Name: standard operating procedure for lyssavirus surveillance of the bat population in taiwan
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00
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Ringraziamo Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai e Ya-Lan Li per la loro assistenza durante questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) del Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

1. Precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei lyssavirus
<ol><li>Assicurarsi che tutti i lavoratori di laboratorio che gestiscono campioni di pipistrelli ricevano la profilassi di pre-esposizione sulla pilma17. Monitorare i livelli di anticorpi della rabbia dei lavoratori in anticipo e riesaminarli ogni 6 mesi17. La vaccinazione antirabbica di follow-up è necessaria per coloro i cui livelli di anticorpi sono inferiori a 0,5 IU/mL17.</li...

<ol>
	<li>Kuzmin, I. V., Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+facts+about+lyssavirus.">Basic facts about lyssavirus.</a> Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. , 3-21 (2014).</li><li>Ar&#233;chiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lyssavirus+in+bat,+Spain.">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li><li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes,+Sri+Lanka.">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li><li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle,+Taiwan.">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li><li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland.">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li><li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+bats:+emergence+and+zoonotic+threat.">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li><li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat,+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh,+Northern+India.">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li><li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand.">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384 (1967).</li><li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission,+China.">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li><li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bat+lyssaviruses+(Aravan+and+Khujand)+from+Central+Asia:+phylogenetic+relationships+according+to+N,+P+and+G+gene+sequences.">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li><li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats,+the+Philippines.">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li><li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+for+bat+lyssaviruses,+Thailand.">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li><li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssavirus+surveillance+in+bats,+Bangladesh.">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li><li>Reynes, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats,+Cambodia.">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bat+lyssaviruses,+northern+Vietnam.">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li><li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China.">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).</li><li>Kaplan, M. M., Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+precautions+in+handling+rabies+virus.">Safety precautions in handling rabies virus.</a> Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. , 3-8 (1996).</li><li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bats+and+their+virome:+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans.">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li><li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , (1992).</li><li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+diversity+in+European+bats.">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li><li>Epstein, J. H., Field, H. E., Wang, L. F., Cowled, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthropogenic+epidemics:+the+ecology+of+bat-borne+viruses+and+our+role+in+their+emergence.">Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence.</a> Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. , 249-280 (2016).</li><li>. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019)</li><li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses.">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li><li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+(Pipistrellus+hesperus).">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li><li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S., Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+evaluation.">Diagnostic evaluation.</a> Rabies, 1st ed. , 307-349 (2002).</li><li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+(EBLV-2)+in+Norway.">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).</li><li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates.">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li><li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+diagnosis+of+rabies.">Laboratory diagnosis of rabies.</a> Rabies, 3rd ed. , 409-459 (2013).</li><li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories.">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).</li><li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains.">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li><li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis:+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+(fluorescent+antibody+test,+rabies+tissue+culture+infection+test,+mouse+inoculation+test)+and+molecular+biology+techniques.">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li></ol>

Questa procedura operativa standard di laboratorio (SOP) fornisce un processo seriale per testare campioni di pipistrelli per la presenza di antigeni lyssavirus a Taiwan. I passaggi chiave includono l'impiego di FAT e RT-PCR. Anche la selezione di campioni adatti e l'isolamento di successo del virus sono importanti. Inoltre, alcuni problemi è stata condotta durante il monitoraggio dei lissavirus pipistrello. La differenza principale era l'animale bersaglio. Inizialmente (2008-2009), gli animali bersaglio della sorveglia...

