Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
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Nous rendons hommage à tout le personnel des Services de la faune de l'USDA qui, à l'heure actuelle ou en a déjà recueilli, a recueilli des échantillons améliorés de surveillance de la rage et qui a effectué le DRIT pour le diagnostic de la rage. De même, nous reconnaissons les nombreux coopérateurs qui nous aident dans la collecte améliorée de la surveillance de la rage. Nous remercions également les Centers for Disease Control and Prevention et l'Institut Wistar pour l'accès à des réactifs essentiels nécessaires à la conduite du DRIT et pour offrir des possibilités de formation. En outre, nous apprécions le diagnostic de confirmation et l'assistance technique fournie par les Centers for Disease Control and Prevention et par le Wadsworth Center avec le Département de la Santé de l'État de New York. L'utilisation de tout produit commercial n'est qu'à des fins de comparaison et ne constitue pas une approbation.

Chaque personne effectuant des tests diagnostiques de la rage devrait recevoir une série standard de vaccination contre la rage avant l'exposition et subir une évaluation sérologique régulière des anticorps, avec des vaccinations de rappel au besoin. Les personnes non immunisées ne devraient pas entrer dans les laboratoires ou les zones où de tels travaux sont effectués. Toute manipulation des tissus et des lames doit être effectuée pour ne pas aérosoliser les liquides ou produire des particules en suspension dans l'air. Les hottes de fumée ne sont pas exigées mais quand possible elles peuvent fournir la protection supplémentaire contre des odeurs, des ectoparasites, et des fragments d'os. L'équipement de protection individuelle minimum, y compris les gants et la protection oculaire, doit être porté en tout temps pendant la collecte et l'essai d'échantillon.
1. Collection Brainstem
<ol><li>Recueillir des échantillons de tronc cérébral immédiatement après la collecte des carcasses ou s'assurer que les carcasses sont placées dans des congélateurs pour être entreposées jusqu'à ce qu'elles soient testées plus tard. Si les carcasses d'animaux sont congelées, décongeler à température ambiante avant la collecte du tronc cérébral pour faciliter la collecte. Dans certaines circonstances, des échantillons sont prélevés directement auprès d'un animal congelé.</li>
	<li>
Pour les animaux fraîchement recueillis ou décongelés à température ambiante, placez le supin animal sur une surface plane avec la colonne cervicale légèrement tournée vers l'examinateur. Palpate pour identifier l'articulation atlanto-occipital sur l'aspect latéral de la colonne cervicale.
	<ol>
<li>Pour les carcasses qui sont encore complètement congelées, placez la supine animale comme décrit ci-dessus, si possible. Utilisez des scies, des couteaux, des cisailles osseuses ou d'autres équipements similaires pour séparer complètement la tête du corps. REMARQUE: Tous les équipements utilisés qui ne sont pas utilisés ponctuels doivent être nettoyés à fond entre les échantillons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l'aide d'une lame de scalpel, faire une incision au niveau de l'articulation atlanto-occipitale à l'aspect ventral, coupant à travers toutes les couches de muscle et de tissu mou, y compris la trachée et l'œsophage. Continuer jusqu'à ce que l'aspect antérieur approximatif des vertèbres cervicales de la colonne vertébrale. Pour les tissus congelés, utilisez une lame de scalpel pour enlever les couches restantes de muscle et de tissu mou pour exposer le magnum de foramen.</li>
	<li>Déplacer la tête de l'animal dans l'extension de fin de gamme jusqu'à ce que le tronc cérébral est visible. Utilisez une lame de scalpel pour enlever tout le tissu visible du tronc cérébral/système nerveux central (SNC) à des fins d'échantillonnage. Pour un échantillon congelé, utilisez une lame de scalpel pour enlever autant de tissu gelé du tronc cérébral/CNS que possible de l'intérieur du crâne.</li>
	<li>Placez les échantillons de tronc cérébral dans un contenant incassable (c.-à-d. boîte à onduleur métallique, cryo-vial, etc.) et étiquetez en conséquence.</li>
