door laboratoriumartsen en veldbiologen om rabiës surveillance, preventie en controle programma's wereldwijd te verbeteren.Voor dieren die vers worden verzameld of ontdooid zijn naar omgevingstemperatuur, plaatst u het dier supine op een vlak oppervlak met de cervicale wervelkolom lichtjes gedraaid naar de examinator. Palpate om het atlanto-occipital gewricht te identificeren op het zijaspect van de cervicale wervelkolom. Met behulp van een scalpelblad, maak een incisie op het niveau van de atlanto-occipital gewricht op de ventrale aspect snijden door alle lagen van spier en zacht weefsel, met inbegrip van de luchtpijp en slokdarm.Ga door tot het benaderen van het voorste aspect van de halswervels. Beweeg vervolgens het hoofd van het dier in een eindbereik uitbreiding totdat de hersenstam zichtbaar is. Gebruik een scalpel mes om alle zichtbare hersenstam en het centrale zenuwstelsel weefsel te verwijderen voor monster.Plaats de hersenstammonsters in een onbreekbare container en label dienovereenkomstig. Ten eerste, uiteengezet kleuring gerechten die diep genoeg zijn om voor volledige onderdompeling van een monster dia mogelijk te maken. Vul schotel een met 10% fosfaat gebufferd formaline.Vul gerechten twee, vier en vijf met TPBS. Vul schotel drie met 3% waterstofperoxide. Vul vervolgens gerechten zes, acht, negen en tien met gedestilleerd of gedeïsteerd water.Vul schotel zeven met Gill's hematoxylin formulering nummer twee verdund in een 1:1 verhouding met gedestilleerd water. Om de amino-ethyl-carbazole voorraadoplossing voor te bereiden, met behulp van een glazen pipet, plaats vijf milliliter N, N-dimethylformamide in een glazen container. Voeg 120 milligram tablet 3-amino-9-ethylcarbazol toe aan de glascontainer en schud tot deze volledig is opgelost.Om de AEC werkende verdunning voor te bereiden, voeg je zeven milliliter acetaatbuffer toe aan een 15 milliliter centrifugebuis. Gebruik een glazen pipet om 0,5 milliliter AEC-voorraadoplossing toe te voegen aan de centrifugebuis. Voeg 0,75 milliliter van 3% waterstofperoxide oplossing.Gebruik een spuit van 10 milliliter met een spuitfilter van 0,45 micrometer om de oplossing te filteren. Om te beginnen, gebruik maken van een uitstrijkje waterdichte permanente inkt marker om glas microscoop dia's label met een uniek nummer voor elk exemplaar. Gebruik een scalpel mes om de hersenstam te verwijderen uit de container en plaats het op een papieren handdoek.Gebruik een tweede papieren handdoek om voorzichtig dep weg overtollig vocht, bloed of bont om alleen de hersenstam weefsel onthullen. Indien nodig, sectie van de hersenstam weefsel om een dwarsdoorsnede te onthullen. Raak heel voorzichtig de microscoop dia naar verschillende punten van de hersenstam zonder laterale beweging om meerdere gebieden van hersenstam worden overgebracht naar de dia ervoor te zorgen dat slechts een of twee lagen van cellen worden overgedragen van het hersenweefsel naar de dia.Laat de glijbanen ongeveer vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Dompel vervolgens de dia's in de 10% gebufferde formaline in schotel een gedurende 10 minuten. Haal de glijbanen uit de formaline en dip ze in de TPBS-oplossing in schaal twee.Dompel de gespoelde glijbanen in de waterstofperoxideoplossing in schaal drie gedurende 10 minuten onder. Verwijder hierna de glijbanen uit de waterstofperoxide en dip ze in de verse TPBS in schaal vier. Na het verwijderen van overtollige waterstofperoxide, plaats de dia's in de verse TPBS in schotel vijf.Neem de dia's een voor een van schotel vijf, schud af en dep een overtollige buffer en plaats de dia op een bevochtigde papieren handdoek op het lab bank. Wanneer alle dia's zijn overgedragen, gebruik dan een druppelaar of pipet om voldoende primaire anti-rabiës virus antilichaam op elke dia te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. Bedek