Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
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著者らは、ホピタル・ユーロペーン・ジョージ・ポンピドゥーとネッカー(ローリアン・シャンボレ、エロディ・ミシェル、ジゼル・レガル)の病理学部門に感謝します。PARCCの組織学プラットフォーム、ホピタルユーロペーンジョージポンピドゥー(コリンヌ・レサフェ)言語編集のためのバージニアクラーク;アレクサンドラ・エルバキアンの貢献

このプロトコルは倫理ガイドラインに従い、倫理委員会(コミテ・ド・プロテクション・デ・ペルネス・イル・ド・フランス-II、#2015-09-04)によって承認されました。
1. 材料の準備
<ol><li>
1x洗浄バッファーの調製
	<ol>
<li>蒸留水の2.94Lと洗濯バッファー(50x)のボトル1本(60mL)を大きなカーボイに加えて、1x洗浄バッファーの3Lを準備します(材料の表を?...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

購入したキットで行われるHPV RNA CISHは、ウイルス転写物の検出のための強力なツールであり、活性HPV感染を示しています。手動で実行すると、プロトコルの手順は全体的に従いやすく、購入したキットは便利です。この技術は19の組織学的サンプルプラス1つの制御スライドの染色を可能にし、アッセイは8時間の周り続ける。特に明記されていない限り、ステップ間でサンプルを乾燥させない...

HPV RNA CISHは、オロファリンクスや子宮頸部などの様々な場所で良性または悪性病変で重要な可能性がある活性HPV感染の検出のための強力なツールです。活性HPV感染の検出は、HPV誘発病変の診断をサポートし、それによって、その治療および予後に影響を与える可能性がある。
HPVは最も頻繁に性感染症であり、100以上のウイルス性のゲノムが記載されている1.概略的に、遺伝子型6および11などの低リスク遺伝子型は、性器疣贅、再発性呼吸乳頭腫症、およびその他の良性病変を誘発することが知られているが、遺伝子型16および18などの高リスク遺伝子型は、ほとんどの子宮頸癌を引き起こす。と肛他癌と地域疫学データ2によって説明される可変割合でHNSCC腫瘍形成の役割を果たしています.
HPV感染の検出にはいくつかのツールが用意されています。高リスクHPV感染がウイルス発生タンパク質E6およびE73の発現につながるように、E6およびE7転写物の検出は、活性HPV感染同定4のゴールドスタンダードとして広く見られている。HPV RNA CISHは、様々なHPV関連疾患に苦しむ患者から非常に容易に得られるFFPEサンプルに対して行うことができる。その性能は、子宮頸部、肛他、膣の扁平上皮内新生物、および子宮頸部、肛他および上部空気消化管の侵襲性扁平上皮癌で評価されている:それは98%以上の感受性を達成するHPV DNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)陽性症例の中で。これはp16免疫染色(93%)よりもわずかに優れていますその中でHPV DNAをハイブリダイゼーション(DNA ISH:97%)、より一般的に使用されています。頭頸部領域、生殖器領域、皮膚、尿路から生じる扁平上皮癌(SCC)を有する57人の患者の別のコホートでは、HPV DNA ISHと比較して、HPV RNA CISHはより良い感受性(100%対88%)を達成した特異性(87%対74%)6.
P16免疫染色は、HPV感染4、7によって引き起こされる可能性のある細胞周期破壊を反映する間接マーカーである。この費用対効果の高いテストは、良好な感度と負の予測値を有し、米国病理学者のカレッジ(CAP)と国際連合によってオアフォリンクス癌(OPC)における高リスクHPV感染の代理マーカーとして推奨されていますがんコントロール (UICC)8.
この論文はHNSCCにおけるHPVの検出のみに焦点を当てていますが、HPV RNA CISHはHPV感染を伴う様々な他の条件において臨床的に関連しています。例えば、この技術は、形態的にあいまいな症例9に対する子宮頸部の低グレード扁平上皮病変(LSIL、以前は子宮頸部内上皮新生物として知られていた、グレード1[CIN1])の診断の精度を向上させる可能性がある。前咽頭SCCに関しては、HPV RNA CISHは、頭頸部癌のTNM分類(国際癌連合の)の最近の第8版でHPV無関係の尾咽頭SCCとは異なるとラベル付けされたHPV関連SCCの同定を可能にする。コントロール [UICC])10.HPV関連SCCは、HPV無関係のSCC11、12、13よりも長い生存と強化された放射線療法および化学療法感受性でより良い予後を示すので、HPV感染の検出は影響を与える可能性がある患者管理14、15.また、HPV RNA CISHは、HPV DNA CISH16よりも高いシグナルを持つHPV関連多発性シノキピックシノナザル癌の診断に使用することができる。いくつかの多変量分析は、E6およびE7転写物の検出が、前咽頭SCC全体の7、15、17、18およびにおけるより良い予後と相関していることを示唆している。p16陽性眼咽頭SCC19のサブグループ,20.
ここでは、製造元から入手したキットを使用してFFPEスライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

