Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Vi anerkjenne alle USDA Wildlife tjenestene stab hvem aktuelle eller ha tidligere avhentet forsterket rabiat overvåking eksemplar og ha gjennomført det DRIT for rabiat diagnosis. Likeledes erkjenner vi de mange cooperators som hjelper oss med Enhanced rabies overvåkning samling. Vi takker også Centers for sykdom kontroll og forebygging og The Wistar Institute for tilgang til kritiske reagenser som kreves for å gjennomføre DRIT og for å gi opplæring muligheter. I tillegg setter vi pris på bekreftende diagnostikk og teknisk assistanse fra sentrene for Disease Control og Prevention og av Wadsworth Center med New York State Department of Health. Bruk av kommersielle produkter er kun til sammenligningsformål og utgjør ikke tilslutning.

Hver personen gjennomfører rabiat Diagnostic tester burde få en målestokk pre-avsøring rabiat vaksinasjon serien og gjennomgå stamgjest serologisk antistoff bedømmelse, med økte immunizations idet behøvde. Unimmunized individer bør ikke gå inn i laboratorier eller områder hvor slikt arbeid gjennomføres. All manipulering av vev og slides bør gjennomføres for å ikke aerosolize væsker eller produsere luftbårne partikler. Røyk hetter er ikke nødvendig, men når det er mulig kan de gi ekstra beskyttelse mot lukt, ektoparasitter, og bein fragmenter. Minimum personlig verneutstyr, inkludert hansker og øyebeskyttelse, bør brukes til enhver tid under prøvetaking og testing.
1. hjernestammen samling
<ol><li>Samle hjernestammen prøver enten umiddelbart etter stamme oppsamling eller Sørg for at skrotter er plassert i frysere for lagring inntil senere testing. Hvis dyret skrotter er frosset, tine ved omgivelsestemperatur før hjernestammen samling for enkel innsamling. Under noen omstendigheter, er prøvene samlet direkte fra et frosset dyr.</li>
	<li>
For dyr som er fersk samlet eller har blitt tint til omgivelsestemperatur, posisjon dyret liggende på et flatt underlag med cervical ryggraden litt rotert mot sensor. Palpate å identifisere det atlanto-occipital leddet på lateral aspektet av livmorhalsen ryggraden.
	<ol>
<li>For skrotter som fortsatt er helt frosset, plasser dyret liggende som beskrevet ovenfor, hvis det er praktisk. Bruk sager, kniver, bein sakser eller lignende utstyr for å helt skille hodet fra kroppen. Merk: Alt utstyr som brukes som ikke er engangsbruk bør rengjøres grundig mellom prøvene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved hjelp av en skalpell blad, gjør et snitt på nivået av atlanto-occipital ledd ved ventrale aspekt, skjære gjennom alle lag av muskel og bløtvev, inkludert luftrøret og spiserøret. Fortsett til tilnærme fremre del av ryggraden i livmorhalsen. For frosset vev, bruk en skalpell blad for å fjerne eventuelle gjenværende lag av muskel og bløtvev for å avdekke foramen Magnum.</li>
	<li>Flytt hodet av dyret til ende-Range forlengelse til hjernestammen er synlig. Bruk et skalpell blad for å fjerne alle synlige hjernestammen-/sentralnervesystemet (CNS)-vev for prøvetaking. For en frossen prøve, bruk en skalpell blad for å fjerne så mye av den frosne hjernestammen/CNS vev som mulig fra innsiden av skallen.</li>
	<li>Plasser hjernestammen prøvene i en uknuselige beholder (dvs. metall salve tinn, fryse-hetteglass osv.) og etiketten tilsvarende.</li>
	<li>Sørg for at hjernestammen prøvene testes umiddelbart etter oppsamling via DRIT-testen, nedkjølt (4 ° c) i opptil 24 timer før testing, eller frosset (-20 ° c) til tiden for testing hvis testingen vil foregå mer enn 24 timer etter prøvetaking.</li>
</ol>2. utarbeidelse av materialer for DRIT
<ol><li>
Oppsett av 10 farge retter for lysbilder (figur 1) Merk: Farging retter er dypt nok til å tillate fullstendig nedsenking av Slide (diameter 96 mm, høyde 72 mm, dybde 42 mm, volum 250 mL). 6 andre priser<ol>