I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici. Ci sono almeno sette specie di lyssavirus associate a casi umani1. Oltre alle 16 specie di questo genere1,2,3, Taiwan pipistrello lyssavirus (TWBLV)4 e Kotalahti pipistrello lyssavirus5 sono stati recentemente identificati in pipistrelli, ma i loro stati tassonomici devono ancora essere determinato.
I pipistrelli sono i padroni naturali della maggior parte dei lissavirus, con l'eccezione di Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, che non sono ancora stati identificati in alcun pipistrelli1,2,3,6. Le informazioni sui lyssavirus nei pipistrelli asiatici sono ancora limitate. Due lissavirus non caratterizzati in pipistrelli asiatici (uno in India e l'altro in Thailandia)7,8 sono stati segnalati. Un caso di rabbia umana associato a un morso di pipistrello in Cina è stato segnalato nel 2002, ma la diagnosi è stata fatta solo dall'osservazione clinica9. In Asia centrale, Aravan lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dalle ere di topo minore (Myotis blythi) in Kirghizistan nel 1991, e Khujand lyssavirus è stato identificato nel pipistrello baffi (Myotis mystacinus) in Tagikistan nel 200110. In Asia meridionale, Gannoruwa pipistrello lyssavirus è stato identificato nella volpe volante indiana (Pteropus medius) in Sri Lanka nel 20153. Nel sud-est asiatico, diversi studi sierologici sui pipistrelli nelle Filippine, Thailandia, Bangladesh, Cambogia e Vietnam hanno mostrato una sieroprevalence variabile11,12,13,14, 15. Anche se Irkut lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dal muso tubolare maggiore (Murina leucogaster) nella provincia di Jilin, Cina nel 201216, le specie e le posizioni esatte dei lissavirus nelle popolazioni di pipistrelli dell'Asia orientale rimangono sconosciute.
Per valutare la presenza di lyssavirus nelle popolazioni taiwanesi di pipistrelli, è stato avviato un programma di sorveglianza che impiega sia il FAT diretto che il RT-PCR. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan è stato identificato in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus)4 nel 2016-2017. Nel presente articolo, viene introdotta una procedura operativa standard di laboratorio per la sorveglianza del virus lissavirus della popolazione di pipistrelli a Taiwan. Il diagramma di flusso della diagnosi di bat lyssavirus nel nostro laboratorio è presentato in Figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090046</td>
			<td>Trppsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>32201-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>97062-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td>NIHON SHIYAKU REAGENT</td>
			<td>NS-32294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic(100X)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BA215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemilumineance system</td>
			<td>TOP BIO CO.</td>
			<td>MGIS-21-C2-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>990381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube</td>
			<td>SSI</td>
			<td>2341-SO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td>
			<td>24505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA analyzer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>3700XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin</td>
			<td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td>
			<td>800-092</td>
			<td>FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Teflon-coating glass slide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>30-86H-WHITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Major Science</td>
			<td>MJ-105-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Trppsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ASTEC</td>
			<td>SCA-165DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>5100</td>
			<td>FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure Compact Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03731146001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03730964001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11430030</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06329.0500</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN*2332R9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-8912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer synthesis</td>
			<td>Mission Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing service</td>
			<td>Mission Biotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AA00008032E00MNT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile absorbent pad</td>
			<td>3M</td>
			<td>1604T-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>171-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase</td>
			<td>JMR Holdings</td>
			<td>JMR-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tongue depressor</td>
			<td>HONJER CO., LTD.</td>
			<td>122246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Tennyson medical Instrument developing CO., LTD.</td>
			<td>A0601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tylosin Tartrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6271-10G</td>
			<td>MEM-10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard operating procedure for lyssavirus surveillance of the bat population in taiwan

I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici, e almeno sette specie di lyssavirus sono associati a casi umani. Poiché i pipistrelli sono serbatoi naturali della maggior parte dei lissavirus, un programma di sorveglianza del lyssavirus di pipistrelli è stato condotto a Taiwan dal 2008 per capire l'ecologia di questi virus nei pipistrelli. In questo programma, organizzazioni non governative di conservazione dei pipistrelli e centri locali di controllo delle malattie animali hanno collaborato per raccogliere pipistrelli morti o pipistrelli che muoiono di debolezza o malattia. I tessuti cerebrali dei pipistrelli sono stati ottenuti attraverso necroscopia e sottoposti a test anticorpali fluorescenti diretti (FAT) e reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) per il rilevamento di antigeni lissavirus e acidi nucleici. Per il FAT, si raccomandano almeno due diverse diagnosi di rabbia. Per la RT-PCR, due serie di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) vengono utilizzati per amplificare una sequenza parziale del gene della nucleovirusproteina della lissa. Questo programma di sorveglianza monitora i lyssavirus e altri agenti zoonotici nei pipistrelli. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan si trova in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus) nel 2016-2017. Questi risultati dovrebbero informare il pubblico, gli operatori sanitari e gli scienziati sui potenziali rischi di contattare pipistrelli e altri animali selvatici.