	<li>S'assurer que les échantillons du tronc cérébral sont testés immédiatement après la collecte par l'intermédiaire du test DRIT, réfrigérés (4 oC) jusqu'à 24 h avant l'essai, ou congelés (-20 oC) jusqu'au moment de l'essai si les tests auront lieu plus de 24 h après la collecte de l'échantillon.</li>
</ol>2. Préparation de matériaux pour DRIT
<ol><li>
Mise en place de 10 plats de coloration de diapositives (figure 1) REMARQUE: Les plats de coloration sont assez profonds pour permettre une immersion complète de la glissière (diamètre 96 mm, hauteur 72 mm, profondeur 42 mm, volume 250 ml). 6 Annonces<ol>
<li>Remplir le plat 1 d'une formaline tamponnée de phosphate de 10 %. Remplacer la formaline après 2 essais ou par semaine.</li>
		<li>Remplissez les plats 2, 4 et 5 avec du phosphate tamponné salin avec 1% tween-80 (TPBS). Remplacer par du TPBS frais avant chaque test.</li>
		<li>Remplir le plat 3 avec 3 % de peroxyde d'hydrogène. Remplacer le peroxyde d'hydrogène avant chaque essai.</li>
		<li>Remplissez les plats 6, 8, 9 et 10 d'eau distillée ou déionisée. Remplacer l'eau avant chaque essai.</li>
		<li>Remplir le plat 7 avec la formulation d'hématoxyline Gills #2 diluée dans un rapport de 1:1 dans l'eau distillée6. Remplacer l'hématoxylin après 2 essais ou par semaine. REMARQUE: Selon le protocole DRIT original développé par le CDC12, un rapport de 1:2 de l'hématoxyline Gills à l'eau peut être utilisé si la contre-coloration est trop sombre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution de stock amino-éthylcarbazole (AEC)
	<ol>
<li>À l'aide d'une pipette en verre, déposer 5 mL de N,N-dimethylformamide dans un récipient en verre.</li>
		<li>Ajouter un comprimé de 20 mg de 3-amino-9-éthylcarbazole et secouer jusqu'à dissolution complète. Étiquetez le pot avec le « stock D'AEC » et la date à laquelle le stock a été fabriqué. REMARQUE: La solution de stock AEC peut être stockée sous réfrigération (4 oC) et utilisée pendant 1 à 2 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la dilution de travail d'AEC
	<ol>
<li>Ajouter 7 ml de tampon d'acétate dans un tube de centrifugeuse de 15 ml.</li>
		<li>À l'aide d'une pipette en verre, ajouter 0,5 ml de la solution de stock D'AEC au tube de centrifugeuse.</li>
		<li>Ajouter 0,075 ml de peroxyde d'hydrogène de 3 % au tube.</li>
		<li>Filtrer la solution à l'aide d'une seringue de 10 ml à l'aide d'un filtre à seringues de 0,45 m. REMARQUE: La dilution de travail AEC doit être créée juste avant chaque test DRIT car elle n'est stable que pendant 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Test d'immunohistochimie rapide directe
<ol><li>
Étiquetez les lames de microscope en verre avec un numéro unique pour chaque spécimen à l'aide d'un marqueur d'encre permanent imperméable à l'épreuve des frottis.
	<ol>
<li>À l'aide d'une lame de scalpel, retirer le tronc cérébral du contenant et le placer sur du papier essuie-tout. Effacer doucement tout excès de liquide, de sang ou de fourrure avec une deuxième serviette en papier pour révéler seulement le tissu du tronc cérébral13. Si nécessaire, sectiondulez le tissu du tronc cérébral pour révéler une section transversale.</li>
		<li>Touchez très doucement la lame du microscope jusqu'à la section transversale du tissu du tronc cérébral. Touchez la diapositive au tronc cérébral à plusieurs points sans mouvement latéral pour permettre le transfert de plusieurs zones du tronc cérébral sur la diapositive13. Assurez-vous que seulement 1 ou 2 couches de cellules sont transférées du tissu cérébral à la diapositive avec un toucher doux. Aucun agent de montage n'est nécessaire pour apposer le tissu du tronc cérébral sur les diapositives. Inclure à la fois un contrôle positif et négatif dans chaque course DRIT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laisser sécher les glissières à l'air pendant environ 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Immerger les diapositives dans une formaline tamponnée de 10 % pendant 10 min (plat 1).</li>
	<li>Retirer les lames de formaline et le rinçage dans une solution de TPBS (plat 2).</li>
	<li>Immerger les lames dans 3 % de peroxyde d'hydrogène pendant 10 min (plat 3).</li>
	<li>Retirer les lames du peroxyde d'hydrogène et le rinçage dans le TPBS frais (plat 4). Après avoir enlevé l'excès de peroxyde d'hydrogène, placez les glissières dans du TPBS frais (plat 5) et travaillez avec une diapositive à la fois pendant que les autres diapositives restent immergées dans le TPBS.</li>
