Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

המחברים מודים למחלקה לפתולוגיה של הופטל יורוטן ז'ורז ' פומפידו ונקקר (לורייה שאמבולל, אלודי מישל, וגילג לפני); פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, הופטל יורוטן ז'ורז ' פומפידו (קורין Lesaffre); וירג קלארק לעריכת שפה; אלכסנדרה Elbakyan עבור התרומה שלה.

הפרוטוקול מלווה בהנחיות אתיות ואושר על-ידי הוועדה האתית (קומיא-דה-הגנה-דס-פרבין-דה-פראנס-השני,2015-09-04).
1. הכנת החומרים
<ol><li>
הכנת מאגר כביסה של 1 x
	<ol>
<li>להכין 3 L של מאגר שטיפת 1 x על ידי הוספת 2.94 L של מים מזוקקים ובקבוק אחד (60 mL) של מאגר לשטוף (50x) (לראות את הטבלה של חומרי?...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH ביצע עם ערכת רכש הוא כלי רב עוצמה לאיתור תעתיקים ויראלי וזה מעיד על זיהום HPV פעיל. ביצוע ידני, השלבים של הפרוטוקול הם קלים לביצוע באופן כללי, והערכה שנרכשה היא נוחה. טכניקה זו מאפשרת כתמים של 19 דגימות היסטולוגית בתוספת שקופית אחת בקרה בבת אחת, ואת החישוב נמשך סביב 8 h. חשוב לא לתת לדגימו...

HPV RNA CISH הוא כלי רב עוצמה לאיתור זיהום HPV פעיל, אשר עשוי להוכיח קריטי נגעים שפירים או ממאירים במיקומים שונים כגון oropharynx או צוואר הרחם הרחם. זיהוי של זיהום HPV פעיל עשוי לתמוך באבחון של נגע HPV המושרה, ובכך, להשפיע על הטיפול והפרוגנוזה שלה.
HPV הוא זיהום המועברות באופן מיני התכוף ביותר, ויותר מ-100 גנוטיפים ויראליות תוארו1. באופן שונה, גנוטיפים בסיכון נמוך כגון גנוטיפים 6 ו -11 ידועים לגרום יבלות באברי המין, ונשנים הפפילומה הנשימה, נגעים שפירים אחרים, בעוד גנוטיפים בסיכון גבוה כגון גנוטיפים 16 וגם 18 אחראים לסרטן צוואר הרחם ביותר וסרטן אנאלי לשחק תפקיד ב-HNSCC אונגנזה בפרופורציות משתנה כפי שנספרו על ידי נתונים אפידמיולוגיים האזורית2.
כלים מספר זמינים לזיהוי של זיהום HPV. כמו זיהום HPV סיכון גבוה מוביל לביטוי של חלבונים אונגניים ויראלי E6 ו E73, זיהוי של E6 ו E7 התעתיקים הוא הוצג באופן נרחב כמו תקן זהב עבור הזיהוי הפעיל HPV זיהום4. HPV RNA CISH יכול להתבצע על דגימות FFPE כי הם די בקלות מתקבלים מחולים הסובלים ממחלות HPV הקשורות שונות. הביצועים שלו כבר הוערך ב neoplasia קשקשיים האפיתל בצוואר הרחם, את פי הטבעת, ואת הנרתיק, ו קרצינומה של תאים פולשנית בצוואר הרחם, פי הטבעת, ואתבמערכת העיכול העליון aerodigestive: היא משיגה רגישות של מעל 98% בין התגובה לשרשרת HPV DNA פולימראז (PCR)-מקרים חיוביים. זה קצת יותר טוב מאשר p16 כתמים (93%) ו-DNA HPV באתרו היברידיזציה (DNA ISH: 97%), אשר נפוצים יותר בשימוש. בקבוצה אחרת של 57 חולים עם קרצינומה של תאים קשקשיים (SCC) הנובעים מן הראש והצוואר, אזור איברי המין, העור, ואת דרכי השתן, לעומת HPV DNA ISH, HPV RNA CISH השיגה רגישות טובה יותר (100% לעומת 88%) וספציפיות (87% לעומת 74%)
P16 חיסוני הוא סמן עקיף המשקף מחזור התא שיבושים שעלולים להיגרם (אך לא באופן בלעדי) על ידי זיהום HPV4,7. זה מבחן חסכוני בעל רגישות טובה וערך ניבוי שלילי מומלץ כסמן פונדקאית של זיהום בסיכון גבוה HPV בסרטן oropharynx (OPC) על ידי המכללה לפתוקולוגים אמריקאי (CAP) ועל ידי האיחוד עבור הבינלאומי בקרת סרטן (UICC)8.
למרות הנייר הזה רק מתמקד בזיהוי של HPV ב HNSCC, HPV RNA CISH הוא רלוונטי קלינית בתנאים אחרים שונים הכרוכים זיהום HPV. למשל, טכניקה זו עשויה לשפר את הדיוק של האבחנה של נגעים בדרגה נמוכה האפיתל הפנימי של צוואר הרחם (LSIL, לשעבר המכונה הneoplasia הצוואר הצווארי, כיתה 1 [CIN1]) עבור מקרים דו-משמעיים מורפולוגית9. בנוגע לוע SCC, HPV RNA CISH מאפשר זיהוי של ה-HPV הקשורים SCC, המסומן בנפרד HPV-לא קשור לוע SCC במהדורה השמינית האחרונות של סיווג TNM של הראש והצוואר סרטן (של האיחוד לסרטן הבינלאומי שליטה [UICC])10. מאז scc הקשורות HPV מוצגים פרוגנוזה טובה יותר עם הישרדות ארוכה יותר הקרנות משופרות רגישות כימותרפיה מאשרHPV-שאינם קשורים,12,13, זיהוי של זיהום hpv עשוי להשפיע . ניהול החולה14,15 חוץ מזה, HPV RNA CISH יכול לשמש עבור האבחנה של קרצינומה של הקשורות HPV מרובת-הקשר עם אות גבוה יותר מאשר HPV DNA CISH16. כמה מנתח סטטיסטי מציע כי גילוי של E6 ו E7 התעתיקים מתואם עם פרוגנוזה טובה יותר לוע scc הכולל7,15,17,18 וב קבוצת המשנה של p16 חיובי לוע scc19,20.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על שקופיות FFPE עם ערכת שהתקבלו מן היצרן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

