Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Reconhecemos todos os funcionários do USDA Wildlife Services que atualmente ou já coletaram amostras melhoradas de vigilância da raiva e conduziram o DRIT para o diagnóstico de raiva. Da mesma forma, reconhecemos os muitos cooperadores que nos auxiliam na coleta de vigilância contra a raiva reforçada. Agradecemos também aos centros de controle e prevenção de doenças e ao Instituto Wistar o acesso a reagentes críticos necessários para a condução do DRIT e para o fornecimento de oportunidades de treinamento. Além disso, agradecemos o diagnóstico confirmatório e a assistência técnica prestada pelos centros de controle e prevenção de doenças e pelo centro de Wadsworth com a Secretaria Estadual de saúde de Nova York. O uso de qualquer produto comercial é apenas para fins de comparação e não constitui endosso.

Cada pessoa que conduz o teste diagnóstico da raiva deve receber uma série padrão da vacinação da raiva da pre-exposição e submeter-se à avaliação sorológicos regular do anticorpo, com imunizações do impulsionador como necessário. Indivíduos não imunizados não devem entrar em laboratórios ou áreas onde esse trabalho é conduzido. Toda a manipulação dos tecidos e das corrediças deve ser conduzida para não aerosolize líquidos ou para produzir partículas transportadas por via aérea. As capas das emanações não são exigidas mas quando praticável podem fornecer a proteção extra dos odores, dos ectoparasitas, e dos fragmentos do osso. Equipamento de proteção individual mínimo, incluindo luvas e proteção ocular, deve ser usado em todos os momentos durante a coleta de amostras e testes.
1. coleção brainstem
<ol><li>Colete amostras de tronco cerebral imediatamente após a coleta de carcaça ou assegure-se de que as carcaças sejam colocadas em freezers para armazenamento até um teste posterior. Se as carcaças animais são congeladas, descongelar-se na temperatura ambiental antes da coleção do tronco encefálico para a facilidade da coleção. Em algumas circunstâncias, as amostras são coletadas diretamente de um animal congelado.</li>
	<li>
Para os animais que são recentemente recolhidos ou foram descongelados para a temperatura ambiente, posicione o supino animal em uma superfície plana com a coluna cervical levemente girada para o examinador. Palpar para identificar a articulação atlanto-occipital no aspecto lateral da coluna cervical.
	<ol>
<li>Para carcaças que ainda estão completamente congeladas, posicione o supino animal como descrito acima, se prático. Use serras, facas, tesouras ósseas ou equipamentos similares para separar completamente a cabeça do corpo. Nota: Todos os equipamentos utilizados que não sejam de uso único devem ser limpos cuidadosamente entre as amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão no nível da articulação atlanto-occipital no aspecto ventral, cortando todas as camadas de tecido muscular e mole, incluindo a traquéia e o esôfago. Continue até aproximar o aspecto anterior das vértebras da coluna cervical. Para o tecido congelado, use uma lâmina do bisturi para remover todas as camadas restantes de músculo e de tecido macio para expor o Magnum do forâmen.</li>
	<li>Mova a cabeça do animal para a extensão do alcance final até que o tronco cerebral seja visível. Use uma lâmina de bisturi para remover todo o tecido do tronco cerebral/sistema nervoso central (CNS) visível para amostragem. Para uma amostra congelada, use uma lâmina de bisturi para remover tanto do tecido brainstem/CNS congelado quanto possível de dentro do crânio.</li>
	<li>Coloc as amostras do tronco encefálico em um recipiente inquebrável (isto é, lata da pomada do metal, Cryo-Vial, etc.) e etiqueta conformemente.</li>
	<li>Assegure-se de que as amostras do tronco cerebral sejam testadas imediatamente após a coleta através do teste de DRIT, refrigerado (4 ° c) para até 24 h antes de testar, ou congelado (-20 ° c) até a época do teste se o teste ocorrerá mais de 24 h após a coleção da amostra.</li>
</ol>2. preparação de materiais para DRIT
<ol><li>
Criação de 10 pratos de coloração deslizante (Figura 1) Nota: Os pratos de coloração são suficientemente profundos para permitir a imersão completa da lâmina (diâmetro 96 mm, altura 72 mm, profundidade 42 mm, volume 250 mL). 6 anos de<ol>
