Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

אנו מכירים את כל אנשי משרד החקלאות שירותי חיות הבר שאספו בעבר דגימות מעקב משופרות כלבת וניהלו את ה-DRIT לאבחון כלבת. כמו כן, אנו מכירים את הפעילים הרבים העוזרים לנו באוסף מעקב משופר עם כלבת. אנו מודים גם למרכזים לבקרת מחלות ומניעתן ולמכון וויסטאר לגישה לריאגנטים קריטי הנדרש לבצע את ה-DRIT ולספק הזדמנויות הכשרה. בנוסף, אנו מעריכים את האבחון הconfirmatory והסיוע הטכני המסופקים על-ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ועל ידי מרכז וודסוורת ' עם משרד הבריאות של מדינת ניו יורק. השימוש במוצרים מסחריים מיועד למטרות השוואה בלבד ואינו מהווה תמיכה.

כל אדם המבצע בדיקות אבחון כלבת צריך לקבל סדרת חיסון טרום חשיפה לכלבת כלבת ולעבור הערכת נוגדנים שוטפת לאבחון, עם החיסון המאיץ לפי הצורך. אנשים שאינם מחיסונים לא צריכים להיכנס למעבדות או אזורים שבהם עבודה כזאת מתנהלת. כל מניפולציה של רקמות ושקופיות צריך להתבצע כדי לא ניקה נוזלים או לייצר חלקיקים מוטס. בגדי מנדפים אינם נדרשים, אך בזמן האפשרי הם יכולים לספק הגנה נוספת מפני ריחות, ectop, ושברי עצמות. מינימום ציוד מגן אישי, כולל כפפות והגנה על העין, יש לענוד בכל עת במהלך איסוף ובדיקות לדוגמה.
1. איסוף גזע המוח
<ol><li>לאסוף דגימות המוח או מיד על אוסף גווייה או לוודא כי הגוויות ממוקמות מקפיאים לאחסון עד בדיקות מאוחרות יותר. אם הגוויות של בעלי חיים קפואות, הפשרת בטמפרטורת הסביבה לפני איסוף המוח בשביל להקל על האיסוף. בנסיבות מסוימות, הדגימות נאספים ישירות מחיה קפואה.</li>
	<li>
עבור בעלי חיים שנאספו טרי או שהיו מופשרים לטמפרטורת הסביבה, מיקום החיה פרקדן על משטח שטוח עם עמוד השדרה הצווארי מעט מסובב לכיוון הבוחן. על ההיבט הצדדי. של עמוד השדרה הצווארי
	<ol>
<li>לגוויות שעדיין קפואות לחלוטין, הציבו את מיקום החיה כמתואר לעיל, אם מעשי. השתמש מסורים, סכינים, מזמרה עצם או ציוד דומה כדי להפריד לחלוטין את הראש מהגוף. הערה: כל הציוד שבשימוש אינו צריך להתנקות ביסודיות בין דגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות להב אזמל, לעשות חתך ברמה של מפרק atlanto-העורף על ההיבט הגחוני, חיתוך דרך כל השכבות של השריר ורקמות רכות, כולל קנה הנשימה ואת הוושט. המשך עד שהוא מקורב להיבט הקדמי של חוליות עמוד השדרה הצווארי. עבור רקמה קפואה, השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל השכבות הנותרות של רקמת השריר והרקמה הרכה כדי לחשוף את מגנום foramen.</li>
	<li>הזיזו את ראשו של בעל החיים לשלוחה של טווח הסיום עד שגבעול המוח יהיה גלוי. השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל המוח נראה לעין/מערכת העצבים המרכזית (CN) רקמות לדיגום. לדוגמה קפואה, השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את החלק הגדול מרקמת המוח הקפואה והפנימית ככל האפשר מתוך הגולגולת.</li>
	<li>מניחים את דגימות המוח במיכל בלתי שביר (כלומר, משחה מתכת פח, בקבוקון ההקפאה, וכו ') ותווית בהתאם.</li>
	<li>ודא כי דגימות גזע המוח נבדקים מיד לאחר איסוף באמצעות מבחן DRIT, קירור (4 ° c) עד 24 שעות לפני בדיקה, או קפוא (-20 ° c) עד הזמן של בדיקה אם הבדיקה יתקיים יותר מ 24 שעות לאחר איסוף המדגם.</li>
</ol>2. הכנת חומרים ל-DRIT
<ol><li>
הגדרת 10 מנות מכתים שקופיות (איור 1) הערה: צביעת מנות עמוקים מספיק כדי לאפשר טבילה מלאה של שקופית (קוטר 96 מ"מ, גובה 72 מ"מ, עומק 42 מ"מ, נפח 250 mL). מיכל בן 6<ol>