Dal 2014 al maggio 2017 sono state raccolte 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie per la sorveglianza. Due sono risultati positivi. Nel primo caso di pipistrello, l'impronta cerebrale è risultata negativa utilizzando ilFAT con uno degli anticorpi commerciali anti-rabies coniugati FITC (Figura 2), mentre gli RT-PCR che impiegano ciascuno dei due set di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) hanno risultati positivi (Figura 3). È stata ottenuta una sequenza di a...

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Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Il lyssavirus è un agente patogeno zoo-no-tic. Per valutare la presenza di Lyssavirus nelle popolazioni di pipistrelli taiwanesi, abbiamo avviato un programma di sorveglianza. E ha identificato con successo quattro Lyssavirus dal 2016 al 2018.Questo protocollo è un'introduzione graduale alla sorveglianza vi-al lyssavirus a Taiwan. Speriamo che sarà utile per le ricerche che sono interessati alla sorveglianza vi-al Lyssavirus. È importante collegare il simbolo tac-keg corretto.Un pipistrello morto o morente è più adatto di un pipistrello vivo per la sorveglianza del Lyssavirus. A seconda delle norme di biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio;eseguire le seguenti procedure in un laboratorio adeguato a livello di biosicurezza. E assicurarsi che i ricercatori siano attualmente qualificati e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.Dopo la raccolta di pipistrelli o carcasse deboli o malati, un ecologista pipistrello identifica le specie di pipistrelli in base alle caratteristiche morfologiche dell'esemplare. Presentare una scheda informativa al laboratorio, che includa il sito di raccolta, le specie, i segni clinici e altri dati pertinenti con ciascun campione di pipistrello. Prima di iniziare la necroscopia, esaminare tutti gli orifizi esterni e fotografare le caratteristiche esterne dei pipistrelli, in particolare la testa, le orecchie e le ali per la differenziazione delle specie.Per raccogliere un campione di tampone orale posizionare il pipistrello in recumbency ventrale su una tavola di dissezione sterile e fissare la testa con una pinzetta. Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle lungo la linea mediana dell'area del polpaccio;e tirare la pelle ai lati laterali, per fare un'incisione nel cranio lungo la linea mediana della zona del polpaccio. Aprire il cranio con una pinzetta per esporre il tessuto cerebrale e utilizzare le pinzette per separare delicatamente il tessuto cerebrale dal tessuto nervoso collegato.Tagliare la sezione trasversale del cervello, incluso il tronco encefalico e il cervelletto, e toccare leggermente la superficie tagliata del tessuto cerebrale con diapositive di vetro per fare impressioni di striscio. Premere la diapositiva sul tessuto dell'obiettivo per rimuovere il tessuto in eccesso e fissare le diapositive di impronta di striscio in meno 20 gradi celsius acetone per 30 minuti. Quindi fissare un piccolo pezzo di tessuto cerebrale fresco, in formalina, per l'esame istopatologico.E posizionare il resto del tessuto in emi-em 10 per l'estrazione di acido nucleico. Successivamente, incidere la pelle dalla varietà all'ano lungo la linea mediana del corpo e utilizzare le pinzette per sollevare e separare la pelle e sottolineare i tessuti muscolari;per consentire la raccolta delle ghiandole salivari, situate vicino all'osso mandibolare. Sollevando leggermente lo sterno con le pinzette, utilizzare il bisturi per tagliare lo sterno e la parete addominale lungo la linea mediana e tagliare le claviole.Utilizzare aghi per fissare le gabbie toraciche sinistra e destra alla scheda di dissezione, per aprire la cavità toracica. E registra le legioni lorde e il grado di cambiamento post mortem. Quindi utilizzare le pinzette e il bisturi per rimuovere i tessuti viscerali a caso per l'analisi a valle pianificata.Per eseguire un test diretto degli anticorpi fluorescenti al termine della fissazione, asciugare le diapositive di impronta di striscio e selezionare almeno due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza per l'analisi. Filtrare un anticorpo su ogni diapositiva attraverso un colino da 0,45 micrometri. E incubare le diapositive per 30 