נגיף הפפילומה האנושי (HPV) זיהום הוא גורם סיכון מרכזי עבור תת-סוג של קרצינומה של תאים לוע קשקשיים (OPSCC), אשר נוטה להיות משויך לתוצאה טובה יותר מאשר אלכוהול וטבק OPSCC הקשורות. כרומוגניים היברידיזציה באתרו (CISH) של ה-RNA נגיפי HPV יכול לאפשר את הערכה כמותית למחצה של תעתיקים ויראלי של חלבונים אונגניים E6 ו E7 ו הדמיה באתרו עם רזולוציה מרחבית טובה. טכניקה זו מאפשרת את האבחנה של זיהום פעיל עם ויזואליזציה של שעתוק HPV ב-HPV מוסרי מזוהם תאים. היתרון של טכניקה זו הוא הימנעות זיהום מתאי HPV הנגועים שאינם נאופלסטיים הסמוכים לגידול. בסך הכל, הופעות אבחנה טובה שלה יש את זה נחשב כסטנדרט הזהב לזיהוי זיהום HPV פעיל. מאז E6 ו E7 אינטראקציה חלבון ויראלי עם חלבונים תא pRb ו p53 הוא חובה עבור שינוי התא, HPV RNA CISH הוא רלוונטי מבחינה פונקציונלית ומשקף זיהום HPV אונגניים פעיל. טכניקה זו היא רלוונטית קלינית, כמו גם מאז "נמוך" או "גבוהה" התעתיק HPV רמות עזר זיהוי של שתי קבוצות פרוגנוזה בקרב HPV הקשורות p16-הראש והצוואר סרטן החולים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור HPV הידני RNA CISH ביצע על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) שקופיות עם ערכת שהתקבל מהיצרן. במקום ההתגלות כרומוגניים, RNA באתרו היברידיזציה ניתן גם לבצע עם גילוי פלורסנט (ה-RNA FISH). ניתן גם לשלב אותו עם כתמים קונבנציונליים.

כפי שמתואר כאן, בראש וצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים, מקרה עשוי להיחשב חיובית בנוכחות של כתמים בצבע חום ומכתים בציטופלסמה או בגרעינים של תאים סרטניים. ברוב המחקרים, האות נחשב כ"חיובי" או "לא מזוהה"14. , דווחו שיטות למחצה של האות. אך חוסר סטנדרטיזציה בין צוותים לדוגמה, במחקרים מסוי...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

וירוס הפפילומה האנושי (HPV) כרומוגניים בתוך היברידיזציה באתרו נחשב לאחד מתקני זהב לגילוי זיהום וירוס הפפילומה האנושי בתוך גידולים. זה מאפשר ויזואליזציה של HPV E6-E7 ביטוי mRNA עם לוקליזציה והערכה כמותית למחצה של האות שלה.

כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH מאפשר זיהוי של זיהום וירוס פפילומה אנושי פעיל. מאז היברידיזציה in-situ מטרות HPV RNA טכניקה זו מאפשרת הדמיה של שעתוק פעיל של הנגיף. יש לו רזולוציה מרחבית מדויקת והופעות אבחון טובות.זיהוי של HPV עשוי לתמוך באבחון של מספר נגעים הקשורים HPV, כגון קרצינומה של תאים קשקשיים oropharyngeal או neoplasia צוואר הרחם. זה יכול להיות גם השפעה על הפרוגנוזה. לאחר הכנת מאגרים וריגנטים נגד מכתימים, הכינו רהגנט אחזור יעד x אחד בסקילר גדול על ידי הוספת 70 מיליליטר של רהגנט אחזור יעד 10x ל-630 מיליליטר של מים מזוקקים.מניחים את המזימה על צלחת חימום עם ערבוב מגנטי ומכסים אותה בנייר אלומיניום. מרתיחים את תכולתו ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות הקפדה לא להרתיח אותו במשך יותר מ 30 דקות. כדי לחסום פעילות peroxidase על שקופיות עם מקטעי רקמות בעבר deparaffinized והניח בארון השקופיות, להוסיף ארבע עד שש טיפות, רק מספיק כדי לכסות את המדגם, של מי חמצן לכל שקופית, ותדגור אותם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף את המגלשות פעמיים במשך שתי דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. כדי לשבור את גבולות רקמת RNA בחלקי רקמת RNA, תחילה להסיר את רדיד אלומיניום מן הרותחת אחד x TRR באמצעות טופר, ולהפסיק לבחוש. לטבול את מתלה השקופיות לאט ובזהירות רבה.מכסים את המזימה שוב בנייר אלומיניום, ו דגירה במשך 15 דקות. השתמש בטופר כדי להעביר מיד את מתלה השקופיות החם לאמבט מים מזוקק ולשטוף אותו במשך שתי דקות. לשטוף את השקופיות ואז טרי 100% אתנול במשך שתי דקות, ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות.לאחר מכן, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסום סביב כל דגימה, ולתת לו להתייבש לפחות חמש דקות. לעיכול פרוטאז, מניחים את השקופיות במגש מבוקר הלחות ומוסיפים כארבע טיפות של Protease Plus לכל מדגם. מכסים את המגש במכסה, ומכניסים אותו לתנור ההכלאה למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס.מוציאים את המגש מהתנור ומסירים את מתלה השקופיות. עובדים על שקופית אחת בכל פעם, מסירים במהירות כל נוזל עודף ומניחים את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במים מזוקקים. לשטוף את המגלשות פעמיים במשך שתי דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת.כדי להתחיל בהכלאה, הקש והחלק את השקופיות כדי להסיר נוזל עודף ולמקום אותו בחזרה בארון התקשורת של השקופיות. הסר בדיקת HPV מחוממת מראש מהתנור, והוסף כארבע טיפות כדי לכסות לחלוטין כל קטע. מכסים את המגש עם המכסה, ומכניסים אותו לתנור במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.לאחר השלמת הדגירה, מוציאים את המגש מהתנור ומסירים את מתלה השקופיות. שקופית אחת בכל פעם, הסר במהירות כל נוזל עודף והצב את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במאגר כביסה x אחד, שוטף את השקופיות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה מתמדת, וחוזר על הפעולה עם חיץ שטיפת x אחד טרי. הקש והחלק כדי להסיר נוזל עודף מהשקופיות והצב אותו שוב בארון התקשורת של השקופיות.הוסף כארבע טיפות של AMP1 טמפרטורת החדר לכל קטע כדי לכסות לחלוטין כל קטע. מכסים את המגש עם המכסה, ומכניסים אותו לתנור במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת המגש מהתנור, הסר את מתלה השקופיות.עובדים על שקופית אחת בכל פעם, מסירים במהירות כל נוזל עודף ומניחים את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במאגר כביסה x אחד, שוטפים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה מתמדת וחוזרים על הפעולה עם חיץ x כביסה אחד טרי. לוותר על אותו מספר טיפות של כל פתרון DAB-A ו- DAB-B בצינור בגודל מתאים כדי להפוך כ 120 microliters של מצע DAB לכל קטע, ומערבולת. קח כל שקופית, אחת בכל פעם, מארונות התקשורת של השקופיות, הקש והחלק כדי להסיר נוזל עודף והחזר אותו לאר השקופיות.פיפטה כ 120 microliters של תערובת DAB על כל קטע רקמה, לוודא כי החלקים מכוסים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולהמשיך עם נגדי. מניחים טיפה אחת של מדיום הרכבה לכל לוח זכוכית, ולאחר מכן מניחים את הלוחות על המגלשות ולתת להם אוויר יבש.לאחר מספר שעות, המשך בהערכה באמצעות מיקרוסקופ אופטי כמתואר בכתב היד. כפי שמתואר כאן קרצינומה של תאים קשקשיים בראש ובצוואר, נוכחות של כתמי פנצ'טים חומים בציטופלסמה או בגרעין של תאים סרטניים הגדירה מקרה חיובי. התוצאות חולקו לשני ציונים, RNA CISH ציון גבוה ונמוך כפי שנצפה עם מטרה 20x.כתמי ציון CISH RNA נחשב נמוך כאשר נצפה מתחת 50% של תאים סרטניים מכסה פחות מ 80% של פני השטח של התא. מצד שני, ציון RNA CISH גבוה כאשר נצפתה ביותר מ -50% מהתאים הסרטניים המוכתמים, או עם משטח הכתמים העולה על 80% ביותר מ -30% מהתאים הגידוליים. אף אחד לא צריך לתת את השקופיות להתייבש להכלאה.אל תשכחו להתחממות מוקדמת של הגשוש. עבור כל מדגם, לבצע שליטה חיובית ושלילית על מנת להעריך את איכות RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...