<li>Fyll fatet 1 med 10% fosfat-bufret formalin. Erstatt formalin etter 2 testkjøringer eller ukentlig.</li>
		<li>Fyll rettene 2, 4 og 5 med fosfat-bufret saltvann med 1% mellom-80 (TPBS). Erstatt med frisk TPBS før hver test.</li>
		<li>Fyll parabolen 3 med 3% hydrogen peroxide. Erstatt hydrogen peroxide før hver test.</li>
		<li>Fyll rettene 6, 8, 9 og 10 med destillert eller deionisert vann. Skift ut vann før hver test.</li>
		<li>Fyll parabolen 7 med gjellene hematoksylin formulering #2 fortynnet i en 1:1 ratio i destillert vann6. Erstatt hematoksylin etter 2 testkjøringer eller ukentlig. Merk: Ifølge den opprinnelige DRIT protokollen utviklet av CDC12, en 1:2 forholdet gjellene hematoksylin til vann kan brukes hvis counterstaining er for mørkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utarbeidelse av amino-ethylcarbazole (AEC) lagerløsning
	<ol>
<li>Bruk en glass pipette, plasser 5 mL N, N-dimethylformamide i en glassbeholder.</li>
		<li>Tilsett 1 20 mg tablett 3-amino-9-ethylcarbazole og rist til det er helt oppløst. Label glasset med "AEC lager" og datoen aksjen ble gjort. Merk: AEC lager løsningen kan oppbevares under kjøling (4 ° c) og brukes i 1-2 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utarbeidelse av AEC arbeider fortynning
	<ol>
<li>Tilsett 7 mL acetate buffer til et 15 mL sentrifugerør.</li>
		<li>Bruk en glass pipette, tilsett 0,5 mL av AEC lager løsningen til sentrifuge røret.</li>
		<li>Tilsett 0,075 mL av 3% hydrogen peroxide til røret.</li>
		<li>Filtrer oppløsningen med en 10 mL sprøyte ved hjelp av et sprøyte filter på 0,45 μm. Merk: AEC arbeider fortynning bør opprettes like før hver DRIT test som det er bare stabilt for 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. direkte rask immunhistokjemi test
<ol><li>
Merk glass objekt lysbilder med et unikt nummer for hver prøve ved hjelp av en smøre sikker, vanntett, permanent blekk markør.
	<ol>
<li>Bruk en skalpell kniv til å fjerne hjernestammen fra beholderen og plassere den på papir håndkle. Mildt fjerne alle overmål av Fluid, blod, eller fur med en andre papir håndkle å avsløre rettferdig det hjernestammen tissue13. Om nødvendig, § hjernestammen vev for å avdekke et tverrsnitt.</li>
		<li>Svært forsiktig berøre mikroskopet lysbildet til korset delen av hjernestammen vev. Berør lysbildet med hjernestammen på flere punkter uten sideveis bevegelse for å tillate at flere områder med hjernestammen overføres til lysbilde13. Sørg for at bare 1 eller 2 lag av celler er overført fra hjernevevet til raset med en mild berøring. Ingen monterings agent er nødvendig for å feste det hjernestammen vevet til lysbildene. Inkluder både en positiv og negativ kontroll i hver DRIT-kjøring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La lysbildene lufttørke i ca 5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Dypp lysbildene i 10% bufret formalin i 10 min (parabolen 1).</li>
	<li>Fjern lysbildene fra formalin og dypp-skyll i en løsning av TPBS (parabol 2).</li>
	<li>Dypp lysbildene i 3% hydrogen peroxide i 10 min (parabolen 3).</li>
	<li>Fjern lysbildene fra hydrogen peroxide og dypp-skyll i frisk TPBS (parabolen 4). Etter fjerning av overflødig hydrogen peroxide, plassere lysbildene i frisk TPBS (parabol 5) og arbeide med ett lysbilde om gangen mens de andre lysbildene opphold nedsenket i TPBS.</li>
	<li>Ta lysbildene fra TPBS (parabol 5) en om gangen, riste av og blot overflødig buffer, og plasser på en fuktet papir håndkle på lab benk, som grunnlag for en "fuktighet kammer". Ved hjelp av en pipette, slipp nok primære anti-rabies virus antistoff på hvert lysbilde for å dekke CNS vev. Ruge lysbildene i 10 minutter i luftfuktigheten kammeret (dvs. dekker lysbilder med brønn plater eller andre enkle dekke mens de legger på fuktet papir håndkle) ved romtemperatur (figur 2).</li>
