Name: enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Vi erkänner alla USDA Wildlife Services personal som för närvarande eller har tidigare samlat Enhanced rabies övervakning prover och har genomfört DRIT för rabies diagnos. Likaså erkänner vi de många samarbetsvilliga som hjälper oss med förbättrad rabies övervakning insamling. Vi tackar också centra för sjukdomskontroll och förebyggande och Wistar Institute för tillgång till kritiska reagenser som krävs för att genomföra DRIT och för att tillhandahålla utbildningsmöjligheter. Dessutom uppskattar vi bekräftande diagnostik och tekniskt stöd som tillhandahålls av centra för sjukdomskontroll och förebyggande och av Wadsworth Center med New York State Department of Health. Användning av kommersiella produkter är endast i jämförelsesyfte och utgör inte stöd.

Varje person som utför rabies diagnostiska tester bör få en standard pre-exponering rabies vaccinationsserie och genomgå regelbunden serologisk antikropp utvärdering, med booster vaccinationer som behövs. Unimmunized personer bör inte gå in i laboratorier eller områden där sådant arbete bedrivs. All manipulering av vävnader och diabilder bör utföras för att inte aerosolisera vätskor eller producera luftburna partiklar. Rök kåpor behövs inte, men när det är möjligt kan de ge extra skydd mot lukt, ektoparasiter och benfragment. Minsta personliga skyddsutrustning, inklusive handskar och ögonskydd, bör bäras hela tiden under provtagning och provtagning.
1. hjärnstammen samling
<ol><li>Samla hjärnstammen prover antingen omedelbart efter slaktkroppen samling eller se till att slaktkroppar placeras i frysar för lagring tills senare provning. Om djurkadaver fryses, Tina vid omgivningstemperatur före hjärn stammens insamling för att underlätta insamlingen. Under vissa omständigheter samlas proverna in direkt från ett fryst djur.</li>
	<li>
För djur som är nyinsamlade eller har tinats till omgivningstemperatur, placera djuret liggande på en plan yta med halsryggen något vriden mot granskaren. Palpate att identifiera atlanto-occipital gemensamma på den laterala aspekten av halsryggen.
	<ol>
<li>För slaktkroppar som fortfarande är helt frysta, placera djuret liggande enligt beskrivningen ovan, om det är praktiskt. Använd sågar, knivar, bensaxar eller liknande utrustning för att helt separera huvudet från kroppen. Anmärkning: All utrustning som används som inte är engångsanvändning bör rengöras grundligt mellan proverna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Med hjälp av en skalpell blad, göra ett snitt på nivån av atlanto-occipital gemensamma vid den ventrala aspekten, skära igenom alla lager av muskler och mjuk vävnad, inklusive luftstrupen och matstrupen. Fortsätt tills approximera främre aspekten av cervikal ryggrad Kotor. För fryst vävnad, Använd en skalpell blad för att avlägsna eventuella kvarvarande lager av muskler och mjuk vävnad att exponera foramen magnum.</li>
	<li>Flytta huvudet av djuret till slut-Range förlängning tills hjärnstammen är synlig. Använd en skalpell blad för att ta bort alla synliga hjärnstammen/centralanervsystemet (CNS) vävnad för provtagning. För ett fryst prov, Använd en skalpell blad för att ta bort så mycket av den frysta hjärnstammen/CNS vävnad som möjligt inifrån skallen.</li>
	<li>Placera hjärnstammen proverna i en okrossbar behållare (dvs. metallsalva tenn, Cryo-Vial, etc.) och etikett i enlighet med detta.</li>
	<li>Se till att hjärnstammen-proverna testas omedelbart efter uppsamling via Drit-provet, kylda (4 ° c) i upp till 24 timmar före provningen, eller frysta (-20 ° c) fram till testets gång om provningen kommer att äga rum mer än 24 timmar efter prov insamlingen.</li>
</ol>2. beredning av material för DRIT
<ol><li>
Inställning av 10 bild färgning rätter (figur 1) Anmärkning: Infärgning rätter är tillräckligt djupa för att möjliggöra fullständig nedsänkning av Slide (diameter 96 mm, höjd 72 mm, djup 42 mm, volym 250 mL). 6<ol>
<li>Fyll skålen 1 med 10% fosfatbuffrad formalin. Ersätt formalin efter 2 testkörningar eller veckovis.</li>
		<li>Fyll rätter 2, 4 och 5 med fosfatbuffrad saltlösning med 1% Tween-80 (TPBS). Ersätt med färskt TPBS före varje test.</li>
		<li>Fyll skålen 3 med 3% väteperoxid. Byt ut väteperoxid före varje test.</li>
		<li>Fyll rätter 6, 8, 9 och 10 med destillerat eller avjoniserat vatten. Byt vatten före varje provning.</li>