<li>מילוי מנה 1 עם באגירה 10% פוספט. החלף את פורמלין לאחר הפעלת שני מבחנים או שבועי.</li>
		<li>מילוי מנות 2, 4, ו 5 עם מלוחים באגירה פוספט עם 1% רצף-80 (TPBS). החלף עם TPBS טרי לפני כל בדיקה.</li>
		<li>. מילוי צלחת 3 עם 3% חמצן מימן . תחליף מי חמצן לפני כל בדיקה</li>
		<li>ממלאים את הכלים 6, 8, 9, ו -10 עם מים מזוקקים או מוהים. להחליף מים לפני כל בדיקה.</li>
		<li>מילוי צלחת 7 עם הניסוח זימים המטאוקסילין2 מדולל ביחס 1:1 במים מזוקקים6. החלף את המטאוקסילין לאחר הפעלת 2 בדיקות או שבועי. הערה: על פי פרוטוקול DRIT המקורי שפותחה על ידי ה-CDC12, יחס 1:2 של זימים המטאוקסילין למים ניתן להשתמש אם כתמים הנגד הוא כהה מדי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת פתרון מניות של אמינו-אתילקרזולה (AEC)
	<ol>
<li>באמצעות פיפטה זכוכית, מקום 5 מ ל של N, N-diמתילפימיד במיכל זכוכית.</li>
		<li>להוסיף 1 20 mg לוח של 3-אמינו -9-ethylcarבזולה ולנער עד התפרקה לחלוטין. סמן את הצנצנת באמצעות "AEC stock" ואת התאריך שבו ביצע המניה. הערה: פתרון מניות AEC ניתן לאחסן תחת קירור (4 ° c) ומשמש 1-2 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת דילול העבודה של AEC
	<ol>
<li>הוסף 7 מ ל של מאגר אצטט ל 15 מ ל זונדה צנטריפוגה.</li>
		<li>באמצעות פיפטה זכוכית, להוסיף 0.5 mL של פתרון מניות AEC לשפופרת צנטריפוגה.</li>
		<li>הוסף 0.075 mL של 3% חמצן מימן לצינור.</li>
		<li>לסנן את הפתרון עם מזרק 10 מ ל באמצעות פילטר מזרק 0.45 יקרומטר. הערה: דילול העבודה AEC יש ליצור רק לפני כל מבחן DRIT כפי שהוא יציב רק עבור 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. בדיקת אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה
<ol><li>
תווית מיקרוסקופ זכוכית שקופיות עם מספר ייחודי עבור כל דגימה באמצעות הכתם הוכחה, עמיד למים, סמן דיו קבוע.
	<ol>
<li>באמצעות להב אזמל, להסיר את גזע המוח מן המיכל ומניחים על מגבת נייר. בעדינות למחוק את כל עודף של נוזל, דם, או פרווה עם מגבת נייר שנייה כדי לחשוף רק את רקמת גזע המוח13. במקרה הצורך, החלק את רקמת המוח כדי לחשוף חתך רוחב.</li>
		<li>גע בעדינות מאוד את שקופית המיקרוסקופ לחתך הצלב של רקמת גזע המוח. לגעת בשקופית כדי המוח בנקודות מספר ללא תנועה לרוחב כדי לאפשר אזורים מרובים של גזע המוח להיות מועברים שקופית13. ודא שרק 1 או 2 שכבות של תאים מועברים מרקמת המוח לשקופית בנגיעה עדינה. אין צורך בסוכן לצרף את רקמת המוח לשקופיות. כלול הן שליטה חיובית ושלילית בכל הפעלה של DRIT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תנו לשקופיות להתייבש באוויר במשך כ -5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הישאב את השקופיות ב-10% במאגר האגירה עבור 10 דקות (מנה 1).</li>
	<li>הסר את השקופיות מפורמאלין וטבול-שטוף בתמיסה של TPBS (מנה 2).</li>
	<li>לטבול את השקופיות 3% חמצן מימן עבור 10 דקות (צלחת 3).</li>
	<li>הסר את השקופיות מתחמוצת המימן ושטוף מטבל ב TPBS טרי (צלחת 4). לאחר הסרת חמצן עודף מימן, למקם את השקופיות TPBS טרי (צלחת 5) ולעבוד עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד השקופיות האחרות להישאר שקוע ב TPBS.</li>
	<li>קח את השקופיות מ TPBS (מנה 5) אחד בכל פעם, להתנער ולמחוק מאגר עודף, ולהניח על מגבת נייר לחלח על ספסל במעבדה, כבסיס של "חדר לחות". באמצעות הפיפטה, ירידה מספיק נוגדן וירוס הראשי נגד כלבת על כל שקופית כדי לכסות את רקמת ה-CN. הנחת השקופיות למשך 10 דקות בחדר הלחות (כלומר, כיסוי שקופיות עם לוחות היטב או כיסוי פשוט אחר בזמן שהם מונחים על מגבת נייר הרטובה) בטמפרטורת החדר (איור 2).</li>
