Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Gli autori ringraziano il dipartimento di Patologia di Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle Legall); la piattaforma di istologia di PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark per l'editing di lingue; Alexandra Elbakyan per il suo contributo.

Il protocollo segue le linee guida etiche ed è stato approvato dal Comitato Etico (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. Preparazione dei materiali
<ol><li>
Preparazione del tampone di lavaggio 1x
	<ol>
<li>Preparare 3 L di 1x buffer di lavaggio aggiungendo 2,94 L di acqua distillata e una bottiglia (60 mL) di tampone di lavaggio (50x) (vedi la tabella dei materiali) a un grande carboy. Mescolare bene. NOTA: Il buffer di ...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH eseguito con un kit acquistato è un potente strumento per il rilevamento di trascrizioni virali e indica l'infezione da HPV attivo. Eseguito manualmente, i passaggi del protocollo sono nel complesso facili da seguire e il kit acquistato è conveniente. Questa tecnica permette la colorazione di 19 campioni istologici più una diapositiva di controllo in una sola volta, e il saggio dura circa 8 h. È fondamentale non lasciare che i campioni si asciughino tra i passaggi, salvo diversamente specificato. La cond...

HPV RNA CISH è un potente strumento per il rilevamento dell'infezione da HPV attivo, che può rivelarsi cruciale nelle lesioni benigne o maligne in varie posizioni come l'oropharynx o la cervice uterina. La rilevazione di un'infezione da HPV attiva può supportare la diagnosi di una lesione indotta da HPV e, di seguito, influenzarne il trattamento e la prognosi.
L'HPV è l'infezione trasmessa sessualmente più frequente e oltre 100 genotipi virali sono stati descritti1. Schematicamente, i genotipi a basso rischio come i genotipi 6 e 11 sono noti per indurre verruche genitali, papillomatosi respiratoria ricorrente e altre lesioni benigne, mentre i genotipi ad alto rischio come i genotipi 16 e 18 sono responsabili della maggior parte dei tumori cervicali e tumori anali e svolgono un ruolo nell'oncogenesi HNSCC in proporzioni variabili, come rappresentato dai dati epidemiologici regionali2.
Sono disponibili diversi strumenti per il rilevamento dell'infezione da HPV. Come un'infezione da HPV ad alto rischio porta all'espressione di proteine oncogeniche virali E6 ed E73, la rilevazione delle trascrizioni E6 ed E7 è ampiamente vista come il gold standard per l'identificazione dell'infezione da HPV attiva4. HPV RNA CISH può essere eseguito su campioni di FFPE che sono abbastanza facilmente ottenuti da pazienti affetti da varie malattie correlate all'HPV. Le sue prestazioni sono state valutate nella neoplasia intraelicale squamosa nella cervice, nell'ano e nella vagina, e nel carcinoma a cellule squamose invasive nella cervice, nell'ano e nel tratto aerodigestivo superiore5: raggiunge una sensibilità di oltre il 98% tra i casi positivi alla reazione a catena della polimerasi del DNA HPV (PCR). Questo è leggermente meglio di p16 immunostaining (93%) e l'ibridazione situ del DNA In situ (DNA ISH: 97%), che sono più comunemente utilizzati. In un'altra coorte di 57 pazienti con carcinoma a cellule squamose (SCC) derivante dalla regione della testa e del collo, dalla regione genitale, dalla pelle e dal tratto urinario, rispetto all'HPV DNA ISH, hPV RNA CISH ha ottenuto una migliore sensibilità (100% contro 88%) specificità (87% contro 74%)6.
L'immunostaining P16 è un marcatore indiretto che riflette l'interruzione del ciclo cellulare che può essere causata (ma non esclusivamente) dall'infezione da HPV4,7. Questo test economico possiede una buona sensibilità e un valore predittivo negativo ed è raccomandato come marcatore surrogato di infezione da HPV ad alto rischio nel cancro dell'orofarye (OPC) dal College of American Pathologists (CAP) e dall'Unione per l'Internazionale Controllo del cancro (UICC)8.
Anche se questo documento si concentra esclusivamente sulla rilevazione dell'HPV in HNSCC, HPV RNA CISH è clinicamente rilevante in varie altre condizioni che coinvolgono l'infezione da HPV. Per esempio, questa tecnica può migliorare l'accuratezza della diagnosi di lesioni intrapetali di basso grado della cervice (LSIL, precedentemente nota come neoplasia intraelilicale cervicale, grado 1 [CIN1]) per casi morfologicamente ambigui9. Per quanto riguarda l'Oropharyngeal SCC, HPV RNA CISH consente l'identificazione di SCC correlati all'HPV, etichettato come distinto dalla SCC orofaziale non correlata all'HPV nella recente ottava edizione della classificazione TNM del cancro alla testa e al collo (dell'Unione per il cancro internazionale Controllo [UICC])10. Dal momento che la SCC correlata all'HPV presenta una prognosi migliore con una maggiore sopravvivenza e una maggiore sensibilità alla radioterapia e alla chemioterapia rispetto all'HPV11,12,13, il rilevamento dell'infezione da HPV può avere un impatto gestione del paziente14,15. Inoltre, HPV RNA CISH può essere utilizzato per la diagnosi di carcinoma sinonasal multifenotico correlato all'HPV con un segnale superiore a HPV DNA CISH16. Diverse analisi multivariate suggeriscono che il rilevamento delle trascrizioni E6 ed E7 è correlato con una prognosi migliore in SCC oroferesia complessivamente7,15,17,18 e nel sottogruppo di p16-positivo orofaleale SCC19,20.
Qui presentiamo il protocollo per il manuale HPV RNA CISH eseguito su vetrini FFPE con un kit ottenuto dal produttore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

