Name: chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis
Uploaded: 2019-06-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis at JoVE.com

Os autores agradecem ao departamento de patologia de Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel, e Gisèle legall); a plataforma de histologia do PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para edição de idioma; Alexandra Elbakyan por sua contribuição.

O protocolo segue as diretrizes éticas e foi aprovado pelo Comitê de ética (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).
1. preparação dos materiais
<ol><li>
Preparação do tampão de lavagem 1X
	<ol>
<li>Prepare 3 L de tampão de lavagem 1X adicionando 2,94 L de água destilada e um frasco (60 mL) de tampão de lavagem (50x) (veja a tabela de materiais) a um grande carboy. Misture bem. Nota: o tampão de lavagem 1X pode ser p...

<ol>
	<li>Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+HPV-associated+cancer+globally.">Reducing HPV-associated cancer globally.</a> Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).</li><li>Laban, S., Hoffmann, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Immunity+in+Oropharyngeal+Cancer:+Time+to+Change+the+Game?.">Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).</li><li>Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Papillomavirus+Testing+in+Head+and+Neck+Carcinomas:+Guideline+From+the+College+of+American+Pathologists.">Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).</li><li>Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+in+the+Diagnosis+of+Cervical+Low-grade+Squamous+Intraepithelial+Lesions+(LSIL).">HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL).</a> The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).</li><li>El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).</li><li>Ang, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Transcriptionally+Active+High-risk+HPV+in+Patients+With+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+as+Visualized+by+a+Novel+E6/E7+mRNA+In+Situ+Hybridization+Method.">Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+SOX10+expression+in+human+papillomavirus-related+multiphenotypic+sinonasal+carcinoma:+report+of+6+new+cases+validated+by+high-risk+human+papillomavirus+mRNA+in+situ+hybridization+test.">Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test.</a> Human Pathology. 82, 264-272 (2018).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Prognostic+Value+of+HPV16+E6+mRNA+Compared+With+In+Situ+Hybridization+for+Human+Oropharyngeal+Squamous+Carcinoma.">Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).</li><li>Kuo, K. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biomarkers+of+human+papillomavirus+infection+in+tonsillar+squamous+cell+carcinoma&#8212;molecular+basis+and+predicting+favorable+outcome.">The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma&#8212;molecular basis and predicting favorable outcome.</a> Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficacy+of+the+four+tests+(p16+immunochemistry,+PCR,+DNA+and+RNA+In+situ+Hybridization)+to+evaluate+a+Human+Papillomavirus+infection+in+head+and+neck+cancers:+a+cohort+of+348+French+squamous+cell+carcinomas.">Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas.</a> Human Pathology. , (2018).</li><li>Jung, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+relevance+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+(HPV)+infection+in+oropharynx+squamous+cell+carcinoma.">Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma.</a> International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).</li><li>Augustin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+RNA+CISH+score+identifies+two+prognostic+groups+in+a+p16+positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+population.">HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population.</a> Modern Pathology. , (2018).</li><li>Evans, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+E6/E7+RNA+In+Situ+Hybridization+Signal+Patterns+as+Biomarkers+of+Three-Tier+Cervical+Intraepithelial+Neoplasia+Grade.">HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade.</a> PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).</li><li>Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+HPV+infection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+practical+proposal.">Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal.</a> Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).</li><li>Bingham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope+in+situ+hybridization+confirms+mRNA+integrity+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+cancer+tissue+samples.">RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples.</a> Oncotarget. , (2017).</li></ol>

O RNA CISH de HPV executado com um jogo comprado é uma ferramenta poderosa para a deteção de transcritos virais e indica a infecção ativa de HPV. Executado manualmente, as etapas do protocolo são gerais fáceis de seguir, e o kit comprado é conveniente. Esta técnica permite a coloração de 19 amostras histológicas mais uma corrediça do controle de uma vez, e o ensaio dura ao redor 8 h. É crítico não deixar as amostras secar entre as etapas a menos que mencionado de outra maneira. A condição do pré-tratam...