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida.Al termine dell'incubazione, scolare il coniugato in eccesso e lavare gli scivoli con PBS. Quindi utilizzare un piccolo volume di 10%glicerolo per montare i coperchi sulle diapositive e immagini le diapositive mediante microscopia a fluorescenza. Quando il test degli anticorpi fluorescenti o l'analisi RT-PCR indicano positività, omogeneizzare il campione cerebrale nella sospensione del 10% nell'emi-en 10 e sedimentare i tessuti per centrifugazione.Inoculare 200 microlitri del super-nat-en con tre volte 10 al 6° neuroblastoma del topo e un millilitro di emi-en 10 per un'ora a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica. E trasferire la sospensione cerebrale a cellule omogenee in un pallone quadrato di 25 centimetri, contenente sei millilitri di emi-en fresco 10. A un millilitro di sospensione cerebrale a cellule omogenee in uno scivolo di vetro rivestito in Teflon a quattro pozzetti, con un diametro di sei millimetri e posizionare lo scivolo a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica per tre o quattro giorni.Dopo la fissazione con acetone al 100%, macchiare le diapositive con gli stessi due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza utilizzati per il test degli anticorpi a fluorescenza. E visualizzare le diapositive mediante microscopia fluorescente per determinare il numero di inclusioni intracida-plas-mic. Dopo aver tripistinato e sotto-coltivato la coltura cellulare inoculata secondo protocolli standard, restituire la coltura fredda all'incubatore di coltura cellulare per altri tre o quattro giorni con conteggio ripetuto del numero di cellule infette come appena dimostrato fino al raggiungere un'infettività del 100%.Da gennaio 2014 a maggio 2017, sono state raccolte per la sorveglianza 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie. In questa analisi rappresentativa di due casi di pipistrello positivi, l'impressione cerebrale è risultata negativa utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti con uno degli anticorpi antira rabbia coniugati commerciali e adatti, mentre l'RT-PCR che impiega ciascuno dei due diversi set di primer ha dato risultati positivi. La sottosezione della sequenza ampli-con ottenuta all'esecuzione di query nel database della banca gen ha rivelato che la sequenza era simile ai lissavirus con identità inferiori al 79% che supportano l'identità dei lissavirus rilevati.Due lissavirus sono stati successivamente isolati con successo dai due cervelli come confermato dal test e dal sequenziamento degli anticorpi a fluorescenza. Il passo chiave per determinare la positività del Lyssavirus sono il test degli anticorpi a fluorescenza e l'analisi RT-CPR. L'uso di due o più anticorpi anti-rabbia nei set di primer è altamente raccomandato.Oltre al Lyssavirus altri agenti patogeni dei pipistrelli zoo-non-ical possono essere monitorati utilizzando metodi diagnostici chiusi. I dati possono quindi essere utilizzati per informare il pubblico sull'evitare il contatto con i pipistrelli. Più siamo in grado di studiare il bat Lyssavirus, più saremo in grado di comprenderne l'evoluzione e l'impatto sulla salute pubblica.

Research

JoVE Journal

Environment

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Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Ricerca

Ambiente

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Pulire campionamento e analisi del fiume e di estuario Acque per Trace Studi di metallo

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

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Un apparato multistrato ultra-pulito per la raccolta di plancton marino dimensioni frazionato e particelle in sospensione

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

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Procedura ottimizzata per determinare l'adsorbimento di fosfonati su idrossido ferrico granulare utilizzando un metodo di determinazione del fosforo miniaturizzato

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

A Video Surveillance System to Monitor Breeding Colonies of Common Terns (Sterna Hirundo)

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A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

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