ヒトパピローマウイルス(HPV)感染は、アルコールおよびタバコ関連のOPSCCよりも良い結果に関連する傾向がある口腔咽頭扁平上皮癌(OPSCC)のサブタイプの主要な危険因子である。HPVウイルスRNAの発血ハイブリダイゼーション(CISH)における発色性は、発因性タンパク質E6およびE7のウイルス転写物の半定量的評価および良好な空間分解を有するその中の可視化を可能にする可能性がある。この技術は、腫瘍性HPV感染細胞におけるHPV転写の可視化による活性感染の診断を可能にする。この技術の利点は、腫瘍に隣接する非腫瘍性HPV感染細胞からの汚染の回避である。全体的に、その良好な診断性能は、アクティブなHPV感染同定のためのゴールドスタンダードであると考えられています。E6およびE7ウイルスタンパク質と細胞タンパク質pRbおよびp53との相互作用は細胞形質転換に必須であるため、HPV RNA CISHは機能的に関連し、発生性発因性HPV感染を急性的に反映する。この技術は、HPV関連のp16陽性頭頸部癌患者の間で2つの予後群の同定を助けた「低」または「高い」HPV転写レベル以来、臨床的にも関連している。ここでは、メーカーから入手したキットを使用してホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)スライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。発色発光の代わりに、その中のRNAは蛍光啓示(RNA FISH)で行うこともできます。また、従来の免疫染色と組み合わせてもよい。

ここで説明するように、頭頸部扁平上皮癌において、細胞質または腫瘍細胞の核における褐色穿刺染色の存在下で陽性と考えられる場合がある。ほとんどの研究では、信号は「正」または「検出されない」14のいずれかと見なされます。信号の半分化の方法は報告されていますが、チーム間の標準化が欠けています。例えば、いくつかの研究では、シグナルは腫瘍細胞あた?...

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Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

ヒトパピローマウイルス(HPV)RNA発色発芽は、腫瘍内の活性ヒトパピローマウイルス感染検出のための金基準の一つであると考えられている。それはHPV E6-E7 mRNA発現の可視化を可能にし、そのシグナルの局所化および半定量的評価を可能にする。