	<li>Fjern lysbildene fra luft fuktighets kammeret, rist og tørk av overflødig bøy, og DIP-skyll lysbildene i TPBS (gjenbruk samme TPBS i parabolen 5).</li>
	<li>Arbeide med ett lysbilde om gangen, mens andre opphold nedsenket i TPBS-bruk en pipette å slippe nok streptavidin-peroksidase kompleks for å dekke CNS vev. Ruge i luft fuktighets kammeret i 10 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern lysbildene fra luftfuktigheten kammer, riste og blot av overflødig kompleks, og dyppe-skylle lysbildene i TPBS (parabolen 5).</li>
	<li>Arbeide med ett lysbilde om gangen, riste av og blot overflødig buffer, mens andre opphold nedsenket i TPBS-bruk en pipette å droppe nok AEC (preparatet er forklart ovenfor, og bør gjøres umiddelbart før bruk) for å dekke CNS vev. Ruge i luft fuktighets kammeret i 10 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>DIP-skyll lysbildene i destillert vann (parabolen 6).</li>
	<li>Plasser lysbildene i counterstain av gjellene Hematoksylin (fortynnet 1:1 med destillert vann) i 2 min (parabolen 7).</li>
	<li>Umiddelbart DIP-skyll alle lysbildene i destillert vann (parabolen 8). Gjenta to ganger med friskt vann hver gang (retter 9 og 10).</li>
	<li>Arbeide med ett lysbilde om gangen, mens andre holder seg nedsenket i destillert vann (parabolen 10)-riste og tørk av overflødig vann og bruke et vannløselig feste medium for å påføre en cover slip.</li>
	<li>Bruk et lys mikroskop med en 20x målsetting å vise lysbildene og en 40x objektiv hvis nærmere inspeksjon er nødvendig.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Det DRIT er en fleksibel metoden egnet til åker-basert overvåking for oppdager tilstedeværelsen av rabiat virus det kan brukes inne desentralisert laboratorium arealer. Mens det er mulig å gjennomføre hele testen i et felt-basert innstilling som på bakluke av en lastebil, er det ideelt å ha en liten, innendørs plass dedikert til DRIT på grunn av kjemiske, utstyr og forsyning lagring problemer. I tillegg må overholdelse av alle gjeldende føderale, statlige og lokale lover og forskrifter for bruk og avhending av kjemikalier vurderes. Foreløpig USDA WS har 15 DRIT fasiliteter for å teste prøvene fra 17 stater. USDA WS DRIT anlegg er etablert i forbindelse med universitet og statlige offentlige helse laboratorier, i utpekte rom innen større anlegg og i lukkede trailere som har blitt ettermonteres og konvertert til å fungere som mobile testing enheter i hendelse av en nødsituasjonen utbrudd svaret der hvor forsterket rabiat overvåking tester med omgående behandlingstid er betenkelig (skikkelsen 5).
Mens testen har vært vellykket ved hjelp av hjernestammen materiale av variabel kvalitet, fersk hjernestammen vev uten vev nedbryting er optimal. Som nedbryting, uttørking, eller LNG oppstår, sample kvalitet avtar og testen kan oppdage mer uspesifisert farging som kan forvirre resultater. Denne observasjonen er lik mellom DFA og DRIT2. Hjernestammen/CNS skal samles så snart som mulig og deretter oppbevares frosset (-20 ° c) til testing.
Vanligvis, de fleste USDA WS-anlegg prosessen fra 12 til 24 lysbilder samtidig under en DRIT økt, inkludert en positiv kontroll og en negativ kontroll som har blitt bekreftet via DFA. Positive og negative kontroller gir et referansepunkt for hver DRIT-kjøring for å sikre at testen var vellykket, og for å bekrefte om fortolkende-spørsmål oppstår på test lysbildene. Hvis et utvalg ikke er bestemt å ha et klart positivt eller negativt utfall, er det merket som en ubestemt og testet en gang til av DRIT. Hvis dette utvalget ikke er en klar positiv eller negativ etter to DRIT tester, er det sendt til et referanse laboratorium for DFA eller relatert testing.