<li>Encha o prato 1 com formalina tamponada de fosfato a 10%. Substitua formalina após 2 ensaios ou semanalmente.</li>
		<li>Encha os pratos 2, 4 e 5 com solução salina tamponada com fosfato com 1% de Tween-80 (TPBS). Substitua com TPBS frescos antes de cada teste.</li>
		<li>Encha o prato 3 com peróxido de hidrogênio a 3%. Substitua o peróxido de hidrogênio antes de cada teste.</li>
		<li>Encha os pratos 6, 8, 9 e 10 com água destilada ou desionizada. Substitua a água antes de cada teste.</li>
		<li>Encha o prato 7 com a formulação da hematoxilina de Gills #2 diluída em uma relação 1:1 na água destilada6. Substitua a hematoxilina após 2 ensaios ou semanalmente. Nota: De acordo com o protocolo original de Drit desenvolvido pelo CDC12, uma relação 1:2 do hematoxilina de Gills à água pode ser usada se a contrcoloração é demasiado escura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da solução de ações amino-ethylcarbazole (AEC)
	<ol>
<li>Utilizando uma pipeta de vidro, coloque 5 mL de N, N-dimetilformamida num recipiente de vidro.</li>
		<li>Adicionar 1 20 mg comprimido de 3-amino-9-ethylcarbazole e agitar até dissolver completamente. Rotule o pote com "AEC stock" e a data em que o estoque foi feito. Nota: A solução de estoque AEC pode ser armazenada refrigeração (4 ° c) e usada por 1-2 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da diluição de trabalho AEC
	<ol>
<li>Adicione 7 mL de tampão de acetato a um tubo de centrifugação de 15 mL.</li>
		<li>Usando uma pipeta de vidro, adicione 0,5 mL da solução de estoque AEC ao tubo de centrífuga.</li>
		<li>Adicione 0, 75 mL de peróxido de hidrogênio a 3% ao tubo.</li>
		<li>Filtre a solução com uma seringa de 10 mL utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm. Nota: A diluição de trabalho AEC deve ser criada apenas antes de cada teste DRIT, pois é apenas estável para 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teste rápido direto de Immunohistochemistry
<ol><li>
O microscópio de vidro da etiqueta desliza com um número original para cada espécime usando um mancha-prova, waterproof, marcador permanente da tinta.
	<ol>
<li>Usando uma lâmina de bisturi, retire o tronco cerebral do recipiente e coloque na toalha de papel. Limpe delicadamente afastado todo o excesso do líquido, do sangue, ou da pele com uma segunda toalha de papel para revelar apenas o tecido do tronco cerebral13. Se necessário, corte o tecido do tronco cerebral para revelar uma seção transversal.</li>
		<li>Toque muito suavemente na corrediça do microscópio para a secção transversal do tecido do tronco cerebral. Toque no slide para o tronco cerebral em vários pontos sem movimento lateral para permitir que várias áreas do tronco encefálico sejam transferidas para o slide13. Certifique-se de que apenas 1 ou 2 camadas de células são transferidas do tecido cerebral para o slide com um toque suave. Nenhum agente de montagem é necessário para afixar o tecido do tronco cerebral para as lâminas. Inclua um controle positivo e negativo em cada execução do DRIT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe as lâminas secar ao ar por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Mergulhe as lâminas em formalina tamponada a 10% por 10 min (prato 1).</li>
	<li>Retire as lâminas da formalina e mergulhe-enxague numa solução de TPBS (prato 2).</li>
	<li>Mergulhe as lâminas em 3% de peróxido de hidrogênio por 10 min (prato 3).</li>
	<li>Retire as lâminas do peróxido de hidrogênio e mergulhe-enxague em TPBS frescos (prato 4). Depois de remover o excesso de peróxido de hidrogênio, coloque as lâminas em TPBS frescos (prato 5) e trabalhe com um slide de cada vez enquanto os outros slides ficam imersos em TPBS.</li>
	<li>Pegue as lâminas de TPBS (prato 5) um de cada vez, sacudir e borrar o excesso de buffer, e coloque em uma toalha de papel umedecido no banco de laboratório, como a base de uma "câmara de umidade". Usando uma pipeta, gota bastante anticorpo preliminar da anti-raiva do vírus em cada corrediça para cobrir o tecido do CNS. Incubar as lâminas durante 10 min na câmara de humidade (ou seja, cobrindo lâminas com placas de poço ou outra tampa simples enquanto estão a colocar na toalha de papel umedecida) à temperatura ambiente (Figura 2).</li>