O RNA cish de HPV é uma ferramenta poderosa para a deteção da infecção ativa de HPV, que pode provar crucial em lesões benignas ou malignos em vários locais tais como o orofaringe ou o colo uterino. A detecção de uma infecção ativa por HPV pode apoiar o diagnóstico de uma lesão induzida pelo HPV e, assim, influenciar seu tratamento e prognóstico.
O HPV é a infecção sexualmente transmissível mais frequente, e mais de 100 genótipos virais foram descritos1. De forma esquemática, genótipos de baixo risco, como os genótipos 6 e 11, são conhecidos por induzir verrugas genitais, papilomatose respiratória recorrente e outras lesões benignas, enquanto genótipos de alto risco, como genótipos 16 e também 18, são responsáveis pela maioria dos cânceres cervicais e cânceres Anais e desempenham um papel na oncogênese da HNSCC em proporções variáveis como contabilizadas por dados epidemiológicos regionais2.
Várias ferramentas estão disponíveis para a detecção de infecção por HPV. Como uma infecção por HPV de alto risco leva à expressão de proteínas oncogênicas virais E6 e E73, a detecção de transcritos E6 e E7 é amplamente vista como o padrão-ouro para a identificação ativa da infecção pelo HPV4. O RNA CISH de HPV pode ser executado em amostras de FFPE que são obtidas completamente facilmente dos pacientes que sofrem de várias doenças HPV-relacionadas. Seu desempenho tem sido avaliado em neoplasia intraepitelial escamosa no colo do útero, no ânus e na vagina, e no carcinoma epidermóide invasivo no colo do útero, no ânus e no trato aerodigestivo superior5: atinge uma sensibilidade de mais de 98% entre os casos positivos da reacção em cadeia do polymerase do ADN de HPV (PCR). Isto é ligeiramente melhor do que a imunomarcação P16 (93%) e a hibridação in situ do ADN de HPV (ADN ISH: 97%), que são mais de uso geral. Em outra coorte de 57 pacientes com carcinoma epidermóide (CEC) decorrente da região da cabeça e pescoço, da região genital, da pele e do trato urinário, comparado ao DNA do HPV, o ARN do HPV CISH obteve melhor sensibilidade (100% versus 88%) e especificidade (87% versus 74%)6.
A imunocoloração P16 é um marcador indireto refletindo o rompimento do ciclo celular que pode ser causado (mas não exclusivamente) pela infecção pelo HPV4,7. Este teste rentável possui boa sensibilidade e um valor preditivo negativo e é recomendado como um marcador substituto de infecção por HPV de alto risco no câncer de orofaringe (OPC) pelo Colégio de patologistas americanos (PAC) e pela União para o internacional Controle do câncer (UICC)8.
Embora este papel focalize unicamente na deteção do HPV em HNSCC, o RNA CISH de HPV é clinicamente relevante em várias outras circunstâncias que envolvem a infecção de HPV. Por exemplo, essa técnica pode melhorar a acurácia do diagnóstico de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau do colo do útero (LSIL, anteriormente conhecida como neoplasia intraepitelial cervical, grau 1 [NIC1]) para casos morfologicamente ambíguos9. Em relação ao CEC orofaríngeo, o ARN do HPV CISH permite a identificação do CEC relacionado ao HPV, rotulado como distinto do SCC orofaríngeo não relacionado ao HPV na recente oitava edição da classificação TNM do câncer de cabeça e pescoço (da União para câncer internacional Controle [UICC])10. Desde que o SCC HPV-relacionado apresenta um prognóstico melhor com sobrevivência mais longa e sensibilidade aumentada da radioterapia e da quimioterapia do que o SCC-não relacionado HPV11,12,13, a deteção da infecção de HPV pode impactar gerência paciente14,15. Adicionalmente, o RNA CISH de HPV pode ser usado para o diagnóstico da carcinoma sinonasal multiphenotypic HPV-relacionada com um sinal mais elevado do que o ADN CISH16de HPV. Várias análises multivariadas sugerem que a detecção de transcritos E6 e E7 está correlacionada com um melhor prognóstico em CEC orofaríngea global7,15,17,18 e no subgrupo de SCC orofaríngea P16-positivo19,20.
Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças de FFPE com um jogo obtido do fabricante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution, Gill No. 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>GHS132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ Oven (110v)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>321710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ slide rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>300104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322310</td>
			<td>This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Negative Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320871</td>
			<td>DAPB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 3-Plex Positive Control Probe</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>320861</td>
			<td>PPIB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope H202 &#38; Protease Plus Reagent</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322330</td>
			<td>Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Probe- HPV16/18</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>311121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>322000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics Inc.</td>
			<td>310091</td>
			<td>Wash Buffer 50X x4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromogenic in situ hybridization as a tool for hpv-related head and neck cancer diagnosis

A infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um fator de risco importante para um subtipo de carcinoma epidermóide orofaríngeo (OPSCC), que tende a estar associado a um melhor desfecho do que o OPSCC relacionado ao álcool e ao tabaco. A hibridação in situ chromogenic (cish) do RNA viral de HPV poderia permitir a avaliação semiquantitativa de transcritos virais das proteínas oncogênico E6 e E7 e de um visualização in situ com uma boa definição espacial. Essa técnica permite o diagnóstico de uma infecção ativa com a visualização da transcrição do HPV nas células tumorais infectadas pelo HPV. Uma vantagem desta técnica é a vacância da contaminação das pilhas HPV-infectadas nonneoplastic adjacentes ao tumor. Globalmente, seus desempenhos bons do diagnóstico têm-no considerado ser o padrão do ouro para a identificação ativa da infecção de HPV. Desde que a interação viral da proteína E6 e E7 com proteínas da pilha PRB e p53 é obrigatória para a transformação da pilha, o RNA cish de HPV é funcional relevante e reflete agudamente a infecção oncogênico ativa de HPV. Esta técnica é clinicamente relevante, bem como os níveis de transcrição do HPV "baixo" ou "alto" ajudaram na identificação de dois grupos de prognóstico entre os pacientes com câncer de cabeça e pescoço P16-positivos relacionados ao HPV. Aqui nós apresentamos o protocolo para o RNA manual CISH do HPV executado em corrediças parafina-encaixadas formalin-fixadas (FFPE) com um jogo obtido do fabricante. Em vez de revelação cromogênica, a hibridação in situ de RNA também pode ser realizada com revelação fluorescente (RNA FISH). Também pode ser combinada com imunocoloração convencional.

Como descrito aqui, no cancro de pilha Squamous da cabeça e da garganta, um caso pode ser considerado positivo na presença de mancha punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos de pilhas do tumor. Na maioria dos estudos, o sinal é considerado como "positivo" ou "não detectado"14. Métodos de semiquantificação do sinal foram relatados, mas falta de padronização entre as equipes. Por exemplo, em alguns estudos, os sinais foram marcados como 1 + com 1 – 3 pontos por célula tumoral, 2 ...

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Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

A hibridação in situ cromogênico do RNA do papilomavírus humano (HPV) é considerada ser um dos padrões do ouro para a deteção humana ativa da infecção do papilomavírus dentro dos tumores. Permite a visualização da expressão de mRNA de HPV E6-E7 com localização e avaliação semiquantitativa de seu sinal.

Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

O HPV RNA CISH permite a detecção de uma infecção ativa do vírus do papiloma humano. Uma vez que a hibridização in situ tem como alvo o HPV RNA esta técnica permite a visualização de uma transcrição ativa do vírus. Tem resolução espacial precisa e bom desempenho de diagnóstico.A detecção do HPV pode apoiar o diagnóstico de várias lesões relacionadas ao HPV, como carcinoma de células escamosas orofaríngeas ou neoplasia cervical. Também pode ter uma influência no prognóstico. Depois de preparar buffers e reagentes de contra-coloração, prepare um reagente de recuperação de alvo x em um grande béquer adicionando 70 mililitros de reagente de recuperação de alvo de 10x a 630 mililitros de água destilada.Coloque o béquer em uma placa de aquecimento com agitador magnético e cubra-o com papel alumínio. Ferva seu conteúdo a 100 graus Celsius por 10 a 15 minutos, certificando-se de não fervê-lo por mais de 30 minutos. Para bloquear a atividade peroxidase em lâminas com seções de tecido previamente desparafinadas e colocadas no rack de slides, adicione quatro a seis gotas, apenas o suficiente para cobrir a amostra, de peróxido de hidrogênio em cada slide, e incuba-los por 10 minutos à temperatura ambiente.Lave os slides duas vezes por dois minutos em água destilada à temperatura ambiente. Para quebrar os limites do tecido RNA nas seções de tecido RNA, primeiro remova a folha de alumínio do 1 x TRR fervente usando uma garra e pare de mexer. Mergulhe o rack de slides lentamente e com muito cuidado.Cubra o béquer novamente com a folha de alumínio e incubar por 15 minutos. Use a garra para transferir imediatamente o rack de lâmina quente para um banho de água destilado e lave-o por dois minutos. Lave os slides em 100% de etanol fresco por dois minutos, e deixe-os secar em temperatura ambiente por dois minutos.Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira em torno de cada amostra, e deixe-a secar por pelo menos cinco minutos. Para digestão protease, coloque os slides na bandeja controlada pela umidade e adicione aproximadamente quatro gotas de Protease Plus por amostra. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno de hibridização por 30 minutos a 40 graus Celsius.Retire a bandeja do forno e remova o rack de slides. Trabalhando um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração cheio de água destilada. Lave os slides duas vezes por dois minutos em água destilada à temperatura ambiente com agitação constante.Para iniciar a hibridização, toque e aperte os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os de volta no rack de slides. Remova a sonda HPV pré-aquecida do forno e adicione aproximadamente quatro gotas para cobrir completamente cada seção. Cubra a bandeja com a tampa e insira-a no forno por duas horas a 40 graus Celsius.Após completar a incubação, retire a bandeja do forno e remova o rack de slides. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com um tampão de lavagem x, lavando os slides por dois minutos em temperatura ambiente com agitação constante, e repita com um tampão de lavagem x fresco. Toque e filme para remover qualquer excesso de líquido dos slides e coloque-os novamente no rack de slides.Adicione aproximadamente quatro gotas de temperatura ambiente AMP1 por seção para cobrir inteiramente cada seção. Cubra a bandeja com a tampa e insira-a no forno por 30 minutos a 40 graus Celsius. Depois de remover a bandeja do forno, remova o rack de slides.Trabalhando um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com um tampão de lavagem x, lavando por dois minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com um tampão de lavagem x fresco. Dispense o mesmo número de gotas de cada solução DAB-A e DAB-B em um tubo de tamanho apropriado para fazer aproximadamente 120 microliters de substrato DAB por seção e vórtice. Pegue cada slide, um de cada vez, do rack de slides, toque e bata para remover o excesso de líquido e coloque-o de volta no rack de slides.Pipeta aproximadamente 120 microliters de mistura DAB em cada seção de tecido, certificando-se de que as seções estão cobertas. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, e proceder com contra-retenção. Coloque uma gota de meio de montagem por ripa de vidro e, em seguida, coloque as ripas nos slides e deixe-as secas ao ar.Após algumas horas, prossiga com a avaliação usando um microscópio óptico como descrito no manuscrito. Como descrito aqui no carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, a presença de coloração de punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos das células tumorais definiu um caso positivo. Os resultados foram divididos em dois escores, RNA CISH alto e baixo escore observado com um objetivo de 20x.A coloração do escore RNA CISH é considerada baixa quando observada em menos de 50% das células tumorais e cobre menos de 80% da superfície celular. Por outro lado, o escore de RNA CISH é alto quando observado em mais de 50% das células cancerígenas manchadas, ou com a superfície de coloração superior a 80% em mais de 30% das células tumorais. Nunca se deve deixar os slides secarem para hibridização.Não se esqueça de pré-aqueça a sonda. Para cada amostra, realize um controle positivo e negativo para avaliar a qualidade do RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genética

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...