Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

De auteurs danken het departement pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en de Chantal Chambolle, Elodie Michel en Gisèle Legalel; het platform van de histologie van PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark voor het bewerken van talen; Alexandra Elbakyan voor haar bijdrage.

Het protocol volgt ethische richtsnoeren en is goedgekeurd door het ethisch comité (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. voorbereiding van de materialen
<ol><li>
Voorbereiding van 1x Wash buffer
	<ol>
<li>Bereid 3 L van 1x was buffer door toevoeging van 2,94 L gedestilleerd water en een fles (60 mL) van Wash buffer (50x) (Zie de tabel van materialen) aan een grote carboy. Meng goed. Opmerking: de 1x wassen buffer kan van...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH uitgevoerd met een gekochte Kit is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van virale transcripten en het geeft actieve HPV-infectie. Handmatig uitgevoerd, de stappen van het protocol zijn over het algemeen gemakkelijk te volgen, en de gekochte Kit is handig. Deze techniek kan de kleuring van 19 histologische monsters plus een controle dia in een keer, en de assay duurt ongeveer 8 uur. Het is van cruciaal belang niet te laten de monsters uitdrogen tussen de stappen, tenzij anders vermeld. De voor behandeli...

HPV RNA CISH is een krachtig hulpmiddel voor de opsporing van actieve besmetting HPV, die van essentieel belang in goedaardige of kwaadaardige letsels op diverse plaatsen zoals orofarynx of de baarmoeder cervix kan blijken. De opsporing van een actieve HPV-infectie kan ondersteunen de diagnose van een HPV-geïnduceerde laesie en, daardoor, invloed zijn behandeling en prognose.
HPV is de meest voorkomende seksueel overdraagbare infectie, en meer dan 100 virale genotypen zijn beschreven1. Schematisch, laag-risico genotypen zoals genotypen 6 en 11 zijn gekend om genitale wratten, terugkomende Ademhalings papillomatosis, en andere goedaardige letsels te veroorzaken, terwijl de hoog-risico genotypen zoals genotypen 16 en ook 18 voor de meeste cervicale kanker verantwoordelijk zijn en anale kankers en spelen een rol in HNSCC oncogenese in variabele verhoudingen, zoals verantwoord door regionale epidemiologische gegevens2.
Verschillende tools zijn beschikbaar voor de opsporing van HPV-infectie. Als een hoog-risico HPV-infectie leidt tot de expressie van virale oncogene eiwitten E6 en E73, de detectie van E6 en E7 transcripten wordt alom gezien als de gouden standaard voor actieve HPV-infectie identificatie4. HPV RNA CISH kan worden uitgevoerd op FFPE monsters die vrij gemakkelijk zijn verkregen van patiënten die lijden aan verschillende HPV-gerelateerde ziekten. De prestaties zijn geëvalueerd in plaveiselcel epitheliale neoplasie in de baarmoederhals, de anus, en de vagina, en in invasieve plaveiselcel cel carcinoom in de baarmoederhals, de anus, en de bovenste aerodigestive Tract5: het bereikt een gevoeligheid van meer dan 98% onder de polymerasekettingreactie van DNA van HPV (PCR)-positieve gevallen. Dit is iets beter dan P16 immunokleuring (93%) en HPV DNA in situ kruising (het ISH van DNA: 97%), wat meer algemeen worden gebruikt. In een andere cohort van 57 patiënten met plaveiselcel cel carcinoom (SCC) die voortvloeien uit het hoofd-en nek-gebied, de genitale regio, de huid, en de urinewegen, in vergelijking met HPV-DNA-ISH, HPV RNA CISH bereikt een betere gevoeligheid (100% versus 88%) en specificiteit (87% versus 74%)6.
P16 immunokleuring is een indirecte marker reflecterende cel cyclus verstoring die kunnen worden veroorzaakt (maar niet uitsluitend) door HPV-infectie4,7. Deze kosteneffectieve test bezit een goede gevoeligheid en een negatieve voorspellende waarde en wordt aanbevolen als een surrogaat marker van een hoog risico HPV-infectie in orofarynx Cancer (OPC) door het College van Amerikaanse patholoog (GLB) en door de Unie voor internationale De controle van kanker (UICC)8.
Hoewel dit document zich uitsluitend op de opsporing van HPV in HNSCC concentreert, is HPV RNA CISH klinisch relevant in diverse andere voorwaarden die besmetting HPV impliceren. Bijvoorbeeld, kan deze techniek de nauwkeurigheid van de diagnose van low-grade plaveiselcel epitheliale letsels van de cervix (LSIL, vroeger genoemd geworden cervicale epitheliale neoplasie, rang 1 [CIN1]) voor morfologisch dubbelzinnige gevallen9verbeteren. Wat orofaryngeale SCC, HPV RNA CISH maakt de identificatie van HPV-gerelateerde SCC, gelabeld als onderscheiden van HPV-niet-verbonden orofaryngeale SCC in de recente achtste editie van de TNM classificatie van hoofd-en nek kanker (van de Unie voor internationale kanker Controle [UICC])10. Sinds HPV-gerelateerde SCC vertoont een betere prognose met een langere overleving en verbeterde radiotherapie en chemotherapie gevoeligheid dan HPV-niet-verbonden SCC11,12,13, de opsporing van HPV-infectie kan gevolgen hebben geduldig beheer14,15. Bovendien, HPV RNA CISH kan voor de diagnose van HPV-verwant multifenotypic sinonasal carcinoom met een hoger signaal worden gebruikt dan HPV DNA CISH16. Verschillende multivariate analyses suggereren dat de detectie van E6 en E7 transcripten gecorreleerd is met een betere prognose in orofaryngeale SCC overall7,15,17,18 en in de subgroep van P16-positieve orofaryngeale SCC19,20.
Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV RNA CISH uitgevoerd op FFPE dia's met een kit verkregen van de fabrikant.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