de glijbanen met putplaten of een andere eenvoudige cover om een vochtigheidskamer te creëren en de glijbanen 10 minuten op kamertemperatuur in de kamer uit te broeden.Verwijder hierna de glijbanen uit de vochtigheidskamer, schud en dep overtollige conjugaat af en dip de glijbanen in de TPBS in schaal vijf. Werken met een dia tegelijk, verwijder een dia van de TPBS en gebruik een druppelaar of pipet om genoeg Streptavidin peroxidase complex te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. Zodra alle glijbanen zijn bedekt, uitbroed ze in de vochtigheidskamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de glijbanen uit de vochtigheidskamer, schud en dep overtollig complex af en dip spoel de glijbanen in de TPBS in schaal vijf. Werken met een dia tegelijk, verwijder een dia van de TPBS en gebruik een pipet om genoeg AEC werkoplossing te laten vallen om het CNS-weefsel te dekken. De glijbanen in de vochtigheidskamer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden.Daarna, dip spoel de glijbanen in het gedestilleerde water in schotel zes en leg ze in een tegensnede van Gill's hematoxylin in schotel zeven gedurende twee minuten. Onmiddellijk dip spoel alle glijbanen in het gedestilleerde water in schotel acht. Herhaal dit twee keer met behulp van het zoetwater in gerechten negen en 10 voor elke wasbeurt.Werken een dia per keer, verwijder een glijbaan uit het water en schudden en dep uit overtollig water. Gebruik een in water oplosbaar montagemedium om een afdekplaat op de glijbaan aan te brengen. Gebruik dan een lichtmicroscoop met een 20X doelstelling om de dia's te bekijken.Positieve resultaten van de DRIT tonen rode intracytoplasmatische virale insluitsels die kunnen variëren in vorm en grootte binnen het cytoplasma van de blauwachtige cellichamen. De insluitsels lijken glad met zeer heldere marges en een minder intensief gekleurd centraal gebied. De antigeenverdeling wordt ingedeeld van plus vier tot plus één met plus vier vertegenwoordigende antigeendistributie die bestaat uit een overvloed aan grote en kleine insluitsels variërend in grootte en vorm en aanwezig in elk gezichtsveld binnen de CNS weefsel touch impression.Een verdeling van plus drie wordt toegewezen wanneer er insluitsels in een verscheidenheid van maten in de meeste, maar niet alle velden van mening. Als insluitsels worden gevonden in 10 tot 50% van de microscoopvelden, wordt een plus twee antigeenverdeling toegewezen, terwijl er één wordt toegewezen wanneer insluitsels in minder dan 10% van de velden worden gevonden. De meeste CNS weefsels met rabiës virus aanwezig vertonen typische virale insluitsels gesorteerd als plus drie of plus vier intensiteit en antigeen distributie.Als de resultaten wijzen op een plus één of plus twee in intensiteit of antigeenverdeling, wordt het monster als onbepaald verklaard en is herhaalde tests gerechtvaardigd. Een testmonster met DRIT wordt als negatief beschouwd voor rabiësvirusantigenen nadat de dia met het CNS-weefsel is gescand bij een vergroting van 200X of meer en er geen typische virusinclusies worden gedetecteerd. Negatieve monsters vertonen blauwachtige cellichamen met weinig of geen bekende specifieke kleuring.Elke persoon die rabiës diagnostische tests moet ontvangen standaard pre-exposure rabiës vaccinaties en ondergaan regelmatige serologische antilichaam evaluatie. Niet-geïmmuniseerde personen mogen geen gebieden betreden waar dergelijk werk wordt uitgevoerd. Naast de voorzorgsmaatregelen die worden genomen bij het werken met het levende rabiësvirus, zijn verschillende reagentia die bij de test worden gebruikt, gevaarlijk.Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen voor elk reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Is het drastisch verbeterde Met behulp van een verticale Diffusion Kamer Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...