L'infezione da papillomavirus umano (HPV) è un importante fattore di rischio per un sottotipo di carcinoma a cellule squamose orofangeali (OPSCC), che tende ad essere associato a un risultato migliore rispetto all'OPSCC relativo all'alcol e al tabacco. L'ibridazione cromogenica in situ (CISH) dell'RNA virale dell'HPV potrebbe consentire la valutazione semiquantitativa delle trascrizioni virali delle proteine oncogeniche E6 ed E7 e una visualizzazione in situ con una buona risoluzione spaziale. Questa tecnica consente la diagnosi di un'infezione attiva con la visualizzazione della trascrizione HPV nelle cellule tumorali infettate da HPV. Un vantaggio di questa tecnica è l'evitare la contaminazione da cellule non neoplastiche infettate da HPV adiacenti al tumore. Nel complesso, le sue buone prestazioni diagnostiche sono considerate il gold standard per l'identificazione attiva dell'infezione da HPV. Poiché l'interazione delle proteine virali E6 ed E7 con le proteine cellulari pRb e p53 è obbligatoria per la trasformazione cellulare, HPV RNA CISH è funzionalmente rilevante e riflette acutamente l'infezione attiva oncogenica hPV. Questa tecnica è clinicamente rilevante anche dal momento che i livelli di trascrizione "bassa" o "alta" di HPV hanno aiutato l'identificazione di due gruppi di prognosi tra i pazienti affetti da cancro alla testa e al collo "bassi" o "alti". Qui presentiamo il protocollo per i vetrini manuali HPV RNA CISH eseguiti su diapositive in paraffina (FFPE) fissate in formalina con un kit ottenuto dal produttore. Invece della rivelazione cromogenica, l'ibridazione dell'RNA in situ può essere eseguita anche con rivelazione fluorescente (RNA FISH). Può anche essere combinato con l'immunostaining convenzionale.

Come descritto qui, nel cancro delle cellule squamose della testa e del collo, un caso può essere considerato positivo in presenza di colorazione punctiforme marrone nel citoplasma o nei nuclei delle cellule tumorali. Nella maggior parte degli studi, il segnale è considerato come "positivo" o "non rilevato"14. Sono stati riportati metodi di semiquantificazione del segnale, ma mancano di standardizzazione tra le squadre. Ad esempio, in alcuni studi, i segnali sono stati segnati come 1-3 punti per...

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Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

L'ibridazione dell'RNA cromogenica in situ del papillomavirus umano (HPV) è considerata uno degli standard d'oro per il rilevamento dell'infezione da papillomavirus umano attivo all'interno dei tumori. Permette la visualizzazione dell'espressione mRNA HPV E6-E7 con la localizzazione e la valutazione semiquantitativa del suo segnale.