	<li>Retire as lâminas da câmara de humidade, agite e desaperte o conjugado em excesso e enxague as lâminas no TPBS (reutilize o mesmo TPBS no prato 5).</li>
	<li>Trabalhando com um slide de cada vez, enquanto outros ficam imersos em TPBS — use uma pipeta para soltar bastante complexo streptavidin-peroxidase para cobrir o tecido do SNC. Incubar na câmara de humidade durante 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire as lâminas da câmara de humidade, agite e desaperte o excesso de complexo e enxague as lâminas em TPBS (prato 5).</li>
	<li>Trabalhar com um slide de cada vez, sacudir e borrar o excesso de buffer, enquanto outros ficam imersos em TPBS — use uma pipeta para soltar AEC suficiente (a preparação é explicada acima e deve ser feita imediatamente antes do uso) para cobrir o tecido do SNC. Incubar na câmara de humidade durante 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Mergulhe-enxague as lâminas em água destilada (prato 6).</li>
	<li>Coloque as lâminas em contracoloração de Gills hematoxilina (diluído 1:1 com água destilada) por 2 min (prato 7).</li>
	<li>Mergulhe imediatamente todas as lâminas em água destilada (prato 8). Repita duas vezes com água fresca cada vez (pratos 9 e 10).</li>
	<li>Trabalhando com um slide de cada vez, enquanto outros ficam imersos em água destilada (prato 10) — agitar e apagar o excesso de água e usar um meio de montagem solúvel em água para afixar um deslizamento de cobertura.</li>
	<li>Use um microscópio de luz com um objetivo 20x para ver os slides e um objetivo de 40x se for necessária uma inspeção mais próxima.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O DRIT é um método flexível adequado para vigilância baseada em campo para detectar a presença de vírus da raiva que pode ser usado em áreas de laboratório descentralizadas. Embora seja possível realizar todo o teste em uma configuração baseada em campo, como na porta traseira de um caminhão, é ideal ter um pequeno espaço interno dedicado para DRIT devido a problemas de armazenamento de produtos químicos, equipamentos e suprimentos. Além disso, deve-se considerar a aderência a todas as leis federais, estaduais e locais aplicáveis, bem como regulamentações para uso e descarte de produtos químicos. Atualmente, o USDA WS tem 15 instalações DRIT para testar amostras de 17 Estados. As instalações do USDA WS DRIT são estabelecidas em conjunto com laboratórios de saúde pública da Universidade e do estado, em salas designadas dentro de instalações maiores e em reboques fechados que foram adaptados e convertidos para servir como unidades de teste móveis no evento de resposta de surto de emergência onde o teste aprimorado de vigilância da raiva com tempo de resposta imediato é crítico (Figura 5).
Quando o teste for bem sucedido usando o material do tronco encefálico da qualidade variável, o tecido fresco do tronco encefálico sem a decomposição do tecido é ideal. Como a decomposição, dessecação, ou liquefacção ocorre, a qualidade da amostra diminui e o teste pode detectar uma coloração mais inespecífica que pode confundir resultados. Esta observação é similar entre o DFA e o DRIT2. Brainstem/CNS deve ser coletado o mais rapidamente possível e, em seguida, armazenado congelado (-20 ° c) até o teste.
Tipicamente, a maioria de instalações do USDA WS processam de 12 a 24 corrediças imediatamente durante uma sessão de DRIT, incluindo um controle positivo e um controle negativo que foram confirmados através de DFA. Controles positivos e negativos fornecem um ponto de referência para cada execução de DRIT para garantir que o teste foi bem-sucedido e para confirmar se as perguntas interpretativas surgem nos slides de teste. Se uma amostra não é determinada para ter um resultado positivo ou negativo claro, ele é rotulado como um indeterminado e testado uma segunda vez por DRIT. Se esta amostra não é um positivo claro ou negativo após dois testes DRIT, ele é enviado para um laboratório de referência para DFA ou testes relacionados.
