Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Forfatterne takker avdelingen for patologi av Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, og Gisèle Legall); den histologi plattform av PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark for språk redigering; Alexandra Elbakyan for hennes bidrag.

Protokollen følger etiske retningslinjer og ble godkjent av etisk komité (Comité-de-Protection-des-personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. utarbeidelse av materialene
<ol><li>
Tilberedning av 1x vaskebuffer
	<ol>
<li>Forbered 3 L av 1x vaskebuffer ved å legge til 2,94 L av destillert vann og en flaske (60 mL) av vaskebuffer (50x) (se tabell over materialer) til en stor carboy. Bland godt. Merk: 1x vaskebuffer kan tilberedes på forhånd og oppbev...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+intact+HPV16+E6/E7+gene+expression+in+head+and+neck+cancers+with+unaltered+p53+status+and+perturbed+pRb+cell+cycle+control.">Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control.</a> Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).</li><li>Ndiaye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+DNA,+E6/E7+mRNA,+and+p16INK4a+detection+in+head+and+neck+cancers:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).</li><li>Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HR-HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization.">HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).</li><li>Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+chromogenic+in+situ+hybridization+assay+with+clinical+automated+platform+is+a+sensitive+method+in+detecting+high-risk+human+papillomavirus+in+squamous+cell+carcinoma.">RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma.</a> Human Pathology. 63, 184-189 (2017).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV+driven+oropharyngeal+cancers:+Comparing+p16+based+algorithms+with+the+RNAscope+HPV-test.">Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test.</a> Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Outh-Gauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+head+and+neck+cancers:+a+new+challenge+for+immunologists,+pathologists+and+clinicians.">Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians.</a> Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).</li><li>Mirghani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+HPV-driven+head+and+neck+cancer+with+a+single+test+in+routine+clinical+practice.">Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice.</a> Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

HPV RNA CISH utført med en kjøpt Kit er et kraftig verktøy for påvisning av viral transkripsjoner og det indikerer aktiv HPV-infeksjon. Utføres manuelt, trinnene i protokollen er generelle enkle å følge, og den kjøpte Kit er praktisk. Denne teknikken gjør at farging av 19 histologiske prøver pluss en kontroll lysbilde på en gang, og analysen varer rundt 8 h. Det er viktig å ikke la prøvene tørke ut mellom trinn med mindre annet er nevnt. Forbehandling tilstand må kanskje justeres avhengig av manipulert vev...