Som med alle diagnostiske test, er ' feilsøking ' nyttig med uventede funn. Hvis for eksempel en DRIT-kjøring ikke er vellykket (det vil si at den positive kontrollen ikke viser + 3 eller + 4 farge intensitet og antigen-distribusjon), må du sørge for at alle kjemikalier og reagenser ikke er utløpt. Vi har funnet ved hjelp av en nylig åpnet flaske hydrogen peroxide på et minimum av en gang per uke er nyttig for å hindre ikke-spesifikke flekker gjennom oksidasjon av hjernevevet. I tillegg anbefaler vi å erstatte acetate buffer minst én gang hvert år på et minimum, uavhengig av den merkede utløpsdatoen.
Det finnes en rekke fordeler av DRIT over DFA inkludert lavere kostnader, evne til å utføre testen utenfor et sentralisert laboratorium, behov for bare lys mikroskopi i stedet for et fluorescerende mikroskop, og den relativt enkle treningsprosessen for folk administrere og lese testen2,3,4. Disse fordelene, kombinert med følsomhet og spesifisitet av DRIT som er sammenlignbare med DFA2,7,8,9 har allerede bevist at testen fungerer som et viktig verktøy i bred skala forsterket rabiat overvåking planer8,10 inne Nord USA. I tillegg har DRIT potensial til å tillate økt overvåking og mer rask testing i utviklingsland eller andre områder med begrensede ressurser, spesielt etter siste OIE/WHO veiledning som en anbefalt test.

Mens DFA er den mest brukte testen for rutinemessig rabies diagnose1, kan kostnaden ved å kjøpe og vedlikeholde et fluorescerende mikroskop være begrensende til utviklingsland2,3,4 og for bred, stor-skalaen forsterket rabiat overvåking planer3,4. I tillegg krever DFA muligheten til å kjøle prøver under fiksering og å ruge prøvene over omgivelsestemperaturen under antistoff-antigen reaksjoner, som kan være et betydelig hinder i land uten egnet infrastruktur. På grunn delvis til begrensningene forbundet med moderne DFA testing, har den globale effekten av rabies lenge vært undervurdert5.
I denne forbindelse er det behov for å validere ekstra diagnostiske teknikker for å forbedre rabies overvåking globalt, spesielt i utviklingsland. Den DRIT protokollen som presenteres her tilbyr et laboratorium eller felt-basert testing alternativ til DFA som bruker lys mikroskopi og krever ikke kjøling eller laboratorie inkubasjons under testen6. Den DRIT og DFA er like i at begge teknikkene bruker touch visninger av hjernen prøver samlet fra potensielt rabiat dyr. Imidlertid, det for det første steg av det DRIT bruker formalin idet en historisk bindemiddel for eksemplar, hvilke inaktiverer rabiat virus. Dette gir en betydelig biosafety forbedring over aceton brukes til å fikse prøvene i DFA protokollen3, som er viktig ikke bare i laboratoriet, men kanskje enda mer i felt-basert eller desentralisert Lab miljøer. Hittil DRIT viser følsomhet og spesifisitet lik den DFA2,7,8,9.
Siden 2005, det USDA WS program har gjennomført stor-skalaen forsterket rabiat overvåking anstrengelser inne Nord USA benytter det DRIT idet del av en allsidig Wildlife rabiat ledelse program10. Forsterket rabiat overvåking brukes som komplettere å avsøring-basert offentligheten sunnhet overvåking og prøver opprinnelig Wildlife Meso-rovdyr Art, inkluderer vaskebjørn (Procyon lotor), stripete skunks (Mephitis Mephitis), grå rev ( Urocyon cinereoargenteus), rødrev (små små), og Coyotes (Canis latrans) som ikke har vært involvert i en menneskelig eller innenlandsk dyr eksponering. Dyr skrotter anvendt inne tester var innleverte å USDA WS igjennom forsterket rabiat overvåking anstrengelser og danne rabiat vektor art det er: onde eller rart handler; funnet død, vei-drept, eller en ordensforstyrrelser; og er ikke forbundet med en menneskelig eller innenlandsk dyr eksponering. Det DRIT skaffer en rabiat Diagnostic test det kan ansatt av utdannet åker biologer med liten eller nei laboratorium erfaring å gjøre bedre rabiat overvåking og nedskrive det finansiell lasten og arbeidsbyrde av offentligheten sunnhet Diagnostic laboratorium10. Den grunnleggende DRIT trening for USDA WS feltet ansatte vanligvis tar 1,5 til 2 dager, som omfatter ca 4 h av klasserommet instruksjon som dekker fundamentale prinsipper for biosafety, metoder for prøvetaking samling og DRIT prosesser samt > 8 h av laboratorie tid gjennomfører testen. Opplæring muligheter har vært tilgjengelig for USDA WS og program cooperators gjennom Centers for Disease Control og Prevention (CDC), LYSSA LLC, og The Wistar Institute.