		<li>Fyll skålen 7 med gälar hematoxylin formulering #2 utspädd i en 1:1 förhållandet i destillerat vatten6. Ersätt hematoxylin efter 2 provkörningar eller veckovis. Anmärkning: Enligt den ursprungliga DRIT protokoll som utvecklats av CDC12, en 1:2 förhållandet mellan gälar hematoxylin till vatten kan användas om motfärgning är för mörkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beredning av amino-etylcarbazole (AEC) stamlösning
	<ol>
<li>Använd en glaspipett och placera 5 mL N, N-dimetylformamid i en glasbehållare.</li>
		<li>Tillsätt 1 20 mg tablett 3-amino-9-etylcarbazole och skaka tills den är helt upplöst. Märk burken med "AEC lager" och det datum då beståndet gjordes. Anmärkning: AEC-lagerlösningen kan förvaras under kylning (4 ° c) och användas under 1-2 månader.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beredning av AEC-arbetsutspädning
	<ol>
<li>Tillsätt 7 mL acetatbuffert till ett 15 mL centrifugerör.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 mL av AEC-lagerlösningen till centrifugerröret med hjälp av en glaspipett.</li>
		<li>Tillsätt 0,075 mL 3% väteperoxid till röret.</li>
		<li>Filtrera lösningen med en 10 mL spruta med ett spruta filter på 0,45 μm. Anmärkning: AEC-arbetsutspädningen bör skapas strax före varje DRIT-test eftersom den endast är stabil för 2-3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. direkt snabb immunohistokemi test
<ol><li>
Etikett glas Mikroskop diabilder med ett unikt nummer för varje preparat med en smutskastnings säker, vattentät, permanent bläck markör.
	<ol>
<li>Använd en skalpell blad, ta bort hjärnstammen från behållaren och placera på pappershandduk. Försiktigt blot bort allt överskott av vätska, blod, eller päls med en andra pappershandduk för att avslöja bara hjärnstammen vävnad13. Om det behövs, avsnitt hjärnstammen vävnad att avslöja ett tvärsnitt.</li>
		<li>Tryck mycket försiktigt på Mikroskopbilden till tvärsnittet av hjärnstammen vävnad. Peka på bilden till hjärnstammen på flera punkter utan lateral förflyttning för att tillåta flera områden av hjärnstammen att överföras till bild13. Se till att endast 1 eller 2 lager av celler överförs från hjärnvävnaden till bilden med en mild beröring. Ingen monteringsmedel behövs för att fästa hjärnstammen vävnad till bilderna. Inkludera både en positiv och negativ kontroll i varje DRIT-körning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Låt bilderna lufttorka i ca 5 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Sänk ned diabilderna i 10% buffrad formalin i 10 min (skålen 1).</li>
	<li>Ta bort glasen från formalin och doppa-skölj i en lösning av TPBS (skålen 2).</li>
	<li>Sänk ned bilderna i 3% väteperoxid i 10 min (skålen 3).</li>
	<li>Ta bort bilderna från väteperoxid och doppa-skölj i färskt TPBS (skålen 4). Efter avlägsnande av överskott väteperoxid, placera bilderna i färskt TPBS (skålen 5) och arbeta med en bild i taget medan de andra bilderna stanna nedsänkt i TPBS.</li>
	<li>Ta bilderna från TPBS (skålen 5) en i taget, skaka av och blot överflödig buffert, och placera på en fuktad pappershandduk på Lab bänk, som grund för en "fuktighet kammare". Med hjälp av en pipett, släpp tillräckligt primär anti-rabiesvirus antikropp på varje bild för att täcka CNS vävnad. Inkubera glidskenorna i 10 minuter i fuktighets kammaren (dvs. täcka diabilder med bra plåtar eller annat enkelt skydd medan de lägger på den fuktade pappers handduken) i rumstemperatur (figur 2).</li>
	<li>Ta bort glasen från fuktkammaren, skaka och torka bort överflödigt konjugat och doppa-skölj bilderna i TPBS (återanvända samma TPBS i skålen 5).</li>
	<li>Arbeta med en bild i taget medan andra stannar nedsänkt i TPBS – Använd en pipett för att släppa tillräckligt med streptavidin-peroxidaskomplex för att täcka CNS-vävnaden. Inkubera i fuktighets kammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort bilderna från fuktkammaren, skaka och torka av överflödigt komplex, och doppa-skölj bilderna i TPBS (skålen 5).</li>
	<li>Arbeta med en bild i taget, skaka av dig och torka av överflödig buffert, medan andra stannar nedsänkt i TPBS – Använd en pipett för att släppa tillräckligt med AEC (beredning förklaras ovan och bör göras omedelbart före användning) för att täcka CNS vävnad. Inkubera i fuktighets kammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Doppa-skölj glasen i destillerat vatten (skålen 6).</li>
	<li>Placera bilderna i motfärgning av gälar hematoxylin (utspädd 1:1 med destillerat vatten) för 2 min (skålen 7).</li>
	<li>Skölj genast alla bilder i destillerat vatten (skålen 8). Upprepa två gånger med friskt dricksvatten varje gång (rätter 9 och 10).</li>
