Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
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Die Autoren danken der Abteilung für Pathologie von Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Giséle Legall); die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark für Sprachbearbeitung; Alexandra Elbakyan für ihren Beitrag.

Das Protokoll folgt ethischen Richtlinien und wurde vom Ethikausschuss (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04) gebilligt.
1. Herstellung der Materialien
<ol><li>
Vorbereitung des 1x Waschpuffers
	<ol>
<li>Bereiten Sie 3 L 1x Waschpuffer vor, indem Sie einem großen Carboy 2,94 l destilliertes Wasser und eine Flasche (60 ml) Waschpuffer (50x) (siehe Materialtabelle)hinzufügen. Gut mischen. HINWEIS: Der 1x Waschpuffer kann im Vo...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH, das mit einem gekauften Kit durchgeführt wird, ist ein leistungsstarkes Werkzeug für den Nachweis viraler Transkripte und weist auf eine aktive HPV-Infektion hin. Manuell ausgeführt, sind die Schritte des Protokolls insgesamt einfach zu befolgen, und das gekaufte Kit ist bequem. Diese Technik ermöglicht die Färbung von 19 histologischen Proben plus einem Steuerschlitten auf einmal, und der Test dauert etwa 8 h. Es ist wichtig, die Proben nicht zwischen den Stufen austrocknen zu lassen, sofern nicht and...

HPV RNA CISH ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis einer aktiven HPV-Infektion, die sich bei gutartigen oder bösartigen Läsionen an verschiedenen Orten wie dem Oropharynx oder dem Gebärmutterhals als entscheidend erweisen kann. Der Nachweis einer aktiven HPV-Infektion kann die Diagnose einer HPV-induzierten Läsion unterstützen und dadurch ihre Behandlung und Prognose beeinflussen.
HPV ist die häufigste sexuell übertragbare Infektion, und über 100 virale Genotypen wurden beschrieben1. Schematisch sind genotyparme Genotypen wie die Genotypen 6 und 11 dafür bekannt, Genitalwarzen, rezidivierende Atmungspapillomatose und andere gutartige Läsionen zu induzieren, während Hochrisiko-Genotypen wie die Genotypen 16 und auch 18 für die meisten Gebärmutterhalskrebserkrankungen verantwortlich sind. und Analkrebs und spielen eine Rolle bei der HNSCC-Onkogenese in variablen Anteilen, wie sie in den regionalen epidemiologischen Daten2berücksichtigt werden.
Für den Nachweis von HPV-Infektionen stehen mehrere Tools zur Verfügung. Da eine HPV-Infektion mit hohem Risiko zur Expression der viralen onkogenen Proteine E6 und E73führt, wird der Nachweis von E6- und E7-Transkripten weithin als Goldstandard für die aktive HPV-Infektionsidentifikationangesehen 4. HPV RNA CISH kann an FFPE-Proben durchgeführt werden, die ganz einfach von Patienten mit verschiedenen HPV-bedingten Erkrankungen gewonnen werden können. Seine Leistung wurde bei der plattenepitheliale Neoplasie im Gebärmutterhals, im Anus und in der Vagina sowie bei invasivem Plattenepithelkarzinom im Gebärmutterhals,anus und im oberen aerodigestiven Trakt 5 bewertet: es erreicht eine Empfindlichkeit von über 98% HPV DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-positive Fälle. Dies ist etwas besser als p16 Immunostaining (93%) und HPV-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH: 97%), die häufiger verwendet werden. In einer anderen Kohorte von 57 Patienten mit Plattenepithelkarzinom (SCC) aus dem Kopf- und Nackenbereich, dem Genitalbereich, der Haut und den Harnwegen erreichte HPV RNA CISH eine bessere Empfindlichkeit (100% versus 88%) Spezifität (87% versus 74%)6.
P16 Immunostaining ist ein indirekter Marker, der eine Unterbrechung des Zellzyklus widerspiegelt, die (aber nicht ausschließlich) durch hpV-Infektionen verursacht werden kann4,7. Dieser kostengünstige Test besitzt eine gute Empfindlichkeit und einen negativen Vorhersagewert und wird als Ersatzmarker für eine hochriskante HPV-Infektion bei Oropharynxkrebs (OPC) vom College of American Pathologists (CAP) und von der Union for International empfohlen. Krebsbekämpfung (UICC)8.
Obwohl sich dieses Papier ausschließlich auf den Nachweis von HPV in HNSCC konzentriert, ist HPV RNA CISH klinisch relevant unter verschiedenen anderen Bedingungen, die eine HPV-Infektion beinhalten. Zum Beispiel kann diese Technik die Genauigkeit der Diagnose von niedriggradigen plattenförmigen intraepithelialen Läsionen des Gebärmutterhalses (LSIL, früher bekannt als zervikale intraepitheliale Neoplasie, Grad 1 [CIN1]) für morphologisch mehrdeutige Fälleverbessern 9. In Bezug auf oropharyngeale SCC ermöglicht HPV RNA CISH die Identifizierung von HPV-bezogenem SCC, das in der jüngsten achten Ausgabe der TNM-Klassifikation von Kopf- und Halskrebs (der Union für internationalen Krebs) als von HPV-unabhängigem oropharyngealem SCC bezeichnet wird. Steuerung [UICC])10. Da HPV-bezogenes SCC eine bessere Prognose mit längerem Überleben und verbesserter Strahlentherapie und Chemotherapie-Empfindlichkeit aufweist als HPV-unabhängige SCC11,12,13, kann der Nachweis einer HPV-Infektion Patientenmanagement14,15. Außerdem kann HPV RNA CISH zur Diagnose von HPV-bezogenem multiphänotypischem sinonasatypischem Karzinom mit einem höheren Signal als HPV DNA CISH16verwendet werden. Mehrere multivariate Analysen deuten darauf hin, dass der Nachweis von E6- und E7-Transkripten mit einerbesseren Prognose bei oropharyngealen SCC insgesamt 7,15,17,18 und Untergruppe p16-positiver oropharyngealer SCC19,20.
Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV RNA CISH vor, das auf FFPE-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

