Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

ويشكر المؤلفون قسم علم الأمراض في هوبيتال يوروبين جورج بومبيدو ونكر (لورين تشامبول، إلودي ميشيل، وجيزيل لوليل)؛ ال [هتمولوج] منصة من [برك], [هوبيتل] [إيورن] [جورج] [بومبيدوو] ([كورين] [لسفرّ]); فيرجينيا كلارك للغة يحرّر; أليكساندرا البكيان لمساهمتها.

ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية الأخلاقية، وقد وافقت عليه اللجنة الأخلاقية (اللجنة المعنية بحماية الأشخاص في إيل دو فرانس- 2، #2015-09-04).
1. إعداد المواد
<ol><li>
إعداد 1x العازلة غسل
	<ol>
<li>إعداد 3 لتر من 1X غسل العازلة عن طريق إضافة 2.94 L من الماء المقطر وزجاجة واحدة (60 مل) م...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH التي أجريت مع عدة شراؤها هو أداة قوية للكشف عن النسخ الفيروسية ويشير إلى عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. يتم تنفيذها يدويًا، وخطوات البروتوكول سهلة المتابعة بشكل عام، والمجموعة التي تم شراؤها ملائمة. تسمح هذه التقنية بتلطيخ 19 عينة نسيجية بالإضافة إلى شريحة تحكم واحدة في آن...

فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو أداة قوية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة، والتي قد تكون حاسمة في الآفات الحميدة أو الخبيثة في مواقع مختلفة مثل البلعوم أو عنق الرحم. قد يساعد الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة في تشخيص الآفة الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري، وبالتالي يؤثر على علاجه وتشخيصه.
فيروس الورم الحليمي البشري هو العدوى المنقولة جنسيا الأكثر شيوعا، وأكثر من 100 الأنماط الجينية الفيروسية وقد وصفت1. ومن المعروف من الناحية التخطيطية، الأنماط الجينية المنخفضة الخطورة مثل النمطين الجينيين 6 و 11، أنها تحفز الثآليل التناسلية، وداء الورم الحليمي التنفسي المتكرر، والآفات الحميدة الأخرى، في حين أن الأنماط الجينية عالية الخطورة مثل الأنماط الجينية 16 و18 هي المسؤولة عن معظم سرطانات عنق الرحم والسرطان الشرجي وتلعب دورا في ONCOGENESIS HNSCC في نسب متغيرة كما هو الحال في البيانات الوبائية الإقليمية2.
تتوفر عدة أدوات للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. كما عدوى فيروس الورم الحليمي البشري عالية المخاطر يؤدي إلى التعبير عن البروتينات السرطانية الفيروسية E6 و E73، وينظر على نطاق واسع الكشف عن النسخ E6 و E7 كمعيار الذهب لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة4. يمكن إجراء فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH على عينات FFPE التي يتم الحصول عليها بسهولة تامة من المرضى الذين يعانون من مختلف الأمراض المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري. وقد تم تقييم أدائه اعلى في النيوبلج داخل الظهارة الحرشفية في عنق الرحم، وفتحه، والمهبل، وفي سرطان الخلايا الحرشفية الغازيةفي عنق الرحم، والقناة الأنجستية، والجهاز العلوي 5: يحقق حساسية أكثر من 98٪ بين فيروس الورم البلميري الحمض النووي (PCR) الحالات الإيجابية. هذا هو أفضل قليلا من p16 المناعية (93%) وفيروس الورم الحليمي البشري في التهجين في الموقع (DNA ISH: 97٪)، والتي هي أكثر شيوعا. في مجموعة أخرى من 57 مريضاً يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) الناشئة عن منطقة الرأس والرقبة، ومنطقة الأعضاء التناسلية، والجلد، والمسالك البولية، بالمقارنة مع فيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي يش، حققت فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH حساسية أفضل (100% مقابل 88%) والتحديد (87% مقابل 74%)6.
P16 المناعية هو علامة غير مباشرة تعكس اضطراب دورة الخلية التي قد تكون سبب (ولكن ليس حصرا) من قبل عدوى فيروس الورم الحليمي البشري4،7. هذا الاختبار الفعال من حيث التكلفة يمتلك حساسية جيدة وقيمة تنبؤية سلبية ويوصى به كعلامة بديلة للعدوى بفيروس الورم الحليمي البشري عالية الخطورة في سرطان البلعوم (OPC) من قبل كلية علماء الأمراض الأمريكية (CAP) والاتحاد الدولي مكافحة السرطان (UICC)8.