Innen strategisk forvaltning områder, har USDA WS testet over 94 000 dyreliv prøver å bruke DRIT og har oppdaget mer enn 1 850 rabiat prøver som ville sannsynligvis gått uoppdaget stole bare på eksponering basert offentlig helse testing av mistenkte dyr. Forsterket rabiat overvåking data forsynt av DRIT resultater er betenkelig å skaffer en flere fullstendig Temporal og romlig representasjon av rabiat på landskap til støtte for muntlig rabiat vaksinasjon planer for Wildlife helt gjennom USA10, 11i. Tilsvarende provinsielle dyreliv etater i Canada har innarbeidet DRIT i stor skala dyreliv rabies overvåking innsats i tandem med sine offentlige helseprogrammer med suksess8. Både USDA WS og kanadiske DRIT overvåkningsprogrammer har brukt nasjonale referanselaboratorier for å bekrefte rabies av DFA og å utføre viral variant skrive som passer8. Videre, USDA WS feltet biologer sende 10% av negative prøver for DFA bekreftelse til referanselaboratorier og siden 2008, har deltatt i halvårlige DRIT ferdighets testing gitt av Wisconsin State Laboratory of hygiene, som en del av standard kvalitetssikrings tiltak.
Målet med denne metoden er å tilby en alternativ tilnærming for rabies diagnostisk testing som kan gjøres i desentralisert laboratorier, i felten, eller i områder uten rutinemessig tilgang til elektron mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

Laboratorium-basert avlytting er Integral for rabiat forhindrer, administrere og ledelse anstrengelser. Stund det DFA er gullet målestokk for rabiat diagnosis, det er en nød å godkjenne i tillegg Diagnostic teknikker å gjøre bedre rabiat overvåking, spesielt inne utvikler land. Her presenterer vi en standard protokoll for DRIT som et alternativ, laboratorium eller felt-basert testing alternativ som bruker lys mikroskopi i forhold til DFA. Touch inntrykk av hjernevev innhentet fra mistenkte dyr er løst i 10% bufret formalin. Det DRIT bruker rabiat virus-spesifikk monoklonale eller polyklonale Antistoffene (bøyd å biotin), en streptavidin-peroksidase enzym, og en kromogen reporter (som acetyl 3-amino-9-ethylcarbazole) å merker viral inkluderinger innen infisert tissue. I ca 1 t, en hjernevev prøve kan testes og tolkes av DRIT. Evaluering av mistenkte dyr hjerner testet fra en rekke arter i Nord-Amerika, Asia, Afrika og Europa har illustrert høy følsomhet og spesifisitet av DRIT nærmer 100% med resultater i forhold til DFA. Siden 2005, det Amerika avdeling av landbruk ' Wildlife tjenestene (USDA WS) program har gjennomført stor-skalaen forsterket rabiat overvåking anstrengelser benytter det DRIT å test > 94000 eksemplar avhentet fra Wildlife inne strategisk rabiat ledelse arealer . Det DRIT skaffer en kraftfull, økonomisk verktøyet for rabiat diagnosis det kan brukes av laboratorians og åker biologer å gjøre bedre aktuelle rabiat overvåking, forhindrer og administrere planer generelt.