	<li>הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומלא את העודף המשלים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (שימוש חוזר באותו TPBS במנה 5).</li>
	<li>עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים ב-TPBS-משתמשים בפיפטה כדי להוריד מספיק streptavidin-peroxidase קומפלקס כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומחק את מורכבות העודפים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (מנה 5).</li>
	<li>עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, לנער ולמחוק מאגר עודף, בעוד אחרים נשארים שקוע TPBS-להשתמש בצנרת כדי להוריד מספיק AEC (הכנה מוסבר לעיל ויש לעשות מיד לפני השימוש) כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מטבל-לשטוף את השקופיות במים מזוקקים (צלחת 6).</li>
	<li>מניחים את השקופיות בכתם נגד של זימים המטאוקסילין (מדולל 1:1 עם מים מזוקקים) עבור 2 דקות (צלחת 7).</li>
	<li>לשטוף מיד לטבול את כל השקופיות מים מזוקקים (צלחת 8). חזרו פעמיים עם מים מתוקים בכל פעם (מנות 9 ו -10).</li>
	<li>עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים במים מזוקקים (מנה 10) — מטלטל ומוריד את המים העודפים ומשתמשים במדיום מסיסים במים כדי לצרף שובר כיסוי.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרה 20x כדי להציג את השקופיות ואת המטרה 40x אם הבדיקה הקרובה נחוצה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

DRIT היא שיטה גמישה המתאימה מבוסס שדה מעקב כדי לזהות את הנוכחות של וירוס כלבת כי ניתן להשתמש באזורי מעבדה מבוזרים. אמנם ניתן לבצע את הבדיקה כולה בהגדרה מבוססת שדה כגון על החלל הפנימי של משאית, זה אידיאלי יש מקום קטן, מקורה מוקדש DRIT בשל כימיקלים, ציוד אחסון בעיות האספקה. בנוסף, הקפדה על כל החוקים הפדרליים, המדינה והמקומיים, והתקנות לשימוש כימי ולסילוק החומרים חייבים להיחשב. כיום, משרד החקלאות האמריקנית מציע 15 מתקני DRIT כדי לבדוק דגימות מ -17 מדינות. מתקני משרד החקלאות הלאומית drit הוקמו בשיתוף עם האוניברסיטה ומעבדות בריאות הציבור המדיני, בחדרים מיועדים בתוך מתקנים גדולים ובטריילרים סגורים כי כבר הפכו והומרו לשמש יחידות בדיקה ניידות ב אירוע של תגובת התפרצות חירום שבה בדיקה משופרת של מעקב אחר כלבת עם זמן הטיפול המיידי הוא קריטי (איור 5).
בעוד הבדיקה הצליחה באמצעות חומר בדיקת גזע של איכות משתנה, רקמת המוח טרי ללא התפרקות רקמות הוא אופטימלי. כמו ריקבון, התייבשות, או ניזול מתרחשת, איכות לדוגמה פוחתת הבדיקה עשויה לגלות מכתים יותר לא ספציפי אשר יכול לבלבל את התוצאות. התבוננות זו דומה בין DFA לבין DRIT2. יש לאסוף את המוח במהירות האפשרית ולאחר מכן לאחסנם מוקפאים (-20 ° c) עד לבדיקה.
בדרך כלל, רוב מתקני משרד החקלאות מ 12 עד 24 שקופיות בבת אחת במהלך הפעלת DRIT, כולל אחד שליטה חיובית ושליטה אחת שלילית כי אושרו באמצעות DFA. פקדים חיוביים ושליליים מספקים נקודת התייחסות לכל הפעלה של DRIT כדי לוודא שהבדיקה הצליחה ולאשר אם השאלות המפרטיביות עולות על שקופיות הבדיקה. אם מדגם לא נקבע כתוצאה חיובית ברורה או שלילית, הוא מתויג כקבוע ונבדק פעם שנייה על-ידי DRIT. אם דוגמה זו אינה חיובית ברורה או שלילית לאחר שני בדיקות DRIT, הוא נשלח למעבדת התייחסות DFA או בדיקות קשורות.