Como com qualquer teste de diagnóstico, ' Trouble tiroteio ' é útil com descobertas inesperadas. Por exemplo, se uma execução de DRIT não for bem-sucedida (ou seja, o controle positivo não apresentar + 3 ou + 4 de intensidade de coloração e distribuição de antígeno), assegure-se de que todos os produtos químicos e reagentes não tenham expirado. Nós encontramos usando um frasco recentemente aberto do peróxido de hidrogênio em um mínimo de uma vez por a semana é útil ajudar a impedir a mancha não específica com a oxidação do tecido de cérebro. Além disso, recomendamos substituir o buffer de acetato pelo menos uma vez por ano no mínimo, independentemente da data de expiração rotulada.
Há uma série de vantagens do DRIT sobre DFA, incluindo custos mais baixos, a capacidade de realizar o teste fora de um laboratório centralizado, necessidade de apenas microscopia de luz em vez de um microscópio fluorescente, e o processo de formação relativamente simples para pessoas administrando e lendo o teste2,3,4. Estas vantagens, juntamente com a sensibilidade e especificidade do Drit que são comparáveis aos DFA2,7, 8,9 já provaram que o teste serve como uma ferramenta importante em larga escala programas melhorados da vigilância da raiva8,10 em America do Norte. Além disso, o DRIT tem potencial para permitir um aumento da vigilância e um teste mais rápido em países em desenvolvimento ou em outras áreas com recursos limitados, especialmente após a recente orientação da OIE/OMS como um teste recomendado.

Quando o DFA for o teste o mais extensamente usado para o diagnóstico rotineiro1da raiva, o custo de comprar e de manter um microscópio fluorescente pode ser limitando às nações tornando-se2,3,4 e para largo, programas melhorados de vigilância da raiva em grande escala3,4. Além disso, o DFA requer a capacidade de refrigerar amostras durante a fixação e incubar amostras acima da temperatura ambiente durante as reações de anticorpo-antígeno, que pode ser um obstáculo significativo em países sem infra-estrutura adequada. Devido em parte às limitações associadas aos testes modernos de DFA, o impacto global da raiva tem sido subestimado há muito tempo5.
A este respeito, há a necessidade de validar técnicas diagnósticas adicionais para melhorar a vigilância da raiva globalmente, particularmente nos países em desenvolvimento. O protocolo DRIT aqui apresentado oferece uma alternativa de testes laboratoriais ou baseados em campo ao DFA que utiliza microscopia de luz e não requer refrigeração ou incubação laboratorial durante o teste6. O DRIT e o DFA são similares em que ambas as técnicas usam impressões de toque de amostras de cérebro coletadas de animais potencialmente raioides. No entanto, o primeiro passo do DRIT utiliza formalina como um fixador histórico para as amostras, que inactiva o vírus da raiva. Isto fornece uma melhoria substancial do biossegurança sobre o acetona usado para fixar amostras no protocolo3de DFA, que é importante não somente no laboratório mas talvez mesmo mais assim em ambientes de laboratório campo-baseados ou descentralizados. Até o momento, o Drit mostra sensibilidade e especificidade iguais ao DFA2,7,8,9.