على الرغم من أن هذه الورقة تركز فقط على الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري في HNSCC، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH ذات الصلة سريريا في مختلف الظروف الأخرى التي تنطوي على عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. على سبيل المثال، قد تحسن هذه التقنية دقة تشخيص الآفات داخل الظهارية الحرشفية منخفضة الدرجة في عنق الرحم (LSIL، المعروف سابقا باسم الورم داخل الظهارة عنق الرحم، الصف 1 [CIN1]) للحالات الغامضة مورفولوجيا9. وفيما يتعلق بـ SCC البلعوم، يسمح فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH بتحديد SCC المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري، الذي يوصف بأنه متميز عن SCC البلعوم غير المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري في الطبعة الثامنة الأخيرة من تصنيف TNM لسرطان الرأس والرقبة (الاتحاد من أجل السرطان الدولي) التحكم [UICC])10. منذ فيروس الورم الحليمي البشري ذات الصلة SCC يعرض أفضل التكهن مع بقاء أطول وتعزيز العلاج الإشعاعي وحساسية العلاج الكيميائي من فيروس الورم الحليمي البشري غير ذات الصلة SCC11،12،13، قد يؤثر الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري إدارة المرضى14,15. إلى جانب ذلك، يمكن استخدام فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH لتشخيص سرطان الأنف متعدد الفينوتيش اتوبيس فيروس الورم الحليمي البشري مع إشارة أعلى من فيروس الورم الحليمي البشري DNA CISH16. تشير عدة تحليلات متعددة المتغيرات إلى أن الكشف عن النسخ من E6 و E7 يرتبط مع أفضل التكهن في SCC البلعوم عموما7،15،17،18 وفي مجموعة فرعية من p16 إيجابية البلعوم SCC19،20.
هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH التي أجريت على الشرائح FFPE مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) هي عامل خطر رئيسي لنوع فرعي من سرطان الخلايا الحرشفية البلعومية (OPSCC)، الذي يميل إلى أن يكون مرتبطاً بنتيجة أفضل من مكتب خدمات الرقابة على الكحول والتبغ. يمكن أن يسمح التهجين المُهجن في الموقع (CISH) من الحمض النووي الريبي الفيروسي HPV بالتقييم شبه الكمي للنسخ الفيروسية للبروتينات الأنجينية E6 وE7 وتصور في الموقع بدقة مكانية جيدة. تسمح هذه التقنية بتشخيص عدوى نشطة مع تصور نسخ فيروس الورم الحليمي البشري في الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري. ومن مزايا هذه التقنية تجنب التلوث من الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري غير اللابذية المجاورة للورم. وعموما، فإن أداء التشخيص الجيد لها قد اعتبر أن يكون المعيار الذهبي لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. منذ E6 و E7 تفاعل البروتين الفيروسي مع البروتينات الخلية pRb و p53 إلزامية لتحويل الخلايا، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو ذات الصلة وظيفيا ويعكس بشكل حاد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. هذه التقنية ذات صلة سريريا ً أيضاً لأن مستويات النسخ "المنخفضة" أو "العالية" لفيروس الورم الحليمي البشري ساعدت على تحديد مجموعتين من التكهنات بين مرضى سرطان الرأس والرقبة الإيجابيين بفيروس الورم الحليمي البشري. هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH تنفيذها على الشرائح البارافين المضمنة في الشكلين الثابتة (FFPE) مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. بدلاً من الوحي الكروموجيني، يمكن أيضاً أن يتم تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع مع الوحي الفلورسنت (RNA FISH). ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع المناعي التقليدي.