כמו בכל מבחן אבחון, ' צרות ירי ' הוא שימושי עם ממצאים בלתי צפויים. לדוגמה, אם הפעלת DRIT אינה מצליחה (כלומר, הפקד החיובי אינו מוצג +3 או + 4 כתמים והפצת אנטיגן), ודאו שכל הכימיקלים והחומרים הכימיים לא פגו. מצאנו באמצעות בקבוק חדש שנפתח של תחמוצת מימן במינימום של פעם בשבוע הוא שימושי כדי לסייע למנוע מכתים לא ספציפיים דרך חמצון של רקמת המוח. בנוסף, אנו ממליצים להחליף מאגר אצטט לפחות פעם אחת בכל שנה לכל הפחות, ללא קשר לתאריך התפוגה של התווית.
ישנם מספר יתרונות של DRIT על DFA כולל עלויות נמוכות יותר, היכולת לבצע את הבדיקה מחוץ למעבדה מרכזית, צורך רק מיקרוסקופ אור במקום מיקרוסקופ פלורסנט, ואת תהליך האימונים פשוט יחסית עבור אנשים מנהל וקורא. את המבחן2,3,4 יתרונות אלה, ביחד עם רגישות וספציפיות של drit הדומות dfa2,7,8,9 כבר הוכיחו כי הבדיקה משמש כלי חשוב בקנה מידה רחב תוכניות מעקב משופרות כלבת8,10 בצפון אמריקה. בנוסף, DRIT יש פוטנציאל לאפשר מעקב מוגבר ובדיקות יותר בקשה במדינות מתפתחות או אזורים אחרים עם משאבים מוגבלים, במיוחד לאחר OIE האחרונות/מי הדרכה כמבחן מומלץ.

בעוד dfa הוא המבחן הנפוץ ביותר עבור אבחון כלבת שגרתית1, העלות של רכישת ושמירה על מיקרוסקופ פלורסנט יכול להיות מגביל למדינות מתפתחות2,3,4 ועבור רחבה, תוכניות מעקב משופרות בקנה מידה גדול של כלבת3,4. בנוסף, DFA דורש את היכולת להכניס דגימות למקרר במהלך קיבעון לבין הדגימות דגירה מעל טמפרטורת הסביבה במהלך התגובות נוגדנים-אנטיגן, אשר יכול להיות משוכה משמעותית במדינות ללא תשתית מתאימה. בהתאם למגבלות הקשורות לבדיקות DFA מודרניות, ההשפעה הגלובלית של כלבת כבר מזמן לא העריכו את5.
בהקשר זה, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת ברחבי העולם, בעיקר במדינות מתפתחות. פרוטוקול DRIT המוצג כאן מציע חלופה בדיקה מעבדה או מבוססת על שדה DFA המשתמשת מיקרוסקופ אור אינו דורש קירור או מעבדה דגירה במהלך המבחן6. ה-DRIT ו-DFA דומים בכך ששתי הטכניקות משתמשות בטביעות מגע של דגימות מוח שנאספו מחיות שעשויות להיות בעלי כלבת-נגוע. עם זאת, השלב הראשון של ה-DRIT משתמש בפורמאלין כקיבעון היסטורי לדגימות, המבטלת את נגיף הכלבת. זה מספק שיפור ביולוגי משמעותי על האצטון המשמש כדי לתקן דגימות בפרוטוקול DFA3, אשר חשוב לא רק במעבדה, אבל אולי אפילו יותר בסביבות מעבדה מבוססי שדה או מבוזר. עד היום, drit מראה רגישות וספציפיות שווה dfa2,7,8,9.
מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות האמריקאית ביצעה מאמצים משופרים בתחום הכלבת בצפון אמריקה תוך שימוש ב-DRIT כחלק מתוכנית הניהול המקיפה של כלבת החיות10. מעקב משופר כלבת משמש כהשלמה לחשיפה מבוססת על בריאות הציבור מעקב ובדיקות בעיקר חיות מיני-טורף מינים, כולל דביבונים (לוטור לובל), בואשים פסים (מפיטיס מפיטיס), שועלים אפורים ( שועלים אדומים (וולפסי), וזאביערבות (כלב לאטטרנס) שלא היו מעורבים בחשיפה אנושית או בעלת חיים במשפחה. גוויות בעלי חיים המשמשות בבדיקות הוגשו לשירות משרד החקלאות באמצעות מאמצי מעקב משופרים וכללה מינים וקטוריים של כלבת שאינם: משחק מסוכן או מוזר; נמצא מת, נהרג כביש או מטרד; ואינם משויכים לחשיפה לבעלי חיים אנושיים או ביתיים. DRIT מספק מבחן אבחון כלבת שיכול להיות מועסק על ידי ביולוגים שדה מאומנים עם ניסיון קטן או לא מעבדה כדי לשפר את הפיקוח על הכלבת ולהפחית את הנטל הפיננסי ואת עומס העבודה של מעבדות אבחון בריאות הציבור10. הכשרה DRIT בסיסית עבור עובדי התחום של משרד החקלאות בדרך כלל לוקח 1.5 כדי 2 ימים, אשר כולל כ 4 h של הוראת כיתה כיסוי עקרונות בסיסיים של biosafety טיחות, שיטות איסוף לדוגמה ואת תהליכי DRIT, כמו גם > 8 h של זמן המעבדה מתנהל במבחן. הזדמנויות הכשרה היו זמינים משרד החקלאות ומפעילי התוכנית דרך המרכזים לבקרת מחלות ומניעה (CDC), LYSSA LLC, ואת המכון Wistar.
בתחומי הניהול האסטרטגי, משרד החקלאות הבין בודק למעלה מ-94,000 דגימות חיות הבר באמצעות DRIT וזיהה יותר מ-1,850 דגימות נגוע בכלבת, כי היה סביר להניח שאינם מזוהים להסתמך רק על חשיפה מבוססת בריאות הציבור של חיות חשוד. מעקב משופר של מידע כלבת שסופקו על-ידי תוצאות DRIT הם קריטיים לספק הזמן מלאה יותר וייצוג מרחבי של כלבת על הנוף לתמיכה של תוכניות חיסון אוראלי לכלבת עבור חיות בר ברחבי ארה ב10, . בסדר, 11 באופן דומה, סוכנויות חיות הבר מחוזי בקנדה שילבו DRIT לתוך קנה מידה גדול כלבת חיות מעקב מאמצי בשילוב עם תוכניות בריאות הציבור שלהם עם הצלחה8. הן משרד החקלאות ותוכניות המעקב הקנדי DRIT השתמשו במעבדות התייחסות לאומיות כדי לאשר כלבת על ידי DFA ולבצע משתנה ויראלי הקלדה כראוי8. יתר על כן, ביולוגים משרד החקלאות לשלוח 10% של דגימות שליליות עבור אישור DFA להפנות מעבדות ומאז 2008, השתתפו בדיקות מיומנות DRIT השנתי שסופקו על ידי המעבדה הממלכתית של ויסקונסין היגיינה, כחלק סטנדרטי אמצעי הבטחת איכות.
מטרת שיטה זו היא להציע גישה חלופית לבדיקות אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות, בתחום, או באזורים ללא גישה שגרתית למיקרוסקופיה אלקטרונית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

מעקב מבוסס מעבדה הוא אינטגרלי עבור מניעת כלבת, שליטה וניהול מאמצים. בעוד DFA הוא תקן זהב לאבחון כלבת, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת, במיוחד במדינות מתפתחות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור ה-DRIT כאפשרות בדיקה חלופית, מעבדה או מבוססת שדה המשתמשת במיקרוסקופ אור לעומת DFA. טביעות מגע של רקמת המוח שנאספו מבעלי חיים חשודים קבועים ב 10% פורמאלין מאגור. The DRIT משתמש וירוס כלבת-שבטיים ספציפי או נוגדנים שבטיים (מצופנים ל biotin), אנזים streptavidin-peroxidase, וכתבת כרומוגן (כגון מרחריל 3-אמינו -9-ethylcarle) כדי לזהות הכללות ויראליות בתוך הרקמה הנגועה. בתוך 1 h, דגימת רקמות המוח ניתן לבחון ולהתפרש על ידי DRIT. הערכה של מוחות בעלי חיים חשוד נבדק מתוך מגוון רחב של מינים בצפון אמריקה, אסיה, אפריקה, ואירופה מומחשים רגישות גבוהה וספציפיות על ידי DRIT מתקרב 100% עם תוצאות לעומת DFA. מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות של מחלקת שירותי בעלי חיים בארה ב ביצעה בקנה מידה גדול של מאמצים משופרים לכלבת באמצעות ה-DRIT כדי לבחון > דגימות שנאספו מחיות בר בתחומי ניהול אסטרטגי של כלבת . ה-DRIT מספק כלי רב עוצמה וחסכוני לאבחון כלבת, שניתן להשתמש בו על ידי מעבדות וביולוגים שדות כדי לשפר את הפיקוח, תוכניות המניעה והבקרה הנוכחיות של הכלבת.