	<li>Arbeta med en bild i taget medan andra stannar nedsänkt i destillerat vatten (skålen 10) — skaka och torka av överflödigt vatten och Använd ett vattenlösligt monteringsmedium för att fästa en täckslip.</li>
	<li>Använd ett ljusmikroskop med en 20x målsättning att visa bilderna och en 40x mål om närmare inspektion behövs.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 23, (1996).</li><li>Durr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+diagnosis+for+developing+countries.">Rabies diagnosis for developing countries.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206 (2008).</li><li>Rupprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).</li><li>Rupprecht, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Progress+in+the+Development+and+Application+of+a+Direct,+Rapid+Immunohistochemical+Test+for+Rabies+Diagnosis.">Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis.</a> Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).</li><li>Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+public+health+impact+of+rabies.">Estimating the public health impact of rabies.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , (2016).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Testing+into+Large-Scale+Wildlife+Rabies+Surveillance.">Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21 (2017).</li><li>Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biotinylated+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+an+evaluation+of+a+direct+rapid+immunohistochemical+test+for+the+routine+diagnosis+of+rabies+in+southern+Africa.">Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189 (2014).</li><li>Kirby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+to+Support+Effective+Oral+Rabies+Vaccination+of+Raccoons+in+the+Eastern+United+States.">Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34 (2017).</li><li>Slate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+rabies+vaccination+in+north+america:+opportunities,+complexities,+and+challenges.">Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549 (2009).</li><li>. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols Available from: <a target="_blank" href="https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr">https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr</a> (2019)</li><li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

DRIT är en flexibel metod lämpad för fältbaserad övervakning för att upptäcka förekomst av rabiesvirus som kan användas i decentraliserade laboratorie områden. Även om det är möjligt att genomföra hela testet i en fältbaserad inställning som på bakluckan på en lastbil, är det idealiskt att ha en liten, inomhus utrymme dedikerad för DRIT på grund av kemisk, utrustning och leverans lagring frågor. Dessutom måste efterlevnad av alla tillämpliga federala, statliga och lokala lagar, och förordningar för kemisk användning och bortskaffande beaktas. För närvarande USDA WS har 15 DRIT anläggningar för att testa prover från 17 stater. Den USDA WS DRIT anläggningar är etablerade i samband med universitet och statliga folkhälso laboratorier, i utsedda rum inom större anläggningar och i slutna släpvagnar som har eftermonteras och konverteras för att fungera som mobila provnings enheter i händelse av ett akut utbrott svar där förstärkt rabies övervakning tester med omedelbar handläggningstid är kritisk (figur 5).
Medan testet har varit framgångsrik med hjälp av hjärnstammen material av varierande kvalitet, färsk hjärnstammen vävnad utan vävnadsnedbrytning är optimal. Som nedbrytning, uttorkning, eller kondensering inträffar, prov kvalitet minskar och testet kan upptäcka mer ospecifik färgning som kan förvirra resultat. Denna observation är likartad mellan DFA och DRIT2. Hjärnstammen/CNS ska samlas in så snart som möjligt och därefter förvaras fryst (-20 ° c) tills det testas.
Typiskt, mest USDA WS anläggningar process från 12 till 24 bilder på en gång under en DRIT session, inklusive en positiv kontroll och en negativ kontroll som har bekräftats via DFA. Positiva och negativa kontroller ger en referenspunkt för varje DRIT-körning för att säkerställa att testet lyckades och för att bekräfta om tolkningsfrågor uppstår på test bilderna. Om ett prov inte är fastställt att ha ett klart positivt eller negativt resultat, är det märkt som en obestämd och testas en andra gång av DRIT. Om detta prov inte är en klar positiv eller negativ efter två DRIT-tester, skickas det till ett referenslaboratorium för DFA eller liknande tester.