	<li>Prenez les diapositives de TPBS (plat 5) un à la fois, secouez et tachez l'excès de tampon, et placez-les sur une serviette en papier humidifiée sur le banc de laboratoire, comme base d'une « chambre d'humidité ». À l'aide d'une pipette, déposer suffisamment d'anticorps antirabiques primaires sur chaque diapositive pour couvrir le tissu du SNC. Incuber les glissières pendant 10 minutes dans la chambre d'humidité (c.-à-d. en couvrant les glissières avec des plaques de puits ou tout autre couvercle simple pendant qu'elles sont pondues sur l'essuie-tout humidifié) à température ambiante (figure 2).</li>
	<li>Retirer les glissières de la chambre d'humidité, secouer et effacer l'excédent conjugué, et tremper-rincer les lames dans TPBS (réutiliser le même TPBS dans le plat 5).</li>
	<li>Travailler avec une diapositive à la fois, tandis que d'autres restent immergés dans TPBS - utiliser une pipette pour laisser tomber suffisamment de complexe streptavidin-peroxidase pour couvrir le tissu du SNC. Incuber dans la chambre d'humidité pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer les glissières de la chambre d'humidité, secouer et effacer l'excès de complexe, et les rincer à trempette dans TPBS (plat 5).</li>
	<li>Travailler avec une diapositive à la fois, secouer et effacer l'excès tampon, tandis que d'autres restent immergés dans TPBS - utiliser une pipette pour déposer suffisamment DAC (préparation est expliquée ci-dessus et doit être fait immédiatement avant l'utilisation) pour couvrir le tissu du SNC. Incuber dans la chambre d'humidité pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Faire tremper les lames dans de l'eau distillée (plat 6).</li>
	<li>Placer les lames dans la contre-tache de Gills Hematoxylin (dilué 1:1 avec de l'eau distillée) pendant 2 min (plat 7).</li>
	<li>Immédiatement tremper-rincer toutes les lames dans de l'eau distillée (plat 8). Répéter deux fois avec de l'eau douce à chaque fois (plats 9 et 10).</li>
	<li>Travailler avec une diapositive à la fois, tandis que d'autres restent immergés dans l'eau distillée (plat 10) - secouer et effacer l'excès d'eau et d'utiliser un milieu de montage soluble dans l'eau pour apposer un bordereau de couverture.</li>
	<li>Utilisez un microscope léger avec un objectif 20x pour afficher les diapositives et un objectif 40x si une inspection plus approfondie est nécessaire.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le DRIT est une méthode flexible adaptée à la surveillance sur le terrain pour détecter la présence du virus de la rage qui peut être utilisé dans les zones de laboratoire décentralisées. Bien qu'il soit possible d'effectuer l'ensemble de l'essai dans un cadre sur le terrain comme sur le hayon d'un camion, il est idéal d'avoir un petit espace intérieur dédié à DRIT en raison de problèmes chimiques, d'équipement et de stockage d'approvisionnement. En outre, le respect de toutes les lois fédérales, étatiques et locales applicables, ainsi que les règlements d'utilisation et d'élimination des produits chimiques doivent être pris en considération. Actuellement, USDA WS dispose de 15 installations DRIT pour tester des échantillons provenant de 17 États. Les installations DE l'USDA WS DRIT sont établies en collaboration avec les laboratoires de santé publique des universités et de l'État, dans des salles désignées dans des installations plus grandes et dans des remorques fermées qui ont été réaménagées et converties pour servir d'unités d'essai mobiles dans le cas d'intervention d'urgence en cas d'éclosion d'urgence où il est essentiel d'améliorer les tests de surveillance de la rage avec un délai d'exécution immédiat (figure 5).
Tandis que le essai a été réussi utilisant le matériel de tronc cérébral de qualité variable, le tissu frais de tronc cérébral sans décomposition de tissu est optimal. À mesure que la décomposition, la dessiccation ou la liquéfaction se produit, la qualité de l'échantillon diminue et le test peut détecter des taches plus non spécifiques qui peuvent confondre les résultats. Cette observation est similaire entre le DFAE et le DRIT2. Le tronc cérébral/SNC doit être recueilli dès que possible, puis conservé congelé (-20 oC) jusqu'à l'essai.