كما هو موضح هنا، في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة، يمكن اعتبار حالة إيجابية في وجود تلطيخ بونتيفورم البني في السيتوبلازم أو في نوى الخلايا السرطانية. في معظم الدراسات، تعتبر الإشارة إما "إيجابية" أو "لم يتم الكشف عنها"14. وقد تم الإبلاغ عن أساليب تنصف حجم الإشارة ولكنها ?...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

يعتبر فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) RNA الكرومي في الموقع التهجين ليكون واحدا من المعايير الذهبية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشط داخل الأورام. وهو يسمح بتصور التعبير فيروس الورم الحليمي البشري E6-E7 mRNA مع التعريب والتقييم شبه الكمي للإشارة.

تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH يسمح الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشط. منذ التهجين في الموقع يستهدف فيروس الورم الحليمي البشري RNA هذه التقنية يسمح التصور من النسخ النشط للفيروس. لديها دقة مكانية دقيقة وأداء تشخيص جيد.قد يدعم الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري تشخيص العديد من الآفات المرتبطة بـ HPV، مثل سرطان الخلايا الحرشفية الفموية أو البلعومي أو لأورام عنق الرحم. قد يكون لها أيضا تأثير على التكهن. بعد إعداد المخازن المؤقتة والكواشف المضادة للتلوين ، أعد كاشف استرجاع هدف واحد في beaker كبير عن طريق إضافة 70 ملليلتر من كاشف الاسترجاع المستهدف 10x إلى 630 ملليلتر من الماء المقطر.ضع كوب على لوحة تدفئة مع مُحرك مغناطيسي واغطيه بورق الألومنيوم. تغلي محتوياته في 100 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة مع التأكد من عدم غليه لأكثر من 30 دقيقة. لمنع نشاط البيروكسيديز على الشرائح مع أقسام الأنسجة سابقا deparaffinized ووضعها في رف الشريحة، إضافة أربع إلى ست قطرات، فقط بما يكفي لتغطية العينة، من بيروكسيد الهيدروجين إلى كل شريحة، واحتضان لهم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.اغسل الشرائح مرتين لمدة دقيقتين في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. لكسر حدود أنسجة الحمض النووي الريبي في أقسام الأنسجة RNA، أولا إزالة رقائق الألومنيوم من الغليان واحد × TRR باستخدام مخلب، ووقف التحريك. اغمر رف الشريحة ببطء وبعناية فائقة.غطي كوبه مرة أخرى مع رقائق الألومنيوم، واحتضان لمدة 15 دقيقة. استخدام مخلب لنقل فورا رف الشريحة الساخنة إلى حمام الماء المقطر وغسلها لمدة دقيقتين. غسل الشرائح ثم في الإيثانول الطازجة 100٪ لمدة دقيقتين، والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.بعد ذلك، استخدم قلم حاجز مبيد للماء لرسم حاجز حول كل عينة، واتركه يجف لمدة خمس دقائق على الأقل. بالنسبة لعملية الهضم البروتية، ضع الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها، وأضف ما يقرب من أربع قطرات من Protease Plus لكل عينة. غطي الصينية بغطاء، وادخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.قم بإزالة الصينية من الفرن، وأزل حامل الشريحة. العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة الماء المقطر. غسل الشرائح مرتين لمدة دقيقتين في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات المستمرة.لبدء التهجين، انقر نقرًا سريعًا على الشرائح لإزالة أي سائل زائد ووضعها مرة أخرى في حامل الشريحة. إزالة مسبار HPV تدفئة مسبقة من الفرن، وإضافة ما يقرب من أربع قطرات لتغطية كل قسم بالكامل. غطي الصينية بالغطاء، وادخلها في الفرن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 40 درجة مئوية.بعد الانتهاء من الحضانة، قم بإزالة الصينية من الفرن وأزل رف الشريحة. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة واحد س غسل العازلة، وغسل الشرائح لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر، وكرر مع واحدة جديدة x غسل العازلة. انقر ونفض الغبار لإزالة أي سائل زائد من الشرائح، ووضعها في رف الشريحة مرة أخرى.أضف ما يقرب من أربع قطرات من درجة حرارة الغرفة AMP1 لكل قسم لتغطية كل قسم بالكامل. غطي الصينية بالغطاء، وادخلها في الفرن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. بعد إزالة الصينية من الفرن، قم بإزالة رف الشريحة.العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي سائل الزائدة، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة واحد س غسل العازلة، وغسل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر، وكرر مع واحدة جديدة x غسل العازلة. Dispense نفس العدد من قطرات من كل DAB-A و DAB-B حل في أنبوب الحجم المناسب لجعل ما يقرب من 120 ميكرولترات من الركيزة DAB لكل قسم، ودوامة. خذ كل شريحة، واحدة في كل مرة، من رف الشريحة، واضغط ونفض الغبار لإزالة السائل الزائد، ووضعها مرة أخرى في رف الشريحة.ما يقرب من 120 ميكرولترات من خليط DAB على كل قسم الأنسجة، والتأكد من أن يتم تغطية المقاطع. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والمضي قدما مع الاحتواء المضاد. ضع قطرة واحدة من متوسط التركيب لكل شريحة زجاجية ، ثم ضع الشرائح على الشرائح واتركها جافة.بعد بضع ساعات، تابع التقييم باستخدام المجهر البصري كما هو موضح في المخطوطة. كما هو موضح هنا في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة، وجود البقعة اللونية البني في السيتوبلازم أو في نوى الخلايا السرطانية تعريف حالة إيجابية. تم تقسيم النتائج إلى 20x درجات، RNA CISH درجة عالية ومنخفضة كما لوحظ مع هدف 20x.ويعتبر رنا CISH درجة تلطيخ منخفضة عندما لوحظ في أقل من 50٪ من الخلايا السرطانية ويغطي أقل من 80٪ من سطح الخلية. من ناحية أخرى، درجة رنا CISH عالية عندما لوحظ في أكثر من 50٪ من الخلايا السرطانية الملطخة، أو مع سطح تلطيخ تتجاوز 80٪ في أكثر من 30٪ من الخلايا السرطانية. لا ينبغي لأحد أن يترك الشرائح تجف للتهجين.لا تنسى أن تسخين التحقيق. لكل عينة، تنفيذ الرقابة الإيجابية والسلبية من أجل تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

كانالوستومي كنهج العمليات جراحية لإيصال الأدوية المحلية إلى آذان الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...