Desde 2005, o programa USDA WS tem conduzido em grande escala reforçada esforços de vigilância da raiva na América do Norte usando o DRIT como parte de um programa abrangente de gestão da raiva da vida selvagem10. A vigilância da raiva reforçada é usada como um complemento à vigilância da saúde pública baseada em exposição e testa principalmente espécies de meso-carnívoros de vida selvagem, incluindo guaxinins (Procyon lotor), gambões listrados (MephitisMephitis), raposas cinzentas ( Urocyon cinereoargenteus), raposas vermelhas (Vulpes vulpes), e coiotes (latrans de Canis) que não estiveram envolvidos em uma exposição animal humana ou doméstica. Carcaças de animais usadas em testes foram submetidas ao USDA WS por meio de esforços aprimorados de vigilância da raiva e compostas de espécies de vetor de raiva que são: atuação doente ou estranha; encontrado morto, estrada-morto, ou um incômodo; e não estão associados a uma exposição animal humana ou doméstica. O DRIT fornece um teste de diagnóstico da raiva que pode ser empregado por biólogos treinados do campo com pouca ou nenhuma experiência do laboratório para melhorar a fiscalização da raiva e para reduzir a carga financeira e a carga de trabalho de laboratórios diagnósticos da saúde pública10. O treinamento básico de DRIT para empregados do campo do USDA WS toma tipicamente 1,5 a 2 dias, que inclui aproximadamente 4 h da instrução da sala de aula que cobre princípios fundamentais da Biossegurança, métodos para a coleção da amostra e os processos de DRIT assim como > 8 h de tempo de laboratório conduzindo o teste. As oportunidades de treinamento estão disponíveis para o USDA WS e cooperadores de programas através dos centros de controle e prevenção de doenças (CDC), LYSSA LLC e do Instituto Wistar.
Dentro de áreas de gestão estratégica, o USDA WS testou mais de 94.000 amostras de vida selvagem usando o DRIT e detectou mais de 1.850 amostras raivas que teriam provavelmente desaparecido sem ser detectado confiando apenas em testes de saúde pública baseados em exposição de animais suspeitos. Os dados melhorados da vigilância da raiva fornecidos por resultados de DRIT são críticos a fornecer uma respresentação temporal e espacial mais completa da raiva na paisagem no apoio de programas orais da vacinação da raiva para animais selvagens durante todo os EUA10, o 11. Da mesma forma, as agências de vida selvagem provinciais no Canadá incorporaram o DRIT em grandes esforços de vigilância da raiva selvagem em conjunto com seus programas de saúde pública com sucesso8. Ambos os programas de vigilância do USDA WS e do Canadian DRIT usaram laboratórios nacionais de referência para confirmar a raiva por DFA e para executar a digitação variante viral conforme apropriado8. Além disso, os biólogos do campo do USDA WS enviam 10% de espécimes negativos para a confirmação de DFA aos laboratórios de referência e desde 2008, participaram em testes bianuais da proficiência de DRIT fornecidos pelo laboratório do estado de Wisconsin da higiene, como parte do padrão medidas de garantia de qualidade.
O objetivo deste método é oferecer uma abordagem alternativa para o teste de diagnóstico de raiva que pode ser feito em laboratórios descentralizados, no campo, ou em áreas sem acesso rotineiro à microscopia eletrônica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

A vigilância laboratorial é essencial para os esforços de prevenção, controle e gestão da raiva. Embora o DFA seja o padrão-ouro para o diagnóstico da raiva, há a necessidade de validar técnicas diagnósticas adicionais para melhorar a vigilância da raiva, particularmente nos países em desenvolvimento. Aqui, nós apresentamos um protocolo padrão para o DRIT como uma alternativa, laboratório ou campo-baseou a opção do teste que usa a microscopia de luz em comparação ao DFA. As impressões de toque do tecido cerebral coletadas de animais suspeitos são fixadas em formalina tamponada a 10%. O Drit usa anticorpos monoclonais ou Polyclonal vírus-específicos da raiva (conjugated à biotina), uma enzima da streptavidin-peroxidase, e um repórter do cromogénio (tal como o acetil 3-amino-9-ethylcarbazole) para detectar inclusões virais dentro do tecido contaminado. Em aproximadamente 1 h, uma amostra de tecido cerebral pode ser testada e interpretada pelo DRIT. Avaliação de cérebros de animais suspeitos testados a partir de uma variedade de espécies na América do Norte, Ásia, África e Europa têm ilustrado alta sensibilidade e especificidade pelo DRIT aproximando 100% com resultados em comparação com a DFA. Desde 2005, o programa de serviços de vida selvagem (USDA WS) do departamento de agricultura dos Estados Unidos conduziu esforços de vigilância da raiva em larga escala usando o DRIT para testar > 94000 amostras coletadas da vida selvagem em áreas estratégicas de manejo da raiva . O Drit fornece uma ferramenta poderosa, econômica para o diagnóstico da raiva que pode ser usada por laboratoristas e por biólogos do campo para melhorar programas atuais da fiscalização, da prevenção e de controle da raiva globalmente.

