Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Forfatterne takker afdelingen for patologi i Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall); den histologiske platform PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark til sprog redigering; Alexandra Elbakyan for hendes bidrag.

Protokollen følger etiske retningslinjer og blev godkendt af det etiske udvalg (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. klargøring af materialerne
<ol><li>
Klargøring af 1x vaskebuffer
	<ol>
<li>Forbered 3 L 1x vask buffer ved at tilføje 2,94 L destilleret vand og en flaske (60 mL) vaskebuffer (50x) (Se tabellen over materialer) til en stor carboy. Bland godt. Bemærk: 1x-vaskebufferen kan tilberedes før tid og opbevare...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV-RNA, der udføres med et indkøbt kit, er et effektivt værktøj til påvisning af virale udskrifter, og det indikerer aktiv HPV-infektion. Udføres manuelt, trinene i protokollen er generelt let at følge, og den købte kit er praktisk. Denne teknik gør det muligt farvning af 19 histologiske prøver plus en kontrol slide på én gang, og analysen varer omkring 8 h. Det er vigtigt ikke at lade prøverne tørre ud mellem trin, medmindre andet er nævnt. Præbehandlings betingelsen skal muligvis justeres afhængigt af...

HPV-RNA er et effektivt værktøj til påvisning af aktiv HPV-infektion, som kan vise sig at være afgørende for godartede eller maligne læsioner på forskellige steder såsom orofarynx eller livmoderhalsen. Påvisning af en aktiv HPV-infektion kan understøtte diagnosen af en HPV-induceret læsion og dermed påvirke dens behandling og prognose.
HPV er den hyppigste seksuelt overførte infektion, og mere end 100 virale genotyper er beskrevet1. Skematisk, lavrisiko genotyper såsom genotype 6 og 11 er kendt for at fremkalde kønsvorter, recidiverende luftvejs papillomatose og andre godartede læsioner, hvorimod højrisiko-genotyper såsom genotyper 16 og 18 er ansvarlige for de fleste livmoderhalskræft og anal kræft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proportioner, som tegnede sig for regionale epidemiologiske data2.
Der findes flere værktøjer til påvisning af HPV-infektion. Da en højrisiko-HPV-infektion fører til ekspression af virale onkogeniske proteiner E6 og E73, er påvisning af E6 og E7 udskrifter bredt betragtet som guldstandarden for aktiv HPV-infektion identifikation4. HPV-RNA CISH kan udføres på FFPE-prøver, som ganske enkelt er fremstillet af patienter, der lider af forskellige HPV-relaterede sygdomme. Dens ydeevne er blevet evalueret i plade intraepitelial neoplasi i livmoderhalsen, anus, og vagina, og i invasive pladecellekarcinom i livmoderhalsen, anus, og den øvre aerofordøjelses kanalen5: det opnår en følsomhed på over 98% blandt HPV-DNA-polymerasekæde reaktion (PCR)-positive tilfælde. Dette er lidt bedre end P16 immun farvning (93%) og HPV-DNA in situ-hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mere almindeligt anvendt. I en anden kohorte af 57 patienter med planocellulært karcinom (SCC) som følge af hoved-og nakkeregionen, genital regionen, huden og urinvejene, sammenlignet med HPV-DNA ISH, opnåede HPV RNA CISH bedre følsomhed (100% versus 88%) og specificitet (87% versus 74%)6.