Positive resultater fra DRIT viser røde Intracytoplasmatisk viral inkluderinger som kan variere i form og størrelse (Figur 3) innenfor cytoplasma av blå celle organer. Den inkluderinger vises glatt med svært lyse marginer og et mindre intensivt farget sentralt område. Distribusjon av intensitet og antigen registreres når det oppdages inkluderinger. Intensiteten er gradert fra + 4 til + 1. Den positive kontroll lysbilde bør ha en intens, skjærende magenta glans som kalles en + 4 intensitet. En liten tap av farge kan oppstå spesielt når prøvehåndtering ikke har vært optimal (dvs. prøve vev har nedbrutt litt) og disse bør klassifiseres som + 3. Merkbart kjedelig flekk er gradert som en + 2 å + 1, er ikke betraktet som Diagnostic for rabiat virus infeksjon og er benevnt idet ubestemt.
I tillegg antigen fordelingen er gradert fra 4 til + 1 med + 4 representerer antigen distribusjon består av en overflod av store og små slutninger varierende i størrelse og form, og presentere i hvert felt (eller nesten hvert felt) av visningen i CNS vev berøring inntrykk. Den positive kontrollen har vanligvis en + 4 antigen-distribusjon. Et antigen distribusjon av + 3 vil bli tildelt når det er inkluderinger i en rekke størrelser i de fleste, men ikke alle felt av visningen. Hvis det finnes inkluderinger i 10%-50% av mikroskop feltene, tildeles en + 2 antigen-fordeling. Når inkluderinger finnes i < 10% av mikroskop feltene, er en + 1 antigen fordelingen tildelt.
Høyst CNS tissue med rabiat virus gave forevise typisk viral inkluderinger gradert som + 3 eller + 4 intensiteten og antigen distribusjon. Hvis resultatene indikerer en + 2 eller + 1 intensitet eller en + 2 eller + 1 antigen distribusjon, er prøven erklært en "ubestemmelig" og gjenta testing er berettiget. Hvis det samme eksempelet har en repetisjons test resultat, skal prøven sendes til et referanse laboratorium for DFA eller relatert bekreftende testing.
En test prøve benytter det DRIT er betraktet som negativ for rabiat virus antigener etter det skyve inneholder det CNS tissue er blitt avsøkte med en forstørrelsen av 200X eller betydelig og nei typisk virus inkluderinger er oppdaget (skikkelsen 4). Negative prøver viser blå celle organer med liten eller ingen spesifikk farging.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Figur 1: oppsett av 10 lysbilde farge retter med reagenser for testing. Rettene er merket med reagensnavn i den rekkefølgen som trengs for å følge protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figur 2: enkel fuktighet kammer laget med en våt papir håndkle og cellekultur plater.  En enkel luftfuktighet kammer ved hjelp av en våt papir håndkle og cellekultur plater gjør det mulig for felt-basert applikasjon.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figur 3: representative lysbilder av rabies positive viral inkluderinger med + 4 intensitet og + 4 antigen distribusjon. (A og B) viser positiv rabies viral inkluderinger ved 200x forstørrelse. (C og D) viser positiv rabies viral inkluderinger ved 400x forstørrelse. Skala bars = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figur 4: representative lysbilder av negative prøver uten rabies viral inkluderinger. (A og B) Vis eksempler negative for rabies viral inkluderinger ved 200x forstørrelse. (C og D) viser eksempler negativt for rabies viral inkluderinger ved 400x forstørrelse. Skala bars = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figur 5: representative fotografier av DRIT testing anlegg brukes av USDA ws. (A) Mobile testing anlegget i en lukket trailer for transport. (B) ettermonteres for fritidskjøretøy for DRIT-testing. (C) DRIT testing anlegg i forbindelse med universitets laboratorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Forsterket rabiat overvåking benytter en direkte rask Immunhistokjemiske test