En règle générale, la plupart des installations WS de l'USDA traitent de 12 à 24 diapositives à la fois au cours d'une session DRIT, y compris un contrôle positif et un contrôle négatif qui ont été confirmés par l'intermédiaire du MAE. Les contrôles positifs et négatifs fournissent un point de référence pour chaque course DRIT pour s'assurer que le test a été réussi et pour confirmer si des questions d'interprétation se posent sur les diapositives de test. Si un échantillon n'est pas déterminé comme présentant un résultat positif ou négatif clair, il est étiqueté comme indéterminé et testé une deuxième fois par drIT. Si cet échantillon n'est pas clairement positif ou négatif après deux tests DRIT, il est envoyé à un laboratoire de référence pour le DFA ECaf ou les tests connexes.
Comme pour tout test de diagnostic, le « tir à la difficulté » est utile avec des résultats inattendus. Par exemple, si une course DRIT est infructueuse (c.-à-d. que le contrôle positif ne présente pas d'intensité de coloration et de distribution d'antigènes de 3 ou 4), assurez-vous que tous les produits chimiques et réactifs n'ont pas expiré. Nous avons trouvé l'utilisation d'une bouteille nouvellement ouverte de peroxyde d'hydrogène au moins une fois par semaine est utile pour aider à prévenir la coloration non spécifique par l'oxydation du tissu cérébral. En outre, nous recommandons de remplacer le tampon d'acétate au moins une fois par an au minimum, quelle que soit la date d'expiration étiquetée.
Il y a un certain nombre d'avantages de la DRIT par rapport au DFAE, y compris des coûts plus bas, la capacité d'effectuer le test à l'extérieur d'un laboratoire centralisé, le besoin de microscopie légère au lieu d'un microscope fluorescent, et le processus de formation relativement simple pour personnes administrant et lisant le test2,3,4. Ces avantages, couplés à la sensibilité et la spécificité de la DRIT qui sont comparables à DFA2,7,8,9 ont déjà prouvé que le test sert d'outil important à grande échelle programmes améliorés de surveillance de la rage8,10 en Amérique du Nord. En outre, le DRIT pourrait permettre une surveillance accrue et des tests plus rapides dans les pays en développement ou dans d'autres régions où les ressources sont limitées, en particulier après les récentes directives de l'OIE et de l'OMS en tant que test recommandé.

Bien que le DFAE soit le test le plus utilisé pour le diagnostic systématique de la rage1, le coût d'achat et d'entretien d'un microscope fluorescent peut être limité aux pays en développement2,3,4 et pour les larges, programmes améliorés de surveillance de la rage à grande échelle3,4. En outre, le DFA exige la possibilité de réfrigérer des échantillons pendant la fixation et d'incuber des échantillons au-dessus de la température ambiante pendant les réactions anticorps-antigènes, ce qui peut constituer un obstacle important dans les pays sans infrastructure appropriée. En partie en raison des limites associées aux tests modernes du DFAE, l'impact mondial de la rage a longtemps été sous-estimé5.
À cet égard, il est nécessaire de valider d'autres techniques de diagnostic pour améliorer la surveillance de la rage à l'échelle mondiale, en particulier dans les pays en développement. Le protocole DRIT présenté ici offre une alternative d'essai en laboratoire ou sur le terrain au DFAE qui utilise la microscopie légère et ne nécessite pas de réfrigération ou d'incubation en laboratoire pendant le test6. Le DRIT et le DFAE sont similaires en ce que les deux techniques utilisent des impressions tactiles d'échantillons de cerveau prélevés sur des animaux potentiellement enragés. Cependant, la première étape de la DRIT utilise la formaline comme un fixatif historique pour les échantillons, qui inactive le virus de la rage. Cela fournit une amélioration substantielle de la biosécurité par rapport à l'acétone utilisée pour fixer des échantillons dans le protocole3du DFAE, ce qui est important non seulement en laboratoire, mais peut-être encore plus dans les environnements de laboratoire sur le terrain ou décentralisés. À ce jour, le DRIT fait preuved'une sensibilité et d'une spécificité égales au DFA 2,7,8,9.