Die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) ist ein wichtiger Risikofaktor für einen Subtyp des oropharyngealen Plattenepithelkarzinoms (OPSCC), das tendenziell mit einem besseren Ergebnis als alkohol- und tabakbedingte OPSCC in Verbindung gebracht wird. Die chromogene In-situ-Hybridisierung (CISH) der HPV-viralen RNA könnte die semiquantitative Auswertung viraler Transkripte der onkogenen Proteine E6 und E7 und eine In-situ-Visualisierung mit einer guten räumlichen Auflösung ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Diagnose einer aktiven Infektion mit der Visualisierung der HPV-Transkription in den tumoralen HPV-infizierten Zellen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Vermeidung von Kontaminationen durch nichtneoplastische HPV-infizierte Zellen, die an den Tumor angrenzen. Insgesamt, seine guten DiagnoseLeistungen haben es als der Goldstandard für aktive HPV-Infektion Identifizierung betrachtet. Da die virale Proteininteraktion von E6 und E7 mit den Zellproteinen pRb und p53 für die Zelltransformation obligatorisch ist, ist HPV RNA CISH funktionell relevant und reflektiert akut eine aktive onkogene HPV-Infektion. Diese Technik ist auch klinisch relevant, da "niedrige" oder "hohe" HPV-Transkriptionsspiegel zur Identifizierung von zwei Prognosegruppen unter HPV-bezogenen p16-positiven Kopf- und Halskrebspatienten beitrugen. Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV-RNA-CISH vor, das auf formalinfixierten Paraffin-embedded (FFPE)-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird. Anstelle chromogener Offenbarung kann die RNA-In-situ-Hybridisierung auch mit fluoreszierender Offenbarung (RNA FISH) durchgeführt werden. Es kann auch mit konventioneller Immunostainierung kombiniert werden.

Wie hier beschrieben, kann bei Kopf- und Halsplattenzellkrebs ein Fall in Gegenwart von brauner punktiformer Färbung im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen als positiv betrachtet werden. In den meisten Studien wird das Signal entweder als "positiv" oder "nicht erkannt"14betrachtet. Es wurden Methoden zur Semiquantifizierung des Signals berichtet, aber es fehlt die Standardisierung zwischen den Teams. Zum Beispiel wurden die Signale in einigen Studien mit 1+ mit 1–3 Punkten pro Tumorze...

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Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Die chromogene In-situ-Hybridisierung des humanen Papillomavirus (HPV) rna gilt als einer der Goldstandards für den aktiven Nachweis der Infektion durch das humane Papillomavirus in Tumoren. Es ermöglicht die Visualisierung der HPV E6-E7 mRNA-Expression mit Lokalisierung und semiquantitativer Auswertung seines Signals.