Som med alla diagnostiska test, "Trouble skytte" är användbart med oväntade fynd. Till exempel, om en DRIT Run är misslyckad (dvs, den positiva kontrollen inte uppvisar + 3 eller + 4 Färgnings intensitet och antigen distribution), se till att alla kemikalier och reagenser inte har löpt ut. Vi har funnit att använda en nyligen öppnad flaska väteperoxid på minst en gång per vecka är till hjälp för att förhindra icke-specifik färgning genom oxidation av hjärnvävnaden. Dessutom rekommenderar vi att ersätta acetat buffert minst en gång per år minst, oavsett det angivna utgångsdatumet.
Det finns ett antal fördelar med DRIT över DFA inklusive lägre kostnader, förmåga att utföra testet utanför ett centraliserat laboratorium, behöver endast ljus mikroskopi i stället för ett fluorescerande Mikroskop, och den relativt enkla träningsprocessen för personer som administrerar och läser provet2,3,4. Dessa fördelar, tillsammans med känslighet och specificitet av Drit som är jämförbara med DFA2,7,8,9 har redan bevisat att testet fungerar som ett viktigt verktyg i stor skala förbättrad rabies övervakningsprogram8,10 i Nordamerika. Dessutom har DRIT potential att möjliggöra ökad övervakning och mer snabba tester i utvecklingsländer eller andra områden med begränsade resurser, särskilt efter senaste OIE/WHO vägledning som ett rekommenderat test.

Medan DFA är den mest använda test för rutinmässig rabies diagnos1, kostnaden för att köpa och underhålla ett fluorescerande Mikroskop kan vara att begränsa till utvecklingsländer2,3,4 och för breda, storskaliga förbättrade rabies övervakningsprogram3,4. Dessutom kräver DFA förmåga att kyla prover under fixering och att Inkubera prover över omgivningstemperaturen under antikropp-antigenreaktioner, vilket kan vara ett betydande hinder i länder utan lämplig infrastruktur. Delvis på grund av de begränsningar som är förknippade med modern DFA-testning, har den globala effekten av rabies länge underskattats5.
I detta avseende finns det ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra övervakningen av rabies globalt, särskilt i utvecklingsländerna. Det DRIT-protokoll som presenteras här erbjuder ett laboratorium eller fältbaserat testalternativ till DFA som använder ljusmikroskopi och inte kräver kylning eller laboratorieinkubering under provningen6. Den DRIT och DFA är liknande i att båda teknikerna använder Touch intryck av hjärnan prover som samlats in från potentiellt rabiat djur. Emellertid, det första steget i DRIT använder formalin som en historisk fixativ för prover, som inaktiverar rabiesvirus. Detta ger en betydande biosäkerhet förbättring jämfört med aceton används för att fastställa prover i DFA protokoll3, vilket är viktigt inte bara i laboratoriet, men kanske ännu mer i fält-baserade eller decentraliserade labbmiljöer. Hittills visar Drit känslighet och specificitet lika med DFA2,7,8,9.
Sedan 2005, den USDA WS programmet har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser i Nordamerika med hjälp av DRIT som en del av ett omfattande djurliv rabies Management program10. Förbättrad rabies övervakning används som ett komplement till exponeringsbaserad folkhälsoövervakning och tester främst djurlivet meso-Carnivore arter, inklusive tvättbjörnar (Procyon lotor), randig skunkar (Mephitis Mephitis), grå rävar ( Urocyon cinereoargenteus), Rödrävar (Vulpes vulpes) och Coyotes (Canis latrans) som inte har varit inblandade i exponering av människor eller husdjur. Djurkroppar som används i tester lämnades in till USDA WS genom förbättrad rabies övervakning insatser och omfattade rabies vektor arter som är: sjuk eller konstig agerar; hittats döda, väg-dödade, eller en olägenhet; och inte är förknippade med exponering av människor eller husdjur. Den DRIT ger en rabies diagnostiska test som kan användas av utbildad fältbiologer med liten eller ingen laboratorie erfarenhet för att förbättra rabies övervakning och minska den ekonomiska bördan och arbetsbördan för folkhälso diagnostiska laboratorier10. Den grundläggande DRIT utbildning för USDA WS fält anställda tar vanligtvis 1,5 till 2 dagar, vilket inkluderar cirka 4 h av klassrummet undervisning som omfattar grundläggande principer för biosäkerhet, metoder för provtagning och DRIT processer samt > 8 h av laboratorie tid som utför provet. Utbildningsmöjligheter har varit tillgängliga för USDA WS och program samarbetsvilliga genom centra för sjukdomskontroll och prevention (CDC), Lyssa LLC, och Wistar Institute.