Os resultados positivos do Drit mostram inclusões virais intracytoplasmic vermelhas que podem variar na forma e no tamanho (Figura 3) dentro do citoplasma de corpos azulado da pilha. As inclusões parecem lisas com margens muito brilhantes e uma área central menos intensamente manchada. A intensidade e a distribuição do antígeno são registradas quando as inclusões são detectadas. A intensidade é graduada de + 4 a + 1. A corrediça positiva do controle deve ter um brilhantismo magenta intenso, gritante que seja referido como uma intensidade de + 4. Uma ligeira perda de cor pode ocorrer especialmente quando A manipulação da amostra não foi ótima (isto é, o tecido da amostra tem decomposto ligeiramente) e estes devem ser classificados como + 3. A mancha visivelmente maçante é classific como um + 2 a + 1, não é considerada diagnóstica para a infecção do vírus de raiva e é etiquetada como indeterminado.
Adicionalmente, a distribuição do antígeno é graduada de + 4 a + 1 com + 4 que representa a distribuição do antígeno compreendida de uma abundância de inclusões grandes e pequenas que variam no tamanho e na forma, e presente em cada campo (ou quase cada campo) da vista dentro do tecido do CNS impressão de toque. O controle positivo normalmente tem uma distribuição de antígeno + 4. Uma distribuição de antígeno de + 3 seria atribuída quando há inclusões em uma variedade de tamanhos na maioria, mas não todos os campos de visão. Se as inclusões são encontradas em 10%-50% dos campos do microscópio, uma distribuição do antígeno + 2 é atribuída. Quando as inclusões são encontradas em < 10% dos campos do microscópio, uma distribuição do antígeno + 1 é atribuída.
A maioria dos tecidos do SNC com vírus da raiva apresentam inclusões virais típicas classificadas como + 3 ou + 4 de intensidade e distribuição de antígeno. Se os resultados indicarem uma intensidade de + 2 ou + 1 ou uma distribuição de antígeno + 2 ou + 1, a amostra é declarada como um "indeterminado" e o teste de repetição é garantido. Se a mesma amostra tiver um resultado de teste de repetição indeterminado, a amostra deve ser enviada para um laboratório de referência para DFA ou testes confirmatórios relacionados.
Uma amostra de teste usando o DRIT é considerada negativa para antígenos do vírus da raiva depois que o slide contendo o tecido do SNC foi verificado em uma ampliação de 200X ou maior e não são detectadas inclusões de vírus típicas (Figura 4). Amostras negativas exibem corpos de células azuladas com pouca ou nenhuma coloração inespecífica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Figura 1: configuração de 10 pratos de coloração slide com reagentes para teste. Os pratos são rotulados com o nome do reagente na ordem necessária para seguir o protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figura 2: câmara de humidade simples criada com uma toalha de papel molhado e placas de cultura celular.  Uma câmara de umidade simples usando uma toalha de papel molhado e placas de cultura celular permite a aplicação baseada em campo.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figura 3: lâminas representativas de inclusões virais positivas de raiva com + 4 de intensidade e distribuição de antígeno + 4. (A e B) mostram inclusões virais da raiva positiva na ampliação de 200x. (C e D) mostram inclusões virais positivas da raiva na ampliação 400x. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figura 4: lâminas representativas de amostras negativas sem inclusões virais da raiva. (A e B) mostram amostras negativas para inclusões virais da raiva na ampliação 200x. (C e D) mostram amostras negativas para inclusões virais da raiva na ampliação 400x. Barras de escala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figura 5: fotografias representativas das instalações de ensaio da DRIT utilizadas pelo USDA WS. A) instalações de ensaio móveis num reboque fechado para transporte. B) veículo recreativo adaptado para testes de Drit. (C) instalação de ensaios de Drit em conjunto com o laboratório universitário. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Vigilância aumentada da raiva usando um teste Imunoistoquímico rápido direto