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH ermöglicht den Nachweis einer aktiven menschlichen Papilloma-Virusinfektion. Da die In-situ-Hybridisierung auf HPV-RNA abzielt, ermöglicht diese Technik die Visualisierung einer aktiven Transkription des Virus. Es hat eine präzise räumliche Auflösung und gute Diagnoseleistungen.Der Nachweis von HPV kann die Diagnose mehrerer HPV-bedingter Läsionen unterstützen, wie z. B. oropharyngeale Plattenepithelkarzinom oder zervikale Neoplasie. Es kann auch einen Einfluss auf die Prognose haben. Nach der Vorbereitung von Puffern und Gegenfärbungsreagenzien ein x Ziel-Retrieval-Reagenz in einem großen Becher vorzubereiten, indem 70 Milliliter 10-faches Zielabrufreagenz zu 630 Milliliter destilliertem Wasser hinzugefügt werden.Legen Sie das Becherglas auf eine Heizplatte mit Magnetrührer und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie. Kochen Sie seinen Inhalt bei 100 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten, um sicherzustellen, dass es nicht länger als 30 Minuten kochen. Um die Peroxidase-Aktivität auf Dias mit zuvor deparaffinierten und im Diaregal platzierten Gewebeabschnitten zu blockieren, fügen Sie vier bis sechs Tropfen, gerade genug, um die Probe zu bedecken, Wasserstoffperoxid zu jedem Dia hinzu und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Um DIE GRENZEN des RNA-Gewebes in den RNA-Gewebeabschnitten zu brechen, entfernen Sie zuerst die Aluminiumfolie mit einer Kralle aus der siedeten x TRR und hören Sie auf zu rühren. Tauchen Sie das Schiebegestell langsam und sehr sorgfältig ein.Den Becher wieder mit der Aluminiumfolie bedecken und 15 Minuten bebrüten. Verwenden Sie die Kralle, um das heiße Schieberegal sofort in ein destilliertes Wasserbad zu übertragen und zwei Minuten lang zu waschen. Waschen Sie die Dias dann in frischem 100%Ethanol für zwei Minuten, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten trocknen.Als Nächstes verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Barriere um jede Probe zu ziehen, und lassen Sie sie für mindestens fünf Minuten austrocknen. Zur Protease-Verdauung die Dias in das feuchtigkeitsgesteuerte Tablett legen und pro Probe etwa vier Tropfen Protease Plus hinzufügen. Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen ein.Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen, und entfernen Sie das Schiebegestell. Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in das Schieberegal in einer Färbeschale mit destilliertem Wasser gefüllt untergetaucht. Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung.Um die Hybridisierung zu starten, tippen und streichen Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie wieder in das Schiebeträger. Entfernen Sie die vorgewärmte HPV-Sonde aus dem Ofen, und fügen Sie etwa vier Tropfen hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel, und legen Sie es in den Ofen für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius.Nach Abschluss der Inkubation das Fach aus dem Ofen nehmen und das Schiebegestell entfernen. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer gefüllt, waschen Sie die Dias für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Tippen und flicken, um überschüssige Flüssigkeit aus den Dias zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.Fügen Sie etwa vier Tropfen Raumtemperatur AMP1 pro Abschnitt hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Ofen ein. Nachdem Sie das Fach aus dem Ofen entfernt haben, entfernen Sie das Schiebeträger.Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer, waschen für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Geben Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder DAB-A- und DAB-B-Lösung in einem entsprechend großen Rohr aus, um ca. 120 Mikroliter DAB-Substrat pro Abschnitt und Wirbel herzustellen. Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebeträger, tippen und flicken Sie, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.Pipette ca. 120 Mikroliter DAB-Mischung auf jeden Gewebeabschnitt, um sicherzustellen, dass die Abschnitte abgedeckt sind. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und mit der Gegenfärbung fortfahren. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium pro Glaslatte, und legen Sie dann die Lamellen auf die Rutschen und lassen Sie sie lufttrocknen.Nach einigen Stunden mit der Auswertung mit einem optischen Mikroskop, wie im Manuskript beschrieben, gehen Sie fort. Wie hier im Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom beschrieben, definierte das Vorhandensein von braunen punktförmigen Färbungen im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen einen positiven Fall. Die Ergebnisse wurden in zwei Scores unterteilt, RNA CISH high und low score as observed with a 20x objective.DIE Färbung des RNA-CISH-Scores wird bei weniger als 50 % der Tumorzellen als niedrig angesehen und deckt weniger als 80 % der Zelloberfläche ab. Auf der anderen Seite ist der RNA-CISH-Score hoch, wenn er in mehr als 50% der gefärbten Krebszellen beobachtet wird, oder mit der Färbefläche von mehr als 80% in mehr als 30% der Tumorzellen. Man sollte die Dias nie für die Hybridisierung austrocknen lassen.Vergessen Sie nicht, die Sonde vorzuheizen. Führen Sie für jede Probe eine positive und negative Kontrolle durch, um die Qualität der RNA zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy als ein chirurgisches Vorgehen zu Local Drug Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...