Inom strategisk ledning områdena, USDA WS har provat över 94 000 Wildlife proverna användande den DRIT och har upptäckt mer än 1 850 rabiat proverna så pass skulle har sannolik bort oupptäckt förlitande bara på exponeringsbaserat allmänhet hälsa provande av misstänkt djuren. Enhanced rabies övervakningsdata från DRIT resultat är avgörande för att ge en mer komplett tidsmässiga och rumsliga representation av rabies på landskapet till stöd för muntliga rabies vaccinationsprogram för vilda djur i hela USA10, 11. Likaså Provincial Wildlife byråer i Kanada har införlivat DRIT i storskaliga djurlivet rabies övervakning insatser tillsammans med sina folkhälsoprogram med framgång8. Både USDA WS och kanadensiska DRIT övervakningsprogram har använt nationella referenslaboratorier för att bekräfta rabies av DFA och utföra viral variant skriva som lämpligt8. Dessutom USDA WS fältbiologer skicka 10% av negativa prover för DFA bekräftelse till referenslaboratorier och sedan 2008, har deltagit i halvårsvis DRIT kompetenstest som tillhandahålls av Wisconsin State Laboratory of hygien, som en del av standard kvalitetssäkringsåtgärder.
Målet med denna metod är att erbjuda en alternativ metod för testning av rabies diagnostiska tester som kan göras i decentraliserade laboratorier, på fältet, eller i områden utan rutinmässig tillgång till elektronmikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td>
			<td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td>
			<td>PN110</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-823-2A</td>
			<td>BD Manufacturer Number 309604</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01BLU</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>12-553-465</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 2975246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>07-200-300</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 4863</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>08-772-5</td>
			<td>Corning Manufacturer Number 353910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>09-719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>14-827-122</td>
			<td>Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>102092-122</td>
			<td>Fluoro-Gel Substitute for BioMeda&#8482; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, Buffered, 10%, 4L</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Available each or in case of 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF9930E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>SH30256LS</td>
			<td>Alternative dry powder product can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 3%</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Microscope Objective 20X and 40X</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G</td>
			<td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td>
			<td>EF8481</td>
			<td>Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)</td>
			<td>AMD Next (www.amdnext.com)</td>
			<td>999112314</td>
			<td>Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>D119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL</td>
			<td>SeraCare (https://www.seracare.com/)</td>
			<td>5550-0001</td>
			<td>KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-1</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-10</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>7078D-5</td>
			<td>VWR Manufacturer Number 89091-484</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>22-050-201</td>
			<td>Thermo Scientific Manufacturer Number 72504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders, 24-place</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-868</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Tin Boxes, 1/2oz</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>101412-452</td>
			<td>Supplemental equipment for storage of brain tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taylor 2-Event Digital Timer/Clock</td>
			<td>Multiple Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide Staining Kit</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>25608-902</td>
			<td>Sakura&#174;Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL</td>
			<td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Also available in 25mL, 1L and 1G volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>53497-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>89038-272</td>
			<td>Supplemental equipment for proper PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Deionized (20L)</td>
			<td>VWR, part of Avantor (https://vwr.com)</td>
			<td>10806-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL</td>
			<td>Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)</td>
			<td>06-408C</td>
			<td>DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm</td>
			<td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td>
			<td>2-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G</td>
			<td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td>
			<td>1147T01WHT</td>
			<td>Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test

Laboratoriebaserad övervakning är integrerad för att förebygga, kontrollera och förvalta rabies. Medan DFA är guldmynt standard för rabies diagnos, det finns ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra rabies övervakning, särskilt i utvecklingsländer. Här presenterar vi ett standardprotokoll för DRIT som ett alternativt, laboratorium eller fältbaserat testalternativ som använder ljusmikroskopi jämfört med DFA. Tryck intryck av hjärnvävnad som samlats in från misstänkta djur är fast i 10% buffrad formalin. Den DRIT använder rabies virusspecifika monoklonala eller polyklonala antikroppar (konjugerat till biotin), en streptavidin-peroxidas enzym, och en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-etylkarbazol) att upptäcka viral inneslutningar inom infekterade vävnad. I cirka 1 h, ett hjärnvävnad prov kan testas och tolkas av DRIT. Utvärdering av misstänkta djur hjärnor testas från en mängd olika arter i Nordamerika, Asien, Afrika och Europa har illustrerat hög känslighet och specificitet av DRIT närmar sig 100% med resultat jämfört med DFA. Sedan 2005, Förenta staternas Department of Agriculture ' s Wildlife Services (USDA WS) program har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser med hjälp av DRIT att testa > 94000 prover som samlats in från vilda djur i strategiska områden rabies förvaltning . Den DRIT ger ett kraftfullt, ekonomiskt verktyg för rabies diagnos som kan användas av laboratorierna och fältbiologer att förbättra nuvarande rabies övervakning, förebyggande och kontrollprogram globalt.