Depuis 2005, le programme WS de l'USDA a mené des efforts de surveillance de la rage à grande échelle en Amérique du Nord en utilisant le DRIT dans le cadre d'un programme complet de gestion de la rage de la faune10. La surveillance accrue de la rage est utilisée comme complément à la surveillance de la santé publique basée sur l'exposition et aux tests principalement des espèces méso-carnivores de la faune, y compris les ratons laveurs (Procyon lotor), les mouffettes rayées (Mephitis mephitis), les renards gris ( Urocyon cinereoargenteus), renards roux (Vulpes vulpes) et coyotes (Canis latrans) qui n'ont pas été impliqués dans une exposition humaine ou domestique. Les carcasses d'animaux utilisées dans les essais ont été soumises à l'USDA WS grâce à des efforts accrus de surveillance de la rage et comprenaient des espèces vecteurs de la rage qui sont : des acteurs malades ou étranges; trouvé mort, tué sur la route, ou une nuisance; et ne sont pas associés à une exposition humaine ou domestique. Le DRIT fournit un test de diagnostic de la rage qui peut être utilisé par des biologistes de terrain formés avec peu ou pas d'expérience de laboratoire pour améliorer la surveillance de la rage et de réduire le fardeau financier et la charge de travail des laboratoires de diagnostic de santé publique10. La formation de base DRIT pour les employés de terrain USDA WS prend généralement 1,5 à 2 jours, ce qui comprend environ 4 h d'enseignement en classe couvrant les principes fondamentaux de la biosécurité, les méthodes de collecte d'échantillons et les processus DRIT ainsi que 'gt;8 h de temps de laboratoire pour effectuer l'essai. Des possibilités de formation ont été offertes aux usDA WS et aux coopérateurs de programmes par l'intermédiaire des Centers for Disease Control and Prevention (CDC), de LYSSA LLC et du Wistar Institute.
Dans les zones de gestion stratégique, USDA WS a testé plus de 94 000 échantillons d'animaux sauvages à l'aide du DRIT et a détecté plus de 1 850 échantillons enragés qui n'auraient probablement pas été détectés en se fondant uniquement sur des tests de santé publique fondés sur l'exposition d'animaux suspects. L'amélioration des données de surveillance de la rage fournies par les résultats de la DRIT est essentielle pour fournir une représentation temporelle et spatiale plus complète de la rage dans le paysage à l'appui des programmes de vaccination antirabique orale pour la faune dans l'ensemble des États-Unis10, 11. De même, les organismes provinciaux de protection de la faune du Canada ont intégré le DRIT dans les efforts de surveillance de la rage de la faune à grande échelle en tandem avec leurs programmes de santé publique avec succès8. Les programmes canadiens de surveillance de l'USDA WS et de la DRIT canadienne ont utilisé des laboratoires de référence nationaux pour confirmer la rage par le DFAE et pour effectuer la dactylographie virale au besoin8. En outre, les biologistes de terrain de l'USDA WS envoient 10 % des échantillons négatifs pour la confirmation du DFAE aux laboratoires de référence et, depuis 2008, ont participé à des tests de compétence DRIT semestriels fournis par le Wisconsin State Laboratory of Hygiene, dans le cadre de la norme mesures d'assurance de la qualité.
L'objectif de cette méthode est d'offrir une approche alternative pour les tests de diagnostic de la rage qui peut être fait dans des laboratoires décentralisés, sur le terrain ou dans des zones sans accès systématique à la microscopie électronique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

La surveillance en laboratoire fait partie intégrante des efforts de prévention, de contrôle et de gestion de la rage. Bien que le MAE soit l'étalon-or du diagnostic de la rage, il est nécessaire de valider d'autres techniques de diagnostic pour améliorer la surveillance de la rage, en particulier dans les pays en développement. Ici, nous présentons un protocole standard pour le DRIT comme une option alternative, en laboratoire ou sur le terrain d'essai qui utilise la microscopie légère par rapport au DFAE. Les impressions tactiles de tissu cérébral prélevées sur des animaux suspects sont fixées dans une formaline tamponnée de 10 %. Le DRIT utilise des anticorps monoclonaux ou polyclonales spécifiques au virus de la rage (conjugués à la biotine), une enzyme streptavidin-peroxidase et un journaliste chromogène (comme l'acétyl 3-amino-9-éthylcarbazole) pour détecter les inclusions virales dans les tissus infectés. Dans environ 1 h, un échantillon de tissu cérébral peut être testé et interprété par le DRIT. L'évaluation des cerveaux animaux suspects testés à partir d'une variété d'espèces en Amérique du Nord, en Asie, en Afrique et en Europe a montré une sensibilité et une spécificité élevées par le DRIT approchant 100% avec les résultats par rapport au DFAE. Depuis 2005, le programme Wildlife Services (USDA WS) du département de l'Agriculture des États-Unis a mené des efforts de surveillance de la rage à grande échelle en utilisant le DRIT pour tester 94 000 échantillons prélevés sur la faune dans des zones stratégiques de gestion de la rage. . Le DRIT fournit un outil puissant et économique pour le diagnostic de la rage qui peut être utilisé par les travailleurs et les biologistes de terrain pour améliorer les programmes actuels de surveillance, de prévention et de contrôle de la rage à l'échelle mondiale.