Humaan papillomavirus (HPV) infectie is een belangrijke risicofactor voor een subtype van orofaryngeale plaveiselcel Cell carcinoom (OPSCC), die de neiging heeft te worden geassocieerd met een beter resultaat dan alcohol-en tabak-gerelateerde OPSCC. Chromogene in situ hybridisatie (CISH) van HPV virale RNA kan de semiquantitative evaluatie van virale transcripties van de oncogene eiwitten E6 en E7 en een in situ visualisatie met een goede ruimtelijke resolutie. Deze techniek maakt de diagnose van een actieve infectie met de visualisatie van de HPV-transcriptie in de tumorale HPV-geïnfecteerde cellen. Een voordeel van deze techniek is het vermijden van verontreiniging van nonneoplastic HPV-geïnfecteerde cellen grenzend aan de tumor. Globaal, heeft zijn goede diagnose prestaties het beschouwd als de gouden norm voor de actieve identificatie van de besmetting HPV te zijn. Sinds E6 en E7 virale eiwitinteractie met cel eiwitten pRb en p53 is verplicht voor cel transformatie, HPV RNA CISH is functioneel relevant en acuut weerspiegelt actieve oncogene HPV-infectie. Deze techniek is klinisch relevant en omdat "lage" of "hoge" HPV-transcriptie niveaus hielp de identificatie van twee prognose groepen onder HPV-gerelateerde P16-positieve hoofd-en nek kankerpatiënten. Hier presenteren we het protocol voorhand matige HPV-RNA CISH uitgevoerd op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) dia's met een kit verkregen van de fabrikant. In plaats van chromogene revelatie, kan de kruising van RNA in situ ook met fluorescente revelatie (de vissen van RNA) worden uitgevoerd. Het kan ook worden gecombineerd met conventionele immunokleuring.