Positiva resultat från Drit visar röda intracytoplasmatisk viral inkluderingar som kan variera i form och storlek (figur 3) i cytoplasman hos blåaktiga cell kroppar. Inneslutningar verkar släta med mycket ljusa marginaler och en mindre intensivt färgade centrala området. Intensitet och antigen fördelning registreras när inneslutningar upptäcks. Intensitet graderas från + 4 till + 1. Den positiva kontroll bilden bör ha en intensiv, skriande Magenta briljans som kallas en + 4 intensitet. En liten förlust av färg kan förekomma särskilt när provhantering inte har varit optimala (dvs., prov vävnad har sönderdelas något) och dessa bör bedömas som + 3. Märkbart tråkig fläck är graderat så en + 2 till + 1, är inte betraktat som diagnos för rabiesvirus infektion och är märket så obestämd.
Dessutom är antigen distribution graderad från + 4 till + 1 med + 4 representerar antigen distribution består av ett överflöd av stora och små inneslutningar varierande i storlek och form, och förekommer i varje fält (eller nästan alla fält) av syn inom CNS vävnad Tryck på exponering. Den positiva kontrollen har normalt en + 4-antigen fördelning. En antigen fördelning av + 3 skulle tilldelas när det finns inneslutningar i en mängd olika storlekar i de flesta men inte alla av de områden av syn. Om inneslutningar påträffas i 10%-50% av Mikroskop fälten, tilldelas en + 2-antigenfördelning. När inneslutningar påträffas i < 10% av Mikroskop fälten tilldelas en + 1-antigenfördelning.
De flesta CNS-vävnad med rabiesvirus uppvisar typiska virala inkluderingar graderade som + 3 eller + 4 intensitet och antigen distribution. Om resultaten indikerar a + 2-eller + 1-intensitet eller a + 2 eller + 1-antigendistribution, deklareras provet som obestämt och upprepade tester är befogade. Om samma prov har ett upprepat obestämt testresultat, skall provet sändas till ett referenslaboratorium för DFA eller därtill hörande bekräftande test.
Ett test prov med hjälp av DRIT anses negativt för rabiesvirus antigener efter att bilden som innehåller CNS-vävnaden har skannats med en förstoring på 200X eller mer och inga typiska virus inkluderingar upptäcks (figur 4). Negativa prover uppvisar blåaktiga cell kroppar med liten eller ingen ospecifik färgning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> Bild 1: inställning av 10 bild färgning rätter med reagens för testning. Rätterna är märkta med reagensnamn i den ordning som behövs för att följa protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> Figur 2: enkel fuktighets kammare skapad med våt pappershandduk och cellodlingsplattor.  En enkel fuktighets kammare med hjälp av en våt pappershandduk och cellkultur plattor möjliggör fältbaserad applikation.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> Figur 3: representativa diabilder av rabies positiva virala inkluderingar med + 4 intensitet och + 4 antigen fördelning. (A och B) visar positiva rabies viral inneslutningar på 200x förstoring. (C och D) visar positiva rabies viral inneslutningar på 400x förstoring. Skalstreck = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> Figur 4: representativa diabilder av negativa prover utan rabiesvirus inneslutningar. (A och B) Visa prover negativa för rabies viral inneslutningar på 200x förstoring. (C och D) Visa prover negativa för rabies viral inneslutningar på 400x förstoring. Skalstreck = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> Figur 5: representativa fotografier av DRIT-testanläggningar som används av USDA ws. A) mobil provningsanläggning i en sluten släpvagn för transport. B) fritidsfordon som eftermonteras för Drit-provning. (C) Drit provningsanläggning i samarbete med Universitetslaboratoriet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test at JoVE.com

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Förbättrad rabies övervakning med hjälp av en direkt snabb immunohistokemisk test

Den direkta Rapid immunohistokchemical test (DRIT) erbjuder en världsorganisation för djurhälsa och Världshälsoorganisationen (OIE/WHO) erkänt alternativ till den direkta fluorescerande antikropp (DFA) test för rabies diagnos. Detta test gör det möjligt för fältbaserade program som kan utföras i cirka 1 h på hjärnan intryck med hjälp av ljus mikroskopi.