発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISHは、ヒト乳頭腫ウイルス感染の能動性を検出することを可能にする。この技術は、HPV RNAを標的とするIn-in-situのハイブリダイゼーションにより、ウイルスの能動転写の可視化を可能にする。それは精密な空間分解能およびよい診断の性能を有する。HPVの検出は、中咽頭扁平上皮癌または頸部腫瘍などのいくつかのHPV関連病変の診断を支持し得る。また、予後に影響を与える可能性があります。バッファーおよび対染色試薬を調製した後、630ミリリットルの蒸留水に70ミリリットルの10x標的回収試薬を加えて、大型ビーカーに1個のxターゲット検索試薬を調製します。ビーカーをマグネットスターラー付きの加熱プレートに置き、アルミホイルで覆います。中身を100度に10~15分煮て、30分以上沸騰させないようにします。以前に脱パラフィンしてスライドラックに入れた組織切片を持つスライド上のペルオキシダーゼ活性をブロックするには、サンプルを覆うのに十分な4~6滴を加え、各スライドに過酸化水素を加え、室温で10分間インキュベートします。スライドを室温で蒸留水で2分間2回洗います。RNA組織切片のRNA組織の境界を断ち切るために、まず爪を使って沸騰させた1つのx TRRからアルミ箔を取り出し、攪拌を停止する。スライドラックをゆっくりと慎重に浸します。もう一度ビーカーをアルミホイルで覆い、15分間インキュベートします。爪を使ってすぐに熱いスライドラックを蒸留水浴に移し、2分間洗います。スライドを新鮮な100%エタノールで2分間洗い、室温で2分間乾燥させます。次に、疎水性バリアペンを使用して各サンプルの周りにバリアを描き、少なくとも5分間乾燥させます。プロテアーゼの消化のために、湿度制御トレイにスライドを置き、サンプルごとにプロテアーゼプラスの約4滴を加えます。トレイに蓋をし、ハイブリダイゼーションオーブンに30分、摂氏40度で挿入します。オーブンからトレイを取り出し、スライドラックを取り外します。一度に1スライドで作業し、すぐに余分な液体を取り除き、スライドラックにスライドを入れ、蒸留水で満たされた染色皿に浸します。スライドを室温で蒸留水で2回洗浄し、撹拌を一定にします。ハイブリダイゼーションを開始するには、スライドをタップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。オーブンから事前に温めたHPVプローブを取り出し、各セクションを完全に覆うために約4滴を加えます。トレイに蓋をし、40°Cで2時間オーブンに挿入します。インキュベーションが完了したら、オーブンからトレイを取り出し、スライドラックを取り外します。一度に1つのスライドで、余分な液体を素早く取り除き、スライドラックに1つの洗浄バッファーを充填した染色皿に入れ、一定の攪拌で室温で2分間スライドを洗浄し、新鮮な1x洗浄バッファーで繰り返します。スライドから余分な液体を取り除くためにタップしてフリックし、再度スライドラックに入れ替えます。各セクションを完全にカバーするために、セクションごとに約4滴の室温AMP1を追加します。トレイに蓋をし、オーブンに30分、摂氏40度で挿入します。オーブンからトレイを取り外した後、スライドラックを取り外します。一度に1つのスライドで作業し、余分な液体を素早く取り除き、スライドラックに1つのx洗浄バッファーを充填した染色皿に沈め、室温で2分間洗浄し、新鮮な1 xの洗浄バッファーで繰り返します。各DAB-AおよびDAB-B溶液の同じ数の滴を適切なサイズのチューブに分配し、セクション当たり約120マイクロリットルのDAB基板と渦を作ります。スライドラックから各スライドを1つずつ取り出し、タップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。各組織セクションに約120マイクロリットルのDAB混合物をピペットし、セクションが覆われていることを確認する。室温で10分間インキュベートし、逆染色を進めます。1つのガラススラットに取り付け媒体を1滴置き、スライドの上にスラットを置き、空気乾燥させます。数時間後、原稿に記載されている光学顕微鏡を用いた評価を進める。ここで述べたように頭頸部扁平上皮癌において、細胞質または腫瘍細胞の核における褐色の形態染色の存在は陽性の症例を定義した。結果は、20倍の目的で観察されたRNA CISHの高いスコアと低いスコアの2つのスコアに分けられた。RNA CISHスコア染色は、腫瘍細胞の50%未満で観察された場合に低いと考えられ、細胞表面の80%未満をカバーする。一方、RNA CISHスコアは、染色された癌細胞の50%以上で観察された場合、または30%以上の腫瘍細胞において染色面が80%を超えると高い。ハイブリダイゼーションのためにスライドを乾燥させるべきではありません。プローブを予熱することを忘れないでください。各サンプルについて、RNAの品質を評価するために正と負のコントロールを行います。

Research

JoVE Journal

Genetics

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Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

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点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

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In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...