Chromogenic In Situ Hybridization è uno strumento per la diagnosi del cancro della testa e del collo correlate all'HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH consente il rilevamento di un'infezione attiva del papilloma virus umano. Poiché l'ibridazione in situ prende di mira l'RNA HPV, questa tecnica consente la visualizzazione di una trascrizione attiva del virus. Ha una risoluzione spaziale precisa e buone prestazioni diagnostiche.Il rilevamento dell'HPV può supportare la diagnosi di diverse lesioni correlate all'HPV, come il carcinoma a cellule squamose orofaringee o la neoplasia cervicale. Può anche avere un'influenza sulla prognosi. Dopo aver preparato tamponi e reagenti contro-colorazione, preparare un reagente di recupero del bersaglio x in un grande becher aggiungendo 70 millilitri di reagente di recupero bersaglio 10x a 630 millilitri di acqua distillata.Posizionare il becher su una piastra riscaldante con agitatore magnetico e coprirlo con un foglio di alluminio. Far bollire il suo contenuto a 100 gradi Celsius per 10-15 minuti assicurandosi di non bollirlo per più di 30 minuti. Per bloccare l'attività della perossidasi su diapositive con sezioni tissutali precedentemente deparaffinizzate e posizionate nel rack scorrevole, aggiungere da quattro a sei gocce, quanto basta per coprire il campione, di perossido di idrogeno ad ogni diapositiva e incubarle per 10 minuti a temperatura ambiente.Lavare gli scivoli due volte per due minuti in acqua distillata a temperatura ambiente. Per rompere i limiti del tessuto dell'RNA nelle sezioni del tessuto dell'RNA, rimuovere prima il foglio di alluminio da quello bollente x TRR usando un artiglio e smettere di mescolare. Immergere il porta scorrevole lentamente e con molta attenzione.Coprire di nuovo il becher con il foglio di alluminio e incubare per 15 minuti. Utilizzare l'artiglio per trasferire immediatamente il portapacchi caldo in un bagno d'acqua distillato e lavarlo per due minuti. Lavare i vetrini quindi in etanolo fresco al 100% per due minuti e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per due minuti.Quindi, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare una barriera intorno a ciascun campione e lasciarla asciugare per almeno cinque minuti. Per la digestione proteasi, posizionare le diapositive nel vassoio controllato dall'umidità e aggiungere circa quattro gocce di Protease Plus per campione. Coprire il vassoio con un coperchio e inserirlo nel forno di ibridazione per 30 minuti a 40 gradi Celsius.Rimuovere il vassoio dal forno e rimuovere il portascivole. Lavorare una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack dello scivolo immerso in un piatto di colorazione riempito con acqua distillata. Lavare gli scivoli due volte per due minuti in acqua distillata a temperatura ambiente con agitazione costante.Per avviare l'ibridazione, toccare e scorrere le diapositive per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarle di nuovo nel rack scorrevole. Rimuovere la sonda HPV preriscaldata dal forno e aggiungere circa quattro gocce per coprire interamente ogni sezione. Coprire il vassoio con il coperchio e inserirlo nel forno per due ore a 40 gradi Celsius.Dopo aver completato l'incubazione, rimuovere il vassoio dal forno e rimuovere la griglia. Una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack di scorrimento immerso in un piatto di colorazione riempito con un tampone di lavaggio x, lavare le diapositive per due minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetere con un tampone di lavaggio fresco di una x. Toccare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive e posizionarlo nuovamente nel rack scorrevole.Aggiungere circa quattro gocce di AMP1 a temperatura ambiente per sezione per coprire interamente ogni sezione. Coprire il vassoio con il coperchio e inserirlo nel forno per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il vassoio dal forno, rimuovere la griglia.Lavorare una diapositiva alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare lo scivolo nel rack di scorrimento immerso in una piastra di colorazione riempita con un tampone di lavaggio x, lavarsi per due minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetere con un tampone di lavaggio fresco di una x. Erogare lo stesso numero di gocce di ogni soluzione DAB-A e DAB-B in un tubo di dimensioni appropriato per realizzare circa 120 microlitri di substrato DAB per sezione e vortice. Prendere ogni diapositiva, una alla volta, dal rack scorrevole, toccare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso e posizionarlo di nuovo nel rack scorrevole.Pipetta circa 120 microlitri di miscela DAB su ogni sezione tissutale, assicurandosi che le sezioni siano coperte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere con la controsottenzione. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio per la lamelle di vetro, quindi posizionare le doghe sugli scivoli e lasciarle asciugare all'aria.Dopo alcune ore, procedere con la valutazione utilizzando un microscopio ottico come descritto nel manoscritto. Come descritto qui nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, la presenza di colorazione punctiforme marrone nel citoplasma o nei nuclei delle cellule tumorali ha definito un caso positivo. I risultati sono stati divisi in due punteggi, RNA CISH punteggio alto e basso come osservato con un obiettivo 20x.La colorazione del punteggio CISH dell'RNA è considerata bassa se osservata in meno del 50% delle cellule tumorali e copre meno dell'80% della superficie cellulare. D'altra parte, il punteggio CISH dell'RNA è alto se osservato in oltre il 50% delle cellule tumorali macchiate o con la superficie di colorazione superiore all'80% in oltre il 30% delle cellule tumorali. Non si dovrebbe mai lasciare asciugare le diapositive per l'ibridazione.Non dimenticare di preriscaldare la sonda. Per ogni campione, eseguire un controllo positivo e negativo al fine di valutare la qualità dell'RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Ricerca

Genetica

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