O teste imunoistoquímico rápido direto (DRIT) oferece uma organização mundial para a saúde animal e organização mundial da saúde (OIE/OMS) reconhecida alternativa ao teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) para o diagnóstico de raiva. Este teste permite aplicações baseadas em campo que podem ser executadas em aproximadamente 1 h em cima das impressões do cérebro usando a microscopia de luz.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

O DRIT é significativo porque fornece um teste de diagnóstico de raiva que pode ser realizado em laboratórios descentralizados no campo ou em áreas sem acesso rotineiro à microscopia eletrônica. A principal vantagem do DRIT é que ele utiliza apenas microscopia leve simples e os resultados podem ser obtidos em aproximadamente uma hora. O DRIT fornece uma poderosa ferramenta econômica para o diagnóstico da raiva que pode ser usada por laboratoriais e biólogos de campo para melhorar os programas de vigilância, prevenção e controle da raiva globalmente.Para animais recém-coletados ou descongelados à temperatura ambiente, posicione o supino animal em uma superfície plana com a coluna cervical ligeiramente girada em direção ao examinador. Palpato para identificar a articulação atlanto-occipital no aspecto lateral da coluna cervical. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão ao nível da articulação atlanto-occipital no aspecto ventral cortando todas as camadas de músculo e tecido mole, incluindo a traqueia e o esôfago.Continue até aproximar o aspecto anterior das vértebras cervicais da coluna vertebral. Em seguida, mova a cabeça do animal para uma extensão de alcance final até que o tronco cerebral seja visível. Use uma lâmina de bisturi para remover todo o tronco cerebral visível e tecido do sistema nervoso central para amostra.Coloque as amostras do tronco cerebral em um recipiente inquebrável e rotule em conformidade. Primeiro, coloque pratos de coloração que são profundos o suficiente para permitir a imersão completa de um slide de amostra. Encha o prato um com formalina tamponada de fosfato de 10%.Encha pratos dois, quatro e cinco com TPBS. Encha o prato três com 3% de peróxido de hidrogênio. Em seguida, encha os pratos seis, oito, nove e 10 com água destilada ou desionizada.Encha o prato sete com a formulação de hematoxilina de Gill número dois diluída em uma proporção de 1:1 com água destilada. Para preparar a solução de estoque de amino-etil-carbazole, usando uma pipeta de vidro, coloque cinco mililitros de N, N-dimetilformamida em um recipiente de vidro. Adicione 120 miligramas de comprimido 3-amino-9-ethylcarbazole ao recipiente de vidro e agite até dissolver completamente.Para preparar a diluição de trabalho da AEC, adicione sete mililitros de tampão de acetato a um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Use uma pipeta de vidro para adicionar 0,5 mililitros de solução de estoque AEC ao tubo centrífuga. Adicione 0,75 mililitros de solução de peróxido de hidrogênio de 3%.Use uma seringa de 10 mililitros com um filtro de seringa de 0,45 micrômetros para filtrar a solução. Para começar, use um marcador de tinta permanente à prova d'água à prova de manchas para rotular lâminas de microscópio de vidro com um número único para cada espécime. Use uma lâmina de bisturi para remover o tronco cerebral do recipiente e coloque-o em uma toalha de papel.Use uma segunda toalha de papel para apagar suavemente qualquer excesso de fluido, sangue ou pele para revelar apenas o tecido do tronco cerebral. Se necessário, seram o tecido do tronco cerebral para revelar uma seção transversal. Toque suavemente o slide do microscópio para vários pontos do tronco cerebral sem movimento lateral para permitir que várias áreas do tronco cerebral sejam transferidas para o slide certificando-se de que apenas uma ou duas camadas de células sejam transferidas do tecido cerebral para o slide.Deixe o ar dos slides secar por aproximadamente cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe os slides na formalina 10% tamponada no prato um por 10 minutos. Remova os slides da formalina e mergulhe-os na solução TPBS no prato dois.Mergulhe os slides enxaguados na solução de peróxido de hidrogênio contida no prato três por 10 minutos. Depois disso, remova os slides do peróxido de hidrogênio e mergulhe-os no TPBS fresco contido no prato quatro. Depois de remover qualquer excesso de peróxido de hidrogênio, coloque os slides no TPBS fresco contido no prato cinco.Pegue os slides um de cada vez do prato cinco, agite e limpe qualquer excesso de tampão e coloque o slide em uma toalha de papel