תוצאות חיוביות של DRIT להראות אדום תאיים ויראלי הכללות שיכולות להשתנות בצורה ובגודל (איור 3) בתוך הציטופלסמה של גופים תא כחלחל. ההכללות מופיעות חלקות עם שוליים בהירים מאוד ואזור מרכזי פחות מוכתם באופן אינטנסיבי. העוצמה והתפלגות האנטיגן נרשמים בעת זיהוי הכללות. העוצמה מדורגת מ-+ 4 ל-+ 1. שקופית השליטה החיובית צריכה להיות בעלת ברק מגנטה אינטנסיבי ומבריק, המכונה בעוצמה של +4. אובדן קל של צבע יכול להתרחש במיוחד כאשר טיפול לדוגמה לא היה אופטימלי (כלומר, רקמה לדוגמה יש מפורקת מעט) ואת אלה יש לציון כמו +3. כתם עמום במידה ניכרת מדורגת כמו + 2 כדי + 1, לא נחשב אבחון עבור זיהום וירוס בכלבת והוא מתויג כמו לא מוגדר.
בנוסף, התפלגות אנטיגן מדורגת מ + 4 ל + 1 עם + 4 המייצג התפלגות אנטיגן מורכב שפע של הכללות גדולות וקטנות שונות בגודל וצורה, וההווה בכל שדה (או כמעט כל שדה) של השקפה בתוך רקמת ה-CN . התרשמות ממגע לפקד החיובי יש בדרך כלל התפלגות אנטיגן + 4. התפלגות אנטיגן של +3 תוקצה כאשר יש הכללות במגוון גדלים ברוב התחומים, אך לא בכל תחומי התצוגה. אם נמצאו הכללות ב-10%-50% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן + 2. כאשר נמצאו הכללות ב-< 10% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן +1.
רוב רקמת מערכת החשמל עם נגיף הכלבת נוכח הצגת הכללות ויראליות אופייני מדורגים כמו +3 או +4 התפלגות אנטיגן. אם התוצאות מציינות את האינטנסיביות + 2 או +1 או את התפלגות האנטיגן + 2 או +1, המדגם מוצהר על בדיקת "לא מוגדר" ובדיקה חוזרת מוצדקת. אם לאותה דגימה יש תוצאת בדיקה לא מוגדר, יש לשלוח את המדגם למעבדת ייחוס עבור DFA או בדיקות confirmatory קשורות.
דגימת בדיקה באמצעות DRIT נחשב שלילי עבור אנטיגנים וירוס כלבת לאחר שקופית המכילה את רקמת ה-CN נסרקה בהגדלה של 200X או יותר ואין הכללות וירוסים טיפוסי מזוהים (איור 4). דגימות שליליות מפגינות תאים כחלחלים. עם כתמים קטנים או לא ספציפיים
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> איור 1: ההתקנה של 10 מנות הצביעת השקופית עם ריאגנטים לבדיקה. המנות מסומנות בשם מגיב בסדר הדרוש כדי לעקוב אחר הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> איור 2: חדר לחות פשוט שנוצר עם מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות תא.  תא לחות פשוט באמצעות מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות התא מאפשר יישום מבוסס שדה.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> איור 3: שקופיות הנציג של כלבת הכללות ויראליות חיוביות עם אינטנסיביות 4 ו +4 התפלגות אנטיגן. (A and B) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 200x הגדלה. (C ו -D) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 400 x הגדלה. קנה מידה ברים = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> איור 4: שקופיות מייצגות של דגימות שליליות ללא הכללות ויראליות של כלבת. (A ו- B) מראים דגימות שליליות עבור הכללות ויראליות של כלבת בהגדלה של 200 x. (C ו -D) מראים דגימות שליליות להכללות של כלבת בהגדלה של 400 x. קנה מידה ברים = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> איור 5: תמונות מייצגות של מתקני בדיקות DRIT בשימוש של משרד החקלאות. (א) מתקן בדיקה ניידת בטריילר סגור להובלה. (ב) הרכב בשעות הפנאי הותאם לבדיקת drit. (ג) drit בדיקת מתקן בשיתוף עם מעבדה באוניברסיטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT הוא משמעותי כי הוא מספק בדיקת אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות בתחום או באזורים ללא גישה שגרתית מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון העיקרי של DRIT הוא שהוא משתמש רק מיקרוסקופ אור פשוט ואת התוצאות ניתן להשיג בתוך כשעה. DRIT מספק כלי חסכוני רב עוצמה לאבחון כלבת שיכול לשמש מעבדות וביולוגים שדה כדי לשפר את תוכניות מעקב כלבת, מניעה ובקרה ברחבי העולם.