P16 immunofarvning er en indirekte markør, der afspejler forstyrrelser i cellecyklussen, som kan være forårsaget (men ikke udelukkende) af HPV-infektion4,7. Denne omkostningseffektive test besidder en god følsomhed og en negativ prædiktiv værdi og anbefales som en surrogatmarkør for højrisiko-HPV-infektion i oropharynx cancer (OPC) af College of American patologer (CAP) og af Union for international Kræftkontrol (UICC)8.
Selvom dette papir udelukkende fokuserer på påvisning af HPV i HNSCC, er HPV-RNA klinisk relevant i forskellige andre tilstande, der involverer HPV-infektion. For eksempel, denne teknik kan forbedre nøjagtigheden af diagnosen af lav-grade planocelløse intraepiteliale læsioner i livmoderhalsen (LSIL, tidligere kendt som Cervical intraepitelial neoplasi, grad 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfælde9. Hvad angår orofaryngeal SCC, gør HPV-RNA CISH det muligt at identificere HPV-relateret SCC, mærket som forskellig fra HPV-relateret orofaryngeal SCC i den nylige ottende udgave af TNM-klassifikationen af hoved-og hals kræft (i Unionen for international Cancer Kontrol [UICC])10. Da HPV-relaterede SCC udviser en bedre prognose med længere overlevelse og forbedret strålebehandling og kemoterapi følsomhed end HPV-relateret SCC11,12,13, kan påvisning af HPV-infektion påvirke patienthåndtering14,15. Desuden kan HPV-RNA CISH anvendes til diagnosticering af HPV-relateret multiphenotypisk sinonasalt karcinom med et højere signal end HPV-DNA CISH16. Flere multivariat analyser tyder på, at påvisning af E6 og E7 udskrifter er korreleret med en bedre prognose i orofaryngeale SCC samlet7,15,17,18 og i under gruppe af P16-positive orofaryngeale SCC19,20.
Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA, der udføres på FFPE-slides med et sæt, der er fremstillet af producenten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infektion er en stor risikofaktor for en subtype af orofaryngeal planocellulært karcinom (OPSCC), som har tendens til at være forbundet med et bedre resultat end alkohol-og tobaksrelateret OPSCC. Kromogen in situ-hybridisering (CISH) af HPV-viral RNA kan tillade semikvantitativ evaluering af virale udskrifter af de onkogene proteiner E6 og E7 og en in situ-visualisering med en god rumlig opløsning. Denne teknik gør det muligt at diagnosticere en aktiv infektion med visualisering af HPV transskription i de svulst HPV-inficerede celler. En fordel ved denne teknik er undgåelse af kontaminering fra nonneoplastiske HPV-inficerede celler støder op til tumoren. Samlet, dens gode diagnose forestillinger har det anset for at være den gyldne standard for aktiv HPV-infektion identifikation. Siden E6 og E7 viral protein interaktion med celle proteiner pRb og P53 er obligatorisk for celletransformation, er HPV-RNA CISH funktionelt relevant og afspejler akut aktiv onkogenic HPV-infektion. Denne teknik er også klinisk relevant, da "lav" eller "høj" HPV-transkription niveauer hjalp identifikationen af to prognose grupper blandt HPV-relaterede P16-positive hoved-og halscancer patienter. Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA CISH udført på formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) dias med et kit fra producenten. I stedet for kromogen åbenbaring kan RNA in situ-hybridisering også udføres med fluorescerende Åbenbaring (RNA FISH). Det kan også kombineres med konventionel immun farvning.