Det direkte rask immunhistokjemiske test (DRIT) tilbyder en verden organisasjon for dyr sunnhet og verden sunnhet organisasjon (OIE/WHO) annerkjent alternativ å det direkte fluorescerende antistoff (DFA) test for rabiat diagnosis. Denne testen gjør det mulig for felt-baserte programmer som kan utføres i ca 1 time på hjernen visninger ved hjelp av lys mikroskopi.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT er betydelig fordi det gir en rabies diagnostisk test som kan utføres i desentraliserte laboratorier i feltet eller i områder uten rutinemessig tilgang til elektronmikroskopi. Den største fordelen med DRIT er at den bare benytter enkel lett mikroskopi, og resultatene kan oppnås på omtrent en time. DRIT gir et kraftig økonomisk verktøy for rabies diagnose som kan brukes av arbeidere og feltbiologer for å forbedre rabies overvåking, forebygging og kontroll programmer globalt.For dyr som er nysamlet eller har blitt tint til omgivelsestemperatur, plasser dyret liggende på en flat overflate med livmoderhalsen litt rotert mot sensor. Palpate å identifisere atlanto-occipital ledd på lateral aspektet av cervical ryggraden. Ved hjelp av et skalpellblad, gjør et snitt på nivået av atlanto-occipital leddet på ventral aspektet kutte gjennom alle lag av muskel og bløtvev inkludert luftrøret og spiserøret.Fortsett til til tilnærming av det fremre aspektet av ryggvirvlene i livmoderhalsen. Flytt deretter dyrets hode inn i en endeområdeforlengelse til hjernestammen er synlig. Bruk et skalpellblad for å fjerne alle synlige hjernestammer og sentralnervesystemet vev for prøve.Legg hjernestammeprøvene i en uknuselig beholder og etikett tilsvarende. Først, sett ut farging retter som er dypt nok til å tillate fullstendig nedsenking av en prøve lysbilde. Fyll fat en med 10% fosfat bufret formalin.Fyll retter to, fire og fem med TPBS. Fyll fat tre med 3% hydrogenperoksid. Fyll deretter retter seks, åtte, ni og ti med destillert eller deionisert vann.Fyll rett syv med Gills hematoksylinformulering nummer to fortynnet i et 1:1-forhold med destillert vann. For å forberede amino-etyl-karboazol lagerløsning, ved hjelp av en glasspipette, plasser fem milliliter N, N-dimetylformamid i en glassbeholder. Tilsett 120 mg tablett 3-amino-9-etylcarbazole til glassbeholderen og rist til den er fullstendig oppløst.For å forberede AEC fungerende fortynning, tilsett syv milliliter acetatbuffer til et 15 milliliter sentrifugerør. Bruk en glasspipette til å tilsette 0,5 milliliter AEC-lagerløsning til sentrifugerøret. Tilsett 0,75 milliliter med 3% hydrogenperoksidløsning.Bruk en 10 milliliter sprøyte med et sprøytefilter på 0,45 mikrometer til å filtrere oppløsningen. Til å begynne med kan du bruke en vanntett permanent blekkmarkør til å merke glassmikroskoplysbildene med et unikt tall for hver prøve. Bruk et skalpellblad for å fjerne hjernestammen fra beholderen og legg den på et papirhåndkle.Bruk et annet papirhåndkle til å forsiktig tørke bort overflødig væske, blod eller pels for å avsløre bare hjernestammevevet. Om nødvendig, seksjon brainstem vev for å avsløre et tverrsnitt. Trykk forsiktig på mikroskopet til flere punkter av hjernestammen uten lateral bevegelse for å tillate flere områder av hjernestammen som skal overføres til lysbildet, og pass på at bare ett eller to lag celler overføres fra hjernevevet til lysbildet.La lysbildene lufttørke i ca. fem minutter ved romtemperatur. Senk deretter lysbildene i 10% bufret formalin i parabolen en i 10 minutter. Fjern lysbildene fra formalin og dypp skyll dem i TPBS-oppløsningen i parabolen to.Senk de skyllede lysbildene i hydrogenperoksidoppløsningen som finnes i fatet tre i 10 minutter. Etter dette fjerner du lysbildene fra hydrogenperoksidet og dypper skyll dem i de friske TPBS som finnes i parabolen fire. Etter å ha fjernet overflødig hydrogenperoksid, legg lysbildene i den friske TPBS som finnes i parabolen fem.Ta lysbildene en om gangen fra parabolen fem, riste av og blot overflødig buffer og plasser lysbildet på et fuktet papirhåndkle på laboratoriebenken. Når alle lysbildene er overført, bruk en dropper eller pipette til å slippe nok primær anti-rabies virus antistoff på hvert lysbilde for å dekke CNS vev. Dekk lysbildene med brønnplater eller et annet enkelt deksel for å skape et fuktighetskammer og inkubere lysbildene ved romtemperatur i kammeret i 10 minutter.Etter dette, fjern lysbildene fra fuktighetskammeret, rist og tørk av