עבור בעלי חיים שנאספו זה טרי או הפשיר לטמפרטורת הסביבה, למקם את החיה supine על משטח שטוח עם עמוד השדרה הצווארי מעט מסובבים לכיוון הבוחן. Palpate כדי לזהות את המפרק אטנטו-העורף על ההיבט רוחבי של עמוד השדרה הצווארי. באמצעות להב אזמל, לעשות חתך ברמה של מפרק אטנטו עורפית בהיבט הגחוני חיתוך דרך כל השכבות של שריר ורקמות רכות כולל קנה הנשימה והוושט.ממשיכים עד המשוער את ההיבט הקדמי של חוליות עמוד השדרה הצווארי. לאחר מכן הזז את ראש החיה להארכת טווח קצה עד שגזע המוח יהיה גלוי. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את כל גזע המוח הנראה ואת רקמת מערכת העצבים המרכזית לדגימה.מניחים את דגימות גזע המוח במיכל בלתי שביר ומתייגים בהתאם. ראשית, להגדיר מנות מכתים כי הם עמוקים מספיק כדי לאפשר טבילה מלאה של שקופית מדגם. ממלאים את המנה עם 10% פוספט אוגר פורמלין.מלאו כלים 2, 4 ו-5 ב-TPBS. ממלאים את המנה השלישית במי חמצן 3%. ואז למלא מנות שש, שמונה, תשע ו -10 עם מים מזוקקים או deionized.מלאו את צלחת 7 בניסוח המטוקסילין מספר שתיים של גיל מדולל ביחס של 1:1 עם מים מזוקקים. כדי להכין את פתרון מלאי האמינו-אתיל-קרבזול, באמצעות פיפטה זכוכית, מניחים חמישה מיליליטר של N, N-dimethylformamide במיכל זכוכית. מוסיפים 120 מיליגרם טבליה של 3-אמינו-9-אתילקרבזול למיכל הזכוכית ומנערים עד להמסה מוחלטת.כדי להכין את דילול העבודה AEC, להוסיף שבעה מיליליטר של חיץ אצטט לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. השתמש פיפטה זכוכית להוסיף 0.5 מיליליטר של פתרון מלאי AEC לצינור צנטריפוגה. הוסף 0.75 מיליליטר של 3%פתרון מי חמצן.השתמש במזרק 10 מיליליטר עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 כדי לסנן את הפתרון. כדי להתחיל, השתמש בסמן דיו קבוע עמיד בפני מים כדי לסמן שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם מספר ייחודי עבור כל דגימה. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את גזע המוח מן המיכל ומניחים אותו על מגבת נייר.השתמש במגבת נייר שנייה כדי למחוק בעדינות כל נוזל עודף, דם או פרווה כדי לחשוף רק את רקמת גזע המוח. במידת הצורך, חתך את רקמת גזע המוח כדי לחשוף חתך רוחב. מאוד בעדינות לגעת בשקופית מיקרוסקופ למספר נקודות של גזע המוח ללא תנועה משנית כדי לאפשר אזורים מרובים של גזע המוח להיות מועבר לשקופית לוודא כי רק שכבות אחד או שניים של תאים מועברים מרמת המוח לשקופית.תן לשקופיות להתייבש באוויר במשך כחמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לטבול את השקופיות בפורמלין 10%buffered בצלחת אחת במשך 10 דקות. מוציאים את השקופיות מהפורמלין וטובלים אותן בתסכול TPBS במנה 2.לטבול את השקופיות שטף בתסתר מי חמצן הכלול בצלחת שלוש במשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את השקופיות מן מי חמצן לטבול לשטוף אותם TPBS טרי הכלול בצלחת ארבע. לאחר הסרת מי חמצן עודף, מניחים את השקופיות ב- TPBS הטרי הכלול בצלחת חמש.