Som beskrevet her, i hoved og hals planocelløse celle kræft, en sag kan betragtes som positiv i nærværelse af brun punktiform farvning i cytoplasma eller i kerner af tumorceller. I de fleste undersøgelser betragtes signalet som enten "positivt" eller "ikke påvist"14. Metoder til semi kvantificering af signalet er blevet rapporteret, men mangler standardisering mellem holdene. For eksempel, i nogle undersøgelser, blev signalerne scoret som 1 + med 1 – 3 prikker per tumor celle, 2 + med 4 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses for at være en af guld standarderne for aktiv human papillomavirus infektion påvisning inden tumorer. Det giver mulighed for visualisering af HPV E6-E7 mRNA udtryk med lokalisering og semikvantitativ evaluering af dets signal.

Kromogen in situ hybridisering SS et værktøj til HPV-relateret hoved-og hals kræftdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH gør det muligt at opdage en aktiv human papillomavirusinfektion. Da in-situ hybridisering mål HPV RNA denne teknik giver mulighed for visualisering af en aktiv transskription af virus. Det har præcis rumlig opløsning og god diagnose ydeevne.Påvisning af HPV kan understøtte diagnosticering af flere HPV-relaterede læsioner, såsom oropharyngeal planocellulært karcinom eller cervikal neoplasi. Det kan også have indflydelse på prognosen. Efter klargøring af buffere og modfarvningsgengøre tilberedes et x reagens til udtagning af mål i et stort bægerglas ved at tilsætte 70 milliliter 10x reagens til udtagning af mål til 630 milliliter destilleret vand.Ansvar bægeret på en varmeplade med magnetisk omrører og dæk det med aluminiumsfolie. Kog dens indhold ved 100 grader Celsius i 10 til 15 minutter og sørg for ikke at koge det i længere end 30 minutter. For at blokere peroxidase aktivitet på dias med væv sektioner tidligere deparaffinized og placeret i diasstativ, tilføje fire til seks dråber, lige nok til at dække prøven, af hydrogenperoxid til hvert dias, og inkubere dem i 10 minutter ved stuetemperatur.Rutsjebanerne vaskes to gange i to minutter i destilleret vand ved stuetemperatur. For at bryde RNA væv grænser i RNA væv sektioner, først fjerne aluminiumsfolie fra den kogende en x TRR ved hjælp af en klo, og stoppe omrøring. Nedsænk glidestativet langsomt og meget forsigtigt.Dæk bægerglasset igen med aluminiumsfolie, og inkuber i 15 minutter. Brug kloen til straks at overføre den varme rutsjebaneholder til et destilleret vandbad og vask den i to minutter. Vask dias derefter i frisk 100% ethanol i to minutter, og lad dem tørre ved stuetemperatur i to minutter.Dernæst skal du bruge en hydrofobe barriere pen til at tegne en barriere omkring hver prøve, og lad det tørre ud i mindst fem minutter. For protease fordøjelse, placere dias i fugtighed kontrolleret bakke, og tilsæt ca. fire dråber Protease Plus per prøve. Dæk bakken med et låg, og sæt den i hybridiseringsovnen i 30 minutter ved 40 grader Celsius.Tag bakken ud af ovnen, og fjern slideholderen. Arbejde et dias ad gangen, hurtigt fjerne overskydende væske, og læg diaset i diasstativet nedsænket i en farvningskål fyldt med destilleret vand. Objektglassene vaskes to gange i to minutter i destilleret vand ved stuetemperatur med konstant omrøring.Hvis du vil starte hybridiseringen, skal du trykke og svippe på diasene for at fjerne overskydende væske og placere dem i slideholderen igen. Fjern den forvarmte HPV-sonde fra ovnen, og tilsæt ca. fire dråber, så hver sektion helt kan dække den. Dæk bakken med låget, og sæt den i ovnen i to timer ved 40 grader Celsius.Når inkubationen er afsluttet, skal du fjerne bakken fra ovnen og fjerne skyderisten. Et dias ad gangen, fjern hurtigt overskydende væske, og placer diaset i skydestativet nedsænket i en farvningsskål fyldt med en x-vaskbuffer, vask objektglassene i to minutter ved stuetemperatur med konstant omrøring, og gentag med frisk en x vaskebuffer. Tryk og svip for at fjerne overskydende væske fra objektglassene, og placer dem i slideholderen igen.Tilføj ca. fire dråber rumtemperatur AMP1 pr. sektion for helt at dække hver sektion. Dæk bakken med låget, og sæt den i ovnen i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Når du har fjernet bakken fra ovnen, skal du fjerne slideholderen.Arbejde en slide ad gangen, hurtigt fjerne overskydende væske, og læg diaset i diasstativet nedsænket i en farvningsskål fyldt med en x vaskebuffer, vask i to minutter ved stuetemperatur med konstant omrøring, og gentag med frisk en x vaskebuffer. Dispenseres det samme antal dråber af hver DAB-A og DAB-B opløsning i et passende størrelse rør til at gøre ca 120 mikroliter af DAB substrat pr sektion, og vortex. Tag hvert dias, en ad gangen, fra slideholderen, og tryk og svip for at fjerne overskydende væske, og placer den tilbage i slideholderen.Pipette ca. 120 mikroliter DAB-blanding på hver vævssektion, og sørg for, at sektionerne er dækket. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur, og fortsæt med kontrastainerende. Placer en dråbe montering medium pr glas slat, og derefter placere lameller på dias og lad dem lufttørre.Efter et par timer, gå videre med evaluering ved hjælp af et optisk mikroskop som beskrevet i manuskriptet. Som beskrevet her i hoved og hals planocellulært karcinom, tilstedeværelse af brun punktform farvning i cytoplasmaet eller i kerner af tumorceller defineret en positiv sag. Resultaterne blev opdelt i to scoringer, RNA CISH høj og lav score som observeret med en 20x mål.RNA CISH score farvning anses for lav, når observeret i under 50% af tumorceller og dækker mindre end 80% af celleoverfladen. På den anden side, RNA CISH score er høj, når observeret i mere end 50% af de farvede kræftceller, eller med farvning overflade overstiger 80% i mere end 30% af tumorceller. Man bør aldrig lade dias tørre ud for hybridisering.Glem ikke at forvarme sonden. For hver prøve udføres positiv og negativ kontrol for at vurdere kvaliteten af RNA'et.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy som en kirurgisk tilgang til lokale Drug Delivery indre ører af voksne og Neonatal mus

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...