overflødig konjugat og dypp skyll lysbildene i TPBS i parabolen fem. Arbeide med ett lysbilde om gangen, fjerne et lysbilde fra TPBS og bruke en dropper eller pipette til å slippe nok Streptavidin peroxidase kompleks for å dekke CNS vev. Når alle lysbildene er dekket, inkuber dem i fuktighetskammeret i 10 minutter ved romtemperatur.Fjern deretter lysbildene fra fuktighetskammeret, rist og tørk av overflødig kompleks og dypp skyll lysbildene i TPBS som finnes i parabolen fem. Arbeide med ett lysbilde om gangen, fjerne et lysbilde fra TPBS og bruke en pipette til å slippe nok AEC arbeidsløsning for å dekke CNS vev. Inkuber lysbildene i fuktighetskammeret i 10 minutter ved romtemperatur.Etter dette, dypp skyll lysbildene i destillert vann som finnes i parabolen seks og plassere dem i en konstring av Gills hematoksylin i parabolen syv i to minutter. Dypp skyll straks alle skliene i det destillerte vannet i fat åtte. Gjenta dette to ganger ved hjelp av ferskvannet i retter ni og 10 for hver vask.Arbeide ett lysbilde om gangen, fjerne en sklie fra vannet og riste og blot av overflødig vann. Bruk et vannløselig monteringsmedium for å feste en dekkslipp til lysbildet. Bruk deretter et lett mikroskop med et 20X-mål for å vise lysbildene.Positive resultater fra DRIT viser røde intracytoplasmatiske virale inneslutninger som kan variere i form og størrelse innenfor cytoplasma av de blåaktige cellelegemene. Inkluderingene ser glatte ut med svært lyse marginer og et mindre intensivt farget sentralt område. Antigenfordelingen er gradert fra pluss fire til pluss en med pluss fire som representerer antigenfordeling som består av en overflod av store og små inneslutninger som varierer i størrelse og form og tilstede i hvert synsfelt innenfor CNS vev berøringsinntrykk.En fordeling på pluss tre tilordnes når det finnes inneslutninger i en rekke størrelser i de fleste, men ikke alle synsfeltene. Hvis inkluderinger finnes i 10 til 50 % av mikroskopfeltene, tilordnes en pluss to antigendistribusjon mens pluss én er tilordnet når inkluderinger finnes i mindre enn 10 % av feltene. De fleste CNS vev med rabies virus stede viser typiske viral inneslutninger gradert som pluss tre eller pluss fire intensitet og antigen distribusjon.Hvis resultatene indikerer en pluss en eller pluss to i enten intensitet eller antigenfordeling, er prøven erklært en ubestemt og gjentatt testing er berettiget. En testprøve ved hjelp av DRIT anses som negativ for rabiesvirusantigener etter at lysbildet som inneholder CNS-vevet skannes ved en forstørrelse på 200X eller større, og ingen typiske virusinkludering oppdages. Negative prøver viser blåaktige cellelegemer med liten eller ingen kjent spesifikk farging.Hver person som utfører rabies diagnostisk testing bør få standard pre-eksponering rabies vaksinasjoner og gjennomgå regelmessig serologisk antistoff evaluering. Uimmuniserte individer bør ikke gå inn i områder der slikt arbeid utføres. I tillegg til forholdsreglene som tas når du arbeider med levende rabiesvirus, er flere av reagensene som brukes i testen farlige.Se sikkerhetsdatabladene for hver reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriske Bakteriell invasjon av intestinal Epitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Er dramatisk forbedret ved hjelp av en vertikal Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En rask strategi for isolering av nye Faustoviruses fra miljøprøver ved hjelp<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Bruke forbedret grønne fluorescens Protein-uttrykke Escherichia Coli å vurdere musen Peritoneal Macrophage fagocytose

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test for å evaluere Rabies vaksine styrke

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for rabies diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Felt Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Ressursbegrensede innstillinger med ytterligere molekylære applikasjoner

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunhiistokjemi Test for Lyssavirus Antigen Deteksjon fra Formalin-fast vev

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...