Les résultats positifs de la DRIT montrent des inclusions virales intracytoplasmiques rouges qui peuvent varier dans la forme et la taille (Figure 3) dans le cytoplasme des corps de cellules bleuâtres. Les inclusions semblent lisses avec des marges très lumineuses et une zone centrale moins intensément tachée. L'intensité et la distribution d'antigènes sont enregistrées lorsque des inclusions sont détectées. L'intensité est évaluée de 4 à 1. La glissière de contrôle positive doit avoir une brillance magenta intense et flagrante qui est appelée une intensité de 4. Une légère perte de couleur peut se produire en particulier lorsque la manipulation de l'échantillon n'a pas été optimale (c.-à-d., le tissu de l'échantillon s'est légèrement décomposé) et ceux-ci doivent être classés comme '3. La tache terne est sensiblement notée comme étant de 2 à 1, n'est pas considérée comme un diagnostic pour l'infection par le virus de la rage et est étiquetée comme indéterminée.
De plus, la distribution d'antigènes est graduée de 4 à 1, la distribution d'antigènes représentant la 4e place étant composée d'une abondance de grandes et petites inclusions dont la taille et la forme varient, et présente dans tous les champs (ou presque tous les champs) de vue dans le tissu du SNC. impression tactile. Le contrôle positif a généralement une distribution d'antigène no 4. Une distribution d'antigène de 3 serait attribuée lorsqu'il y a des inclusions dans une variété de tailles dans la plupart des champs de vision, mais pas dans tous les domaines d'opinion. Si des inclusions sont trouvées dans 10%-50% des champs de microscope, une distribution d'antigène n ' 2 est assignée. Lorsque des inclusions sont trouvées dans les champs de microscopes, une distribution d'antigènes n ' 1 est attribuée.
La plupart des tissus du SNC porteurs du virus de la rage présentent des inclusions virales typiques classées comme intensité s'est égale à 3 ou 4 et distribution d'antigènes. Si les résultats indiquent une intensité de 2 ou 1 ou une distribution d'antigènes de 2 ou 1, l'échantillon est déclaré « indéterminé » et des tests répétés sont justifiés. Si le même échantillon a un résultat d'essai à répétition pour une période indéterminée, l'échantillon doit être envoyé à un laboratoire de référence pour le DFAE ou les tests de confirmation connexes.
Un échantillon d'essai utilisant le DRIT est considéré comme négatif pour les antigènes du virus de la rage après que la diapositive contenant le tissu du SNC a été numérisée à un grossissement de 200X ou plus et qu'aucune inclusion typique de virus n'est détectée (figure 4). Les échantillons négatifs présentent des corps de cellules bleuâtres avec peu ou pas de taches non spécifiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Figure 1 : Configuration de 10 plats de coloration de diapositives avec réactifs pour les tests. Les plats sont étiquetés avec le nom de réactif dans l'ordre nécessaire pour suivre le protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figure 2 : Chambre d'humidité simple créée avec une serviette en papier humide et des plaques de culture cellulaire.  Une simple chambre d'humidité à l'aide d'une serviette en papier humide et de plaques de culture cellulaire permet une application sur le terrain.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figure 3 : Diapositives représentatives des inclusions virales positives de la rage avec une intensité de 4 et une distribution d'antigènes no 4. (A et B) montrent des inclusions virales positives de rage au grossissement 200x. (C et D) montrent des inclusions virales positives de rage au grossissement 400x. Barres d'échelle de 5 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figure 4 : Diapositives représentatives d'échantillons négatifs sans inclusionviralede la rage . (A et B) montrent des échantillons négatifs pour les inclusions virales de rage au grossissement 200x. (C et D) montrent des échantillons négatifs pour les inclusions virales de rage au grossissement 400x. Barres d'échelle de 5 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figure 5 : Photographies représentatives des installations d'essai DRIT utilisées par USDA WS. (A) Installation d'essai mobile dans une remorque fermée pour le transport. (B) Véhicule récréatif modernisé pour les essais DRIT. (C) installation d'essai DRIT en collaboration avec le laboratoire universitaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Surveillance accrue de la rage à l'aide d'un test immunohistochimique rapide direct