umedecido no banco do laboratório. Quando todos os slides forem transferidos, use um conta-gotas ou pipeta para soltar anticorpos antirraiva primários suficientes em cada lâmina para cobrir o tecido CNS. Cubra os slides com placas de poço ou outra capa simples para criar uma câmara de umidade e incubar os slides à temperatura ambiente na câmara por 10 minutos.Depois disso, remova os slides da câmara de umidade, agite e limpe qualquer excesso de conjugado e mergulhe os slides no TPBS no prato cinco. Trabalhando com um slide de cada vez, remova um slide do TPBS e use um conta-gotas ou pipeta para soltar o complexo peroxidase streptavidin suficiente para cobrir o tecido CNS. Uma vez que todos os slides tenham sido cobertos, incuba-os na câmara de umidade por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, remova os slides da câmara de umidade, agite e limpe qualquer excesso complexo e mergulhe os slides no TPBS contidos no prato cinco. Trabalhando com um slide de cada vez, remova um slide do TPBS e use uma pipeta para soltar solução de trabalho AEC suficiente para cobrir o tecido CNS. Incubar os slides na câmara de umidade por 10 minutos em temperatura ambiente.Depois disso, mergulhe os slides na água destilada contida no prato seis e coloque-os em uma contra-mancha de hematoxilina de Gill no prato sete por dois minutos. Imediatamente mergulhe todos os slides na água destilada no prato oito. Repita isso duas vezes usando a água doce nos pratos 9 e 10 para cada lavagem.Trabalhando um slide de cada vez, remova um escorregador da água e agite e limpe qualquer excesso de água. Use um meio de montagem solúvel em água para fixar um deslizamento de tampas na lâmina. Em seguida, use um microscópio leve com um objetivo de 20X para visualizar os slides.Os resultados positivos do DRIT mostram inclusões virais intracytoplasmáticas vermelhas que podem variar de forma e tamanho dentro do citoplasma dos corpos das células azuladas. As inclusões parecem suaves com margens muito brilhantes e uma área central menos intensamente manchada. A distribuição de antígenos é classificada de mais quatro para mais um com mais quatro representando distribuição de antígenos composta por uma abundância de grandes e pequenas inclusões variando em tamanho e forma e presentes em todos os campos de visão dentro da impressão de toque de tecido CNS.Uma distribuição de mais três é atribuída quando há inclusões em uma variedade de tamanhos na maioria, mas não em todos os campos de visão. Se as inclusões forem encontradas em 10 a 50% dos campos de microscópio, uma distribuição de antígeno mais dois é atribuída enquanto mais uma é atribuída quando as inclusões são encontradas em menos de 10% dos campos. A maioria dos tecidos CNS com vírus da raiva presentes apresentam inclusões virais típicas classificadas como mais três ou mais quatro intensidade e distribuição de antígenos.Se os resultados indicarem um mais um ou mais dois em intensidade ou distribuição de antígeno, a amostra é declarada indeterminada e o teste de repetição é justificado. Uma amostra de teste usando DRIT é considerada negativa para antígenos do vírus da raiva depois que a lâmina contendo o tecido CNS é escaneada a uma ampliação de 200X ou mais e nenhuma inclusão típica do vírus é detectada. Amostras negativas exibem corpos de células azuladas com pouca ou nenhuma coloração específica conhecida.Cada pessoa que realiza testes de diagnóstico de raiva deve receber vacinação antirrábica pré-exposição padrão e passar por avaliação regular de anticorpos sorológicos. Indivíduos não imunizados não devem entrar em áreas onde esse trabalho está sendo realizado. Além das precauções tomadas ao trabalhar com o vírus da raiva viva, vários dos reagentes utilizados no teste são perigosos.Consulte as folhas de dados de segurança de cada reagente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais<em&gt; In Vitro</em&gt; É dramaticamente aumentada usando um Vertical Modelo câmara de difusão

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Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

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Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

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Teste de imunohistoquímica para a detecção de antígenos lyssavírus a partir de tecidos fixos formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...