HPV RNA CISH er et kraftig verktøy for påvisning av aktiv HPV-infeksjon, som kan vise seg å være avgjørende i godartet eller ondartede lesjoner på ulike steder som oropharynx eller livmor cervix. Påvisning av en aktiv HPV-infeksjon kan støtte diagnostisering av en HPV-indusert lesjon, og dermed påvirke sin behandling og prognose.
HPV er den hyppigste seksuelt overførbare infeksjonen, og over 100 viral genotyper har blitt beskrevet1. Skjematisk, lav-risk genotyper som genotyper 6 og 11 er kjent for å indusere genital warts, tilbakevendende respiratory papillomatosis, og andre godartet lesjoner, mens høy risiko genotyper som genotyper 16 og også 18 er ansvarlig for de fleste livmorhalskreft og anal kreft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proporsjoner som stod for av regionale epidemiologiske data2.
Flere verktøy er tilgjengelig for påvisning av HPV-infeksjon. Som en høy risiko HPV-infeksjon fører til uttrykk for viral kreftfremkallende proteiner E6 og E73, påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er allment sett på som gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifisering4. HPV RNA CISH kan utføres på FFPE prøver som er ganske lett innhentet fra pasienter som lider av ulike HPV-relaterte sykdommer. Ytelsen har blitt evaluert i plateepitel intraepithelial neoplasi i livmorhalsen, anus, og vagina, og i invasiv plateepitelkreft i livmorhalsen, anus, og den øvre aerodigestive skrift5: Det oppnår en følsomhet på over 98% blant HPV DNA polymerase kjedere reaksjon (PCR)-positive tilfeller. Dette er litt bedre enn P16 immunostaining (93%) og HPV DNA in situ hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mer vanlig brukt. I en annen kohort av 57 pasienter med plateepitelkreft (SCC) som oppstår fra hodet og nakken regionen, genital regionen, huden, og urinveiene, sammenlignet med HPV DNA ISH, HPV RNA CISH oppnådde bedre følsomhet (100% versus 88%) og spesifisitet (87% versus 74%)6.
P16 immunostaining er en indirekte markør som reflekterer celle syklus forstyrrelser som kan være forårsaket (men ikke utelukkende) av HPV-infeksjon4,7. Denne kostnadseffektive testen har god følsomhet og en negativ prediktiv verdi og anbefales som et surrogat merke med høy risiko for HPV-infeksjon i oropharynx kreft (OPC) ved College of American patologer (CAP) og av Union for International Kreft Control (UICC)8.
Selv om dette papiret utelukkende fokuserer på påvisning av HPV i HNSCC, er HPV RNA CISH klinisk relevant i ulike andre forhold som involverer HPV-infeksjon. For eksempel kan denne teknikken forbedre nøyaktigheten av diagnosen lav kvalitet plateepitel intraepithelial lesjoner i livmorhalsen (LSIL, tidligere kjent som cervical intraepithelial neoplasi, Grade 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfeller9. Når det gjelder orofaryngeal SCC, HPV RNA CISH tillater identifisering av HPV-relaterte SCC, merket som skiller fra HPV-urelaterte orofaryngeal SCC i den siste åttende utgaven av TNM klassifisering av hode og nakke Cancer (av Union for International Cancer Kontroll [UICC])10. Siden HPV-relaterte SCC utstillinger en bedre prognose med lengre overlevelse og forbedret strålebehandling og kjemoterapi følsomhet enn HPV-urelaterte SCC11,12,13, påvisning av HPV-infeksjon kan påvirke pasientbehandling14,15. Dessuten kan HPV RNA CISH brukes for diagnostisering av HPV-relaterte multiphenotypic sinonasal kreft med et høyere signal enn HPV DNA CISH16. Flere multivariabel analyser tyder på at påvisning av E6 og E7 transkripsjoner er korrelert med en bedre prognose i orofaryngeal SCC totalt7,15,17,18 og i undergruppe av P16-positive orofaryngeal SCC19,20.
Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på FFPE lysbilder med et kit Hentet fra produsenten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infeksjon er en stor risikofaktor for en under type av orofaryngeal plateepitelkreft (OPSCC), som har en tendens til å være assosiert med et bedre utfall enn alkohol-og tobakk-relaterte OPSCC. Kromogen in situ hybridisering (CISH) av HPV viral RNA kunne tillate analyse evaluering av virale transkripsjoner av kreftfremkallende proteiner E6 og E7 og en in situ visualisering med en god romlig oppløsning. Denne teknikken tillater diagnostisering av en aktiv infeksjon med visualisering av HPV-transkripsjon i tumoral HPV-infiserte celler. En fordel med denne teknikken er å unngå forurensning fra nonneoplastic HPV-infiserte celler ved siden av svulsten. Samlet sett har god diagnose forestillinger det anses å være gullstandarden for aktiv HPV-infeksjon identifikasjon. Siden E6 og E7 viral protein interaksjon med celle proteiner pRb og p53 er obligatorisk for celle transformasjon, er HPV RNA CISH funksjonelt relevant og akutt reflekterer aktiv kreftfremkallende HPV-infeksjon. Denne teknikken er klinisk relevant i tillegg siden "lav" eller "høy" HPV transkripsjon nivåer bidratt til identifisering av to prognose grupper blant HPV-relaterte P16-positive hode og nakke kreftpasienter. Her presenterer vi protokollen for manuell HPV RNA CISH utført på formalin-faste parafin-embedded (FFPE) lysbilder med et kit Hentet fra produsenten. I stedet for kromogen åpenbaring kan RNA in situ-hybridisering også utføres med fluorescerende åpenbaringer (RNA FISH). Det kan også kombineres med konvensjonelle immunostaining.

Som beskrevet her, i hode og nakke plateepitelkreft, en sak kan betraktes som positive i nærvær av brune punctiform farging i cytoplasma eller i kjerner av tumorceller. I de fleste studier, er signalet betraktes som enten "positiv" eller "ikke oppdaget"14. Metoder for semiquantification av signalet er rapportert, men mangler standardisering mellom lag. For eksempel, i noen studier, ble signalene scoret som 1 + med 1 – 3 prikker per tumor celle, 2 + med 4 – 9 prikker per tumor celle, eller 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses å være en av gull standardene for aktiv Human papillomavirus infeksjon deteksjon innen svulster. Det gjør at visualisering av HPV E6-E7 mRNA uttrykk med lokalisering og analyse evaluering av sitt signal.

Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

HPV RNA CISH tillater påvisning av en aktiv human papillomavirusinfeksjon. Siden in-situ hybridisering rettet mot HPV RNA denne teknikken tillater visualisering av en aktiv transkripsjon av viruset. Den har presis romlig oppløsning og gode diagnoseforestillinger.Påvisning av HPV kan støtte diagnosen flere HPV-relaterte lesjoner, som orofaryngeal plateepitelkarsinom eller cervikal neoplasi. Det kan også ha innflytelse på prognosen. Etter klargjøring av buffere og motfarge reagenser, klargjør du en x målgjenfinningsreagens i et stort beger ved å tilsette 70 milliliter 10x målgjenfinningsreagens til 630 milliliter destillert vann.Plasser begeret på en varmeplate med magnetisk rører og dekk det med aluminiumsfolie. Kok innholdet ved 100 grader Celsius i 10 til 15 minutter, og pass på at du ikke koker det i mer enn 30 minutter. For å blokkere peroksidaseaktivitet på lysbilder med vevsseksjoner som tidligere ble deparaffinert og plassert i lysbildestativet, legg til fire til seks dråper, akkurat nok til å dekke prøven, av hydrogenperoksid til hvert lysbilde, og inkubere dem i 10 minutter ved romtemperatur.Vask lysbildene to ganger i to minutter i destillert vann ved romtemperatur. For å bryte RNA vevsgrenser i RNA vevseksjonene, fjern først aluminiumsfolien fra den kokende en x TRR ved hjelp av en klo, og slutt å røre. Senk skyvestativet langsomt og svært forsiktig.Dekk begeret igjen med aluminiumsfolie, og inkuber i 15 minutter. Bruk kloen til umiddelbart å overføre det varme glidestativet til et destillert vannbad og vask det i to minutter. Vask lysbildene deretter i frisk 100% etanol i to minutter, og la dem tørke ved romtemperatur i to minutter.Deretter bruker du en hydrofob barrierepenn til å tegne en barriere rundt hver prøve, og la den tørke ut i minst fem minutter. For protease fordøyelsen, plasser lysbildene i fuktighetskontrollert skuff, og legg til omtrent fire dråper Protease Plus per prøve. Dekk brettet med et lokk, og sett den inn i hybridiseringsovnen i 30 minutter ved 40 grader Celsius.Fjern skuffen fra ovnen, og fjern skyvestativet. Arbeide ett lysbilde om gangen, raskt fjerne overflødig væske, og plasser lysbildet i lysbildestativet nedsenket i en fargingsfat fylt med destillert vann. Vask lysbildene to ganger i to minutter i destillert vann ved romtemperatur med konstant agitasjon.For å starte hybridisering, trykk og knips lysbildene for å fjerne overflødig væske og plassere dem tilbake i lysbildestativet. Fjern den forhåndsoppvarmede HPV-sonden fra ovnen, og tilsett omtrent fire dråper for å dekke hver seksjon helt. Dekk brettet med lokket, og sett det inn i ovnen i to timer ved 40 grader Celsius.Når du har fullført inkubasjonen, fjerner du skuffen fra ovnen og fjerner skyvestativet. Ett lysbilde om gangen, fjern raskt overflødig væske, og plasser lysbildet i lysbildestativet nedsenket i en fargefat fylt med en x vaskebuffer, vask lysbildene i to minutter ved romtemperatur med konstant agitasjon, og gjenta med frisk en x vaskebuffer. Trykk og knips for å fjerne overflødig væske fra lysbildene, og plasser dem i lysbildestativet igjen.Tilsett omtrent fire dråper romtemperatur AMP1 per seksjon for å dekke hver seksjon helt. Dekk brettet med lokket, og sett det inn i ovnen i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Når du har tatt skuffen ut av ovnen, fjerner du skyvestativet.Arbeide ett lysbilde om gangen, raskt fjerne overflødig væske, og plasser lysbildet i lysbildestativet nedsenket i en fargingsfat fylt med en x vaskebuffer, vask i to minutter ved romtemperatur med konstant omrøring, og gjenta med frisk en x vaskebuffer. Dispenser det samme antall dråper av hver DAB-A- og DAB-B-løsning i et rør i riktig størrelse for å lage ca. 120 mikroliter DAB-substrat per seksjon, og virvel. Ta hvert lysbilde, ett om gangen, fra lysbildestativet, og trykk og knips for å fjerne overflødig væske, og plasser den tilbake i lysbildestativet.Pipette ca 120 mikroliter dab blanding på hvert vev seksjon, sørg for at seksjonene er dekket. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, og fortsett med motsehold. Plasser en dråpe monteringsmedium per glass slat, og plasser deretter lamellene på lysbildene og la dem lufttørke.Etter noen timer fortsetter du med evaluering ved hjelp av et optisk mikroskop som beskrevet i manuskriptet. Som beskrevet her i hode og nakke plateepitelkarsinom, definerte tilstedeværelse av brun punktlig farging i cytoplasma eller i kjernene av tumorceller et positivt tilfelle. Resultatene ble delt inn i to score, RNA CISH høy og lav score som observert med en 20x mål.RNA CISH score farging anses lav når observert i under 50% av tumorcellene og dekker mindre enn 80% av celleoverflaten. På den annen side er RNA CISH-poengsummen høy når den observeres i mer enn 50% av de fargede kreftcellene, eller med fargingsoverflaten som overstiger 80% i mer enn 30% av tumorcellene. Man bør aldri la lysbildene tørke ut for hybridisering.Ikke glem å forvarme sonden. For hvert utvalg, utfør positiv og negativ kontroll for å vurdere kvaliteten på RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy som en kirurgisk tilnærming til lokale stoffet levering indre ører voksne og Neonatal mus

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...