Le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) offre une alternative reconnue par l'Organisation mondiale de la santé animale et de l'Organisation mondiale de la santé (OIE/OMS) au test direct d'anticorps fluorescents (DFA) pour le diagnostic de la rage. Ce test permet des applications sur le terrain qui peuvent être effectuées en environ 1 h sur les impressions cérébrales à l'aide de la microscopie légère.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Le DRIT est important parce qu’il fournit un test de diagnostic de la rage qui peut être effectué dans des laboratoires décentralisés sur le terrain ou dans des zones sans accès systématique à la microscopie électronique. Le principal avantage du DRIT est qu’il n’utilise qu’une simple microscopie légère et que les résultats peuvent être obtenus en environ une heure. Le DRIT fournit un puissant outil économique pour le diagnostic de la rage qui peut être utilisé par les travailleurs et les biologistes de terrain pour améliorer les programmes de surveillance, de prévention et de lutte contre la rage à l’échelle mondiale.Pour les animaux fraîchement recueillis ou décongelés à température ambiante, placez l’animal supiné sur une surface plane avec la colonne cervicale légèrement tournée vers l’examinateur. Palpate pour identifier l’articulation atlanto-occipital sur l’aspect latéral de la colonne cervicale. À l’aide d’une lame de scalpel, faire une incision au niveau de l’articulation atlanto-occipitale à l’aspect ventral de coupe à travers toutes les couches de muscle et de tissus mous, y compris la trachée et l’œsophage.Continuer jusqu’à ce que l’aspect antérieur des vertèbres cervicales de la colonne vertébrale se approche. Déplacez ensuite la tête de l’animal dans une extension de la plage d’extrémité jusqu’à ce que le tronc cérébral soit visible. Utilisez une lame de scalpel pour enlever tous les tissus visibles du tronc cérébral et du système nerveux central pour l’échantillon.Placez les échantillons de tronc cérébral dans un contenant incassable et étiquetez-les en conséquence. Tout d’abord, entacher les plats suffisamment profonds pour permettre l’immersion complète d’un échantillon de diapositives. Remplir le plat un de formaline tamponnée à 10 % de phosphate.Remplissez les plats deux, quatre et cinq de TPBS. Remplissez le plat trois de peroxyde d’hydrogène à 3 %. Remplissez ensuite les plats six, huit, neuf et dix avec de l’eau distillée ou déionisée.Remplissez le plat sept avec la formulation d’hématoxyline numéro deux de Gill diluée dans un rapport de 1:1 avec de l’eau distillée. Pour préparer la solution de stock d’amino-éthyl-carbazole, à l’aide d’une pipette en verre, placez cinq millilitres de N, N-diméthylformamide dans un récipient en verre. Ajouter un comprimé de 120 milligrammes de 3-amino-9-éthylcarbazole au récipient en verre et secouer jusqu’à dissolution complète.Pour préparer la dilution de travail de l’AEC, ajoutez sept millilitres de tampon d’acétate à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Utilisez une pipette en verre pour ajouter 0,5 millilitres de solution de stock AEC au tube de centrifugeuse. Ajouter 0,75 millilitres de solution de peroxyde d’hydrogène à 3 %.Utilisez une seringue de 10 millilitres avec un filtre à seringues de 0,45 micromètre pour filtrer la solution. Pour commencer, utilisez un marqueur d’encre permanent étanche à l’épreuve du frottis pour étiqueter les diapositives au microscope en verre avec un numéro unique pour chaque spécimen. Utilisez une lame de scalpel pour enlever le tronc cérébral du récipient et le placer sur une serviette en papier.Utilisez une deuxième serviette en papier pour éponger doucement tout excès de liquide, de sang ou de fourrure pour révéler seulement le tissu du tronc cérébral. Au besoin, sectionnez le tissu du tronc cérébral pour révéler une section transversale. Touchez très doucement la lame du microscope à plusieurs points du tronc cérébral sans mouvement latéral pour permettre de transférer plusieurs zones de tronc cérébral à la diapositive en s’assurant que seulement une ou deux couches de cellules sont transférées du tissu cérébral à la lame.Laisser sécher l’air pendant environ cinq minutes à température ambiante. Puis immerger les diapositives dans la formaline tamponnée à 10% dans le plat un pendant 10 minutes. Retirez les glissières de la formaline et trempez-les rincer dans la solution TPBS dans le deuxième plat.Immerger les glissières rincées dans la solution de peroxyde d’hydrogène contenue dans le plat trois pendant 10 minutes. Après cela, retirez les glissières du peroxyde d’hydrogène et trempez-les rincer dans le TPBS frais contenu