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRIT är signifikant eftersom det ger ett rabiesdiagnostiskt test som kan utföras i decentraliserade laboratorier på fältet eller i områden utan rutinmässig tillgång till elektronmikroskopi. Den största fördelen med DRIT är att det utnyttjar endast enkel ljusmikroskopi och resultaten kan erhållas på cirka en timme. DRIT ger ett kraftfullt ekonomiskt verktyg för rabiesdiagnos som kan användas av laboratorie- och fältbiologer för att förbättra rabiesövervakning, förebyggande och kontrollprogram globalt.För djur som är nyuppsamlade eller har tinats upp till omgivningstemperatur, placera djurets rygg på en plan yta med halsryggen något roterad mot granskaren. Palpate att identifiera atlanto-occipital gemensamma på laterala aspekten av massundersökning ryggen. Med hjälp av en skalpell blad, göra ett snitt på nivån för atlanto-occipital leden vid den ventrala aspekten skär genom alla lager av muskel och mjuk vävnad inklusive luftstrupe och matstrupe.Fortsätt tills approximera den främre aspekten av halsryggen kotor. Flytta sedan djurets huvud till en slutområdesförlängning tills hjärnstammen är synlig. Använd ett skalpellblad för att ta bort alla synliga hjärnstammen och centrala nervsystemet vävnad för prov.Placera hjärnstammen prover i en okrossbar behållare och etikett därefter. Först anges färgning rätter som är tillräckligt djupa för att möjliggöra fullständig nedsänkning av ett prov bild. Fyll skålen en med 10%fosfat buffrad formalin.Fyll disk två, fyra och fem med TPBS. Fyll skålen tre med 3%väteperoxid. Fyll sedan disk sex, åtta, nio och 10 med destillerat eller avjoniserat vatten.Fyll skålen sju med Gills hematoxylinformulering nummer två utspädd i ett 1:1-förhållande med destillerat vatten. För att förbereda amino-etyl-karbazol stamlösning, med hjälp av en glaspipett, placera fem milliliter N, N-dimetylformamid i en glasbehållare. Tillsätt 120 milligram tablett av 3-amino-9-etylkarbazol till glasbehållaren och skaka tills den är helt upplöst.För att förbereda AEC arbetsutspädningen, tillsätt sju milliliter acetatbuffert till ett 15 milliliter centrifugrör. Använd en glaspipett för att lägga till 0,5 milliliter AEC-stamlösning till centrifugröret. Tillsätt 0,75 milliliter av 3%väteperoxidlösning.Använd en 10 milliliter spruta med ett 0,45 mikrometersprutfilter för att filtrera lösningen. Till att börja med, använd en utstryksäker vattentät permanent bläck markör för att märka glas mikroskop diabilder med ett unikt nummer för varje exemplar. Använd en skalpell blad för att ta bort hjärnstammen från behållaren och placera den på en pappershandduk.Använd en andra pappershandduk för att försiktigt blot bort eventuellt överskott av vätska, blod eller päls för att avslöja bara hjärnstammen vävnaden. Om det behövs, sektioner hjärnstammens vävnad för att avslöja ett tvärsnitt. Mycket försiktigt röra mikroskopet glida till flera punkter i hjärnstammen utan lateral rörelse för att tillåta flera områden av hjärnstammen som skall överföras till bilden se till att endast ett eller två lager av celler överförs från hjärnvävnaden till bilden.Låt rutschkanorna lufttorka i ungefär fem minuter i rumstemperatur. Sänk sedan ner bilderna i 10%-buffrad formalin i maträtt ett i 10 minuter. Ta bort objektglasen från formalin och doppa skölj dem i TPBS-lösningen i fat två.Doppa de sköljda objektglasen i den väteperoxidlösning som finns i skålen tre i 10 minuter. Efter detta, ta bort objektglasen från väteperoxiden och doppa skölj dem i den färska TPBS som finns i skålen fyra. När du har tagit bort eventuellt överskott av väteperoxid, placera objektglasen i den färska TPBS som finns i skålen fem.Ta bilderna en i taget från skålen fem, skaka av och blot eventuellt överskott buffert och placera bilden på en fuktad pappershandduk på labbet bänken. När alla objektglas har överförts, använd en dropper eller pipett för att släppa tillräckligt med primära anti-rabies virus antikropp på varje objektglas för att täcka CNS vävnaden. Täck objektglasen med brunnsplattor eller ett annat enkelt lock för att skapa en fuktighetskammare och inkubera objektglasen i rumstemperatur i kammaren i 10 minuter.Efter detta, ta