קח את המגלשות אחת בכל פעם מהמנה החמישית, לנער ולנפח כל חיץ עודף ומניחים את המגלשה על מגבת נייר לחה על ספסל המעבדה. כאשר כל השקופיות הועברו, להשתמש טפטף או פיפטה לרדת מספיק נוגדן וירוס אנטי כלבת העיקרי על כל שקופית כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. מכסים את השקופיות עם צלחות היטב או כיסוי פשוט אחר כדי ליצור תא לחות להידגר את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא במשך 10 דקות.לאחר מכן, להסיר את השקופיות תא הלחות, לנער ולמחתוך את כל תריס עודף לטבול לשטוף את השקופיות ב- TPBS בצלחת חמש. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, להסיר שקופית מן TPBS ולהשתמש טפטף או פיפטה לרדת מספיק סטרפטבידין peroxidase מורכבים כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. לאחר שכל המגלשות כוסו, הדגירה אותם בתא הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן להסיר את השקופיות מן תא הלחות, לנער ולמחום את כל קומפלקס עודף לטבול לשטוף את השקופיות ב- TPBS הכלול בצלחת חמש. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, להסיר שקופית מן TPBS ולהשתמש פיפטה כדי להפיל מספיק פתרון עבודה AEC כדי לכסות את רקמת מערכת העצבים המרכזית. הדגירה את המגלשות בתא הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, טובלים את המגלשות במים המזוקקים הכלולים בצלחת 6 ומ מניחים אותן במתנה נגדית של המטוקסילין של גיל בצלחת שבע במשך שתי דקות. מיד לטבול לשטוף את כל המגלשות במים מזוקקים בצלחת שמונה. חזור על זה פעמיים באמצעות מים מתוקים במנות תשע ו 10 עבור כל לשטוף.עבודה מגלשה אחת בכל פעם, להסיר מגלשה מהמים לנער ול כתם את כל המים העודפים. השתמש במדיום הרכבה מסיס במים כדי להדביק כיסוי למגלשה. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרה של פי 20 כדי להציג את השקופיות.תוצאות חיוביות של DRIT להראות תכלילים ויראליים intracytoplasmic אדום שיכולים להשתנות בצורה ובגודל בתוך הציטופלסמה של גופי התא כוויה. התכלילים נראים חלקים עם שוליים בהירים מאוד ואזור מרכזי מוכתם פחות אינטנסיבי. התפלגות האנטיגן מדורגת מתוך פלוס ארבע פלוס אחד עם פלוס ארבעה המייצגים התפלגות אנטיגן המורכבת משפע של תכלילים גדולים וקטנים המשתנים בגודל ובצורה ונרשמים בכל תחום תצוגה בתוך הרושם של מגע רקמת מערכת העצבים המרכזית.חלוקה של פלוס שלוש מוקצית כאשר יש הכללות במגוון גדלים ברוב שדות התצוגה אך לא בכל שדות התצוגה. אם נמצאו הכללות ב- 10 עד 50% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן פלוס שתיים כאשר אחת מוקצית כאשר הכללות נמצאות בפחות מ- 10% מהשדות. רוב רקמות CNS עם וירוס כלבת להציג תכלילים ויראליים טיפוסי מדורגים פלוס שלוש או פלוס ארבע אינטנסיביות והפצה אנטיגן.אם התוצאות מצביעות על פלוס אחד או שניים בעוצמה או בהפצת אנטיגן, המדגם מוכרז כבדיקה לא מוגדרת ויש אחריות לבדיקה חוזרת. מדגם בדיקה באמצעות DRIT נחשב שלילי עבור אנטיגנים וירוס כלבת לאחר השקופית המכילה את רקמת מערכת העצבים המרכזית נסרק בהגדלה של 200X או יותר ולא תכלילים וירוס טיפוסי מזוהים. דגימות שליליות מפגינות גופי תאים כוהנים עם מעט או ללא כתמים ספציפיים ידועים.כל אדם המבצע בדיקות אבחון כלבת צריך לקבל חיסונים סטנדרטיים לפני החשיפה לכלבת ולעבור הערכת נוגדנים סרולוגית קבועה. אנשים לא מחוסנים לא צריכים להיכנס לאזורים שבהם מתבצעת עבודה כזו. בנוסף לאמצעי הזהירות שננקטו בעת עבודה עם וירוס כלבת חי, כמה מהריגטים המשמשים בבדיקה מסוכנים.עיין גליונות נתוני הבטיחות עבור כל reagent.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...