dans le plat quatre. Après avoir enlevé tout excès de peroxyde d’hydrogène, placez les glissières dans le TPBS frais contenu dans le plat cinq.Prenez les diapositives une à la fois à partir du plat cinq, secouer et éponger tout tampon excédentaire et placer la diapositive sur une serviette en papier humidifié sur le banc de laboratoire. Lorsque toutes les diapositives ont été transférées, utilisez un dropper ou une pipette pour déposer suffisamment d’anticorps antirabiques primaires sur chaque glissière pour couvrir le tissu du SNC. Couvrir les glissières de plaques de puits ou d’un autre couvercle simple pour créer une chambre d’humidité et incuber les glissières à température ambiante dans la chambre pendant 10 minutes.Après cela, retirez les glissières de la chambre d’humidité, secouez et épongez tout excès conjugué et trempez les glissières dans le TPBS dans le plat cinq. En travaillant avec une diapositive à la fois, retirez une glissière du TPBS et utilisez un dropper ou une pipette pour laisser tomber suffisamment de peroxidase streptavidine complexe pour couvrir le tissu du SNC. Une fois que toutes les glissières ont été couvertes, incubez-les dans la chambre d’humidité pendant 10 minutes à température ambiante.Retirez ensuite les glissières de la chambre d’humidité, secouez et épongez tout excès complexe et trempez les glissières dans le TPBS contenu dans le plat cinq. En travaillant avec une diapositive à la fois, retirez une glissière du TPBS et utilisez une pipette pour laisser tomber suffisamment de solution de travail AEC pour couvrir les tissus du SNC. Incuber les glissières dans la chambre d’humidité pendant 10 minutes à température ambiante.Après cela, tremper rincer les diapositives dans l’eau distillée contenue dans le plat six et les placer dans un contre-tache d’hématoxyline de Gill dans le plat sept pendant deux minutes. Tremper immédiatement rincer toutes les diapositives dans l’eau distillée dans le plat huit. Répétez cette répéter deux fois en utilisant l’eau douce dans les plats neuf et 10 pour chaque lavage.En travaillant une diapositive à la fois, retirez une glissade de l’eau et secouez et épongez tout excès d’eau. Utilisez un support soluble dans l’eau pour apposer un couvercle sur la lame. Ensuite, utilisez un microscope léger avec un objectif 20X pour voir les diapositives.Les résultats positifs du DRIT montrent des inclusions virales intracytoplasmiques rouges qui peuvent varier dans la forme et la taille dans le cytoplasme des corps de cellules bleuâtres. Les inclusions semblent lisses avec des marges très brillantes et une zone centrale moins intensément tachée. La distribution d’antigène est classée de plus quatre à plus un avec plus quatre représentant la distribution d’antigène comprenant une abondance de grandes et petites inclusions variant dans la taille et la forme et présentes dans chaque champ de vision dans l’impression de contact de tissu de CNS.Une répartition de plus trois est attribuée lorsqu’il y a des inclusions dans une variété de tailles dans la plupart, mais pas dans tous les champs de vision. Si des inclusions sont trouvées dans 10 à 50% des champs de microscope, une distribution plus deux d’antigène est assignée tandis que plus un est assigné quand des inclusions sont trouvées dans moins de 10% des champs. La plupart des tissus du SNC présentant le virus de la rage présentent des inclusions virales typiques classées comme plus trois ou plus quatre intensité et distribution d’antigène.Si les résultats indiquent un plus un ou plus deux dans la distribution de l’intensité ou de l’antigène, l’échantillon est déclaré indéterminé et des tests répétés sont justifiés. Un échantillon d’essai utilisant le DRIT est considéré négatif pour les antigènes de virus de rage après que la glissière contenant le tissu de CNS soit scannée à un grossissement de 200X ou plus et aucune inclusion typique de virus n’est détectée. Les échantillons négatifs présentent des corps de cellules bleuâtres avec peu ou pas de taches spécifiques connues.Chaque personne effectuant des tests diagnostiques de la rage devrait recevoir des vaccins standard contre la rage avant l’exposition et subir une évaluation régulière des anticorps sérologiques. Les personnes non immunisées ne devraient pas entrer dans les zones où de tels travaux sont effectués. En plus des précautions prises lors du travail avec le virus de la rage vivante, plusieurs des réachagents utilisés dans le test sont dangereux.Consultez les fiches de données de sécurité pour chaque reagent.

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