bort bilderna från luftfuktigheten kammaren, skaka och blot bort eventuellt överskott konjugat och doppa skölja bilderna i TPBS i skålen fem. Arbeta med en bild i taget, ta bort en bild från TPBS och använda en dropper eller pipett för att släppa tillräckligt Streptavidin peroxidas komplex för att täcka CNS vävnad. När alla diabilder har täckts in, inkubera dem i luftfuktighetskammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.Ta sedan bort bilderna från fuktighetskammaren, skaka och blot bort eventuellt överskott komplex och doppa skölj diabilderna i TPBS som finns i skålen fem. Arbeta med en bild i taget, ta bort en bild från TPBS och använd en pipett för att släppa tillräckligt AEC arbetslösning för att täcka CNS vävnad. Inkubera rutschkanorna i fuktighetskammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.Efter detta, doppa skölja diabilderna i destillerat vatten som finns i skålen sex och placera dem i en counterstain av Gills hematoxylin i skålen sju i två minuter. Omedelbart doppa skölj alla av diabilder i destillerat vatten i skålen åtta. Upprepa detta två gånger med hjälp av sötvatten i rätter nio och 10 för varje tvätt.Arbeta en bild i taget, ta bort en rutschkana från vattnet och skaka och blot bort eventuellt överflödigt vatten. Använd ett vattenlösligt monteringsmedium för att fästa ett täckskydd på objektglaset. Använd sedan ett ljusmikroskop med ett 20X-mål för att visa bilderna.Positiva resultat från DRIT visar röda intracytoplasmic viral införanden som kan variera i form och storlek inom cytoplasman av blåaktig cell organ. Inklusionerna verkar jämna med mycket ljusa marginaler och ett mindre intensivt färgat centralt område. Antigenfördelningen graderas från plus fyra till plus en med plus fyra som representerar antigenfördelning som består av ett överflöd av stora och små inneslutningar som varierar i storlek och form och förekommer i varje synfält inom CNS-vävnadstoset.En fördelning av plus tre tilldelas när det finns inkluderingen i en mängd olika storlekar i de flesta men inte alla av synfälten. Om inneslutningar hittas i 10 till 50%av mikroskopfälten, tilldelas en plus två antigenfördelning medan plus en tilldelas när inneslutningar finns i mindre än 10% av fälten. De flesta CNS vävnader med rabies virus närvarande uppvisar typiska virala inneslutningar graderas som plus tre eller plus fyra intensitet och antigen distribution.Om resultaten tyder på ett plus ett eller plus två i antingen intensitet eller antigenfördelning, deklareras provet som en obestämd och upprepad testning är befogad. Ett testprov med DRIT anses vara negativt för rabiesvirusantigener efter det att det objektsglas som innehåller CNS-vävnaden skannats med en förstoring på 200X eller större och inga typiska virusinkludningar upptäcks. Negativa prover uppvisar blåaktiga cellkroppar med liten eller ingen känd specifik färgning.Varje person som genomför rabiesdiagnostik bör få standardvaccinationer av rabies före exponering och genomgå regelbunden serologisk antikroppsutvärdering. Ickeimmuniserade individer bör inte komma in i områden där sådant arbete bedrivs. Förutom de försiktighetsåtgärder som vidtas vid arbete med levande rabiesvirus är flera av de reagenser som används i testet farliga.Se säkerhetsdatabladen för varje reagens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Övervakning av aviär influensa med FTA-kort: Metoder Field, biosäkerhet och frågor Transport Löste

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En snabb strategi för isolering av nya Faustoviruses från miljöprover Använda<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Använda förbättrade grön fluorescens Protein-uttryckande Escherichia Coli att bedöma mus Peritoneal makrofag fagocytos

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR för rabies diagnos

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Fält Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test för resursbegränsade inställningar med ytterligare molekylära tillämpningar

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunohistokemitest för lyssavirusantigendetektering från formalin-fasta vävnader

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...