Zoals hier beschreven, in hoofd en nek plaveiselcel cel kanker, een zaak kan worden beschouwd als positief in de aanwezigheid van bruine punctiform kleuring in het cytoplasma of in de kernen van tumorcellen. In de meeste studies, wordt het signaal beschouwd als ofwel "positief" of "niet gedetecteerd"14. Methoden van semiquantification van het signaal zijn gemeld, maar gebrek aan standaardisatie tussen teams. Bijvoorbeeld, in sommige studies, werden de signalen gescoord als 1 + met 1-3 dots per tum...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH maakt de detectie van een actieve infectie van het humaan papillomavirus mogelijk. Aangezien de in-situ hybridisatie doelen HPV RNA deze techniek maakt de visualisatie van een actieve transcriptie van het virus. Het heeft een nauwkeurige ruimtelijke resolutie en goede diagnose prestaties.De detectie van HPV kan de diagnose van verschillende HPV-gerelateerde laesies ondersteunen, zoals orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom of cervicale neoplasie. Het kan ook invloed hebben op de prognose. Na het voorbereiden van buffers en contra-kleuring reagentia, bereiden een x doel retrieval reagens in een groot bekerglas door het toevoegen van 70 milliliter van 10x doel retrieval reagens tot 630 milliliter gedestilleerd water.Plaats het bekerglas op een verwarmingsplaat met magnetische roerder en bedek het met aluminiumfolie. Kook de inhoud op 100 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat het niet langer dan 30 minuten kookt. Om peroxidaseactiviteit op dia's met weefselsecties te blokkeren die eerder zijn gedeparaffiniseerd en in het schuifrek worden geplaatst, voegt u vier tot zes druppels toe, net genoeg om het monster te bedekken, van waterstofperoxide aan elke dia en 10 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden.Was de glijbanen twee keer twee minuten in gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Om RNA weefsel grenzen te breken in de RNA weefsel secties, verwijder eerst de aluminiumfolie uit de kokende een x TRR met behulp van een klauw, en stoppen met roeren. Dompel het schuifrek langzaam en zeer zorgvuldig onder.Bedek het bekerglas opnieuw met de aluminiumfolie en broed gedurende 15 minuten uit. Gebruik de klauw om het hete schuifrek onmiddellijk over te brengen in een gedestilleerd waterbad en was het twee minuten. Was de glijbanen vervolgens in verse 100% ethanol gedurende twee minuten, en laat ze drogen op kamertemperatuur gedurende twee minuten.Gebruik vervolgens een hydrofobe barrièrepen om een barrière rond elk monster te trekken en laat deze minstens vijf minuten uitdrogen. Voor protease spijsvertering, plaats de dia's in de vochtigheid gecontroleerde lade, en voeg ongeveer vier druppels Protease Plus per monster. Bedek de lade met een deksel, en steek het in de hybridisatieoven gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius.Haal de lade uit de oven en verwijder het schuifrek. Werken een dia tegelijk, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de glijbaan rack ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met gedestilleerd water. Was de glijbanen twee keer twee minuten in gedestilleerd water bij kamertemperatuur met constante agitatie.Als u de hybridisatie wilt starten, tikt u op de dia's en veegt u deze om overtollige vloeistof te verwijderen en plaatst u deze terug in het schuifrek. Verwijder de voorverwarmde HPV-sonde uit de oven en voeg ongeveer vier druppels toe om elke sectie volledig af te dekken. Bedek de lade met het deksel, en steek het in de oven voor twee uur op 40 graden Celsius.Na het voltooien van de incubatie, haal de lade uit de oven en verwijder het schuifrek. Een dia per keer, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de schuifrek ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met een x wassen buffer, het wassen van de dia's gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met constante agitatie, en herhaal met verse een x wassen buffer. Tik en veeg om overtollige vloeistof uit de dia's te verwijderen en plaats ze opnieuw in het schuifrek.Voeg ongeveer vier druppels kamertemperatuur AMP1 per sectie toe om elke sectie volledig af te dekken. Bedek de lade met het deksel, en steek het in de oven gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius. Verwijder na het verwijderen van de lade uit de oven het schuifrek.Werken een dia tegelijk, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de dia rek ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met een x wassen buffer, wassen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met constante agitatie, en herhaal met verse een x wassen buffer. Doe hetzelfde aantal druppels van elke DAB-A- en DAB-B-oplossing af in een buis van de juiste grootte om ongeveer 120 microliters DAB-substraat per sectie en vortex te maken. Neem elke dia, een voor een, uit het schuifrek, en tik en veeg om overtollige vloeistof te verwijderen, en plaats deze terug in het schuifrek.Pipette ongeveer 120 microliter VAN DAB-mengsel op elke weefselsectie, ervoor te zorgen dat de secties worden afgedekt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en ga verder met contrastaining. Plaats een druppel montagemedium per glazen lat, en plaats vervolgens de lamellen op de glijbanen en laat ze luchtdrogen.Na een paar uur, ga verder met de evaluatie met behulp van een optische microscoop zoals beschreven in het manuscript. Zoals hier beschreven in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom, de aanwezigheid van bruine punctiform vlekken in het cytoplasma of in de kernen van tumorcellen gedefinieerd een positief geval. De resultaten werden verdeeld in twee scores, RNA CISH hoge en lage score zoals waargenomen met een 20x doelstelling.RNA CISH score kleuring wordt beschouwd als laag wanneer waargenomen in minder dan 50% van de tumorcellen en beslaat minder dan 80% van het celoppervlak. Aan de andere kant, RNA CISH score is hoog wanneer waargenomen in meer dan 50% van de gekleurde kankercellen, of met de kleuring oppervlak meer dan 80%in meer dan 30% van de tumorcellen. Men moet nooit laten de dia's uitdrogen voor hybridisatie.Vergeet niet de sonde voor te verwarmen. Voer voor elk monster een positieve en negatieve controle uit om de kwaliteit van het RNA te beoordelen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy als een chirurgische benadering van lokale Drug Delivery tot de